Abstract
A degradação das proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é um importante mecanismo de regulação para a homeostase da proteína em todos os eucariotas. A abordagem padrão para determinar a degradação da proteína intracelular se baseia em ensaios bioquímicos para seguir a cinética de declínio proteína. Tais métodos são frequentemente trabalhoso e demorado e, portanto, não passível de experiências destinadas a avaliar múltiplos substratos e as condições de degradação. Como alternativa, ensaios baseados em células de crescimento têm sido desenvolvidos, que são, no seu formato convencional, ensaios de ponto final, que não é possível determinar quantitativamente as mudanças relativas nos níveis de proteína.
Aqui, descrevemos um método que determina fielmente as alterações nas taxas de degradação de proteínas por acoplamento los a uma cinética de crescimento de levedura célula. O método é baseado em um sistema de seleção estabelecido em uracila Auxotrofia de URA3 -deleted células de levedura é resgatado por uma proteína repórter exogenamente expressa, Composta de uma fusão entre o gene URA3 essencial e determinante degradação (degron). A proteína repórter é concebido de modo a que a sua taxa de síntese é constante enquanto que a sua taxa de degradação é determinada pela degron. Como o crescimento celular em meio deficiente em uracilo-é proporcional aos níveis relativos de Ura3, cinética de crescimento são inteiramente dependentes da degradação da proteína repórter.
Este método mede com precisão mudanças na cinética de degradação de proteínas intracelulares. Aplicou-se a: (a) Avaliação da contribuição relativa dos factores de conjugação de ubiquitina conhecidos à proteólise (b) E2 enzima de conjugação de estrutura-função de análises (c) Identificação e caracterização de novos degrons. A aplicação do sistema baseado URA3 degron- transcende o campo de degradação de proteínas, como pode também ser adaptada para a monitorização das alterações dos níveis de proteína associados com as funções de outras vias celulares.
Introduction
O sistema de degradação da ubiquitina-proteassoma é um importante regulador da máquina, que tem sido implicado na manutenção da homeostase da proteína em todos os eucariotas. A UPS inicialmente conjuga múltiplas moléculas de ubiquitina a uma proteína-alvo, após o que a proteína poli-ubiquitina-marcado é degradado pelo proteassoma 26S. Na maioria dos casos, o passo limitante da velocidade para a degradação mediada por ubiquitina é ubiquitinação substrato, mediada por E2 e E3 conjugar enzimas ligando enzimas (ligases E3) 1. Por conseguinte, a estabilidade intracelular de proteínas específicas reflecte a sua susceptibilidade a ubiquitina-conjugação e a actividade das suas enzimas cognatas ubiquitinação.
E3 ligases são os componentes de reconhecimento de substrato principais da UPS. Como tal, estas enzimas reconhecem degrons dentro de seus substratos que estão ausentes ou não expostos em suas contrapartes estáveis 2. Por exemplo, muitos reguladores do ciclo celular must ser sintetizado e degradado de uma forma temporal específica, a fim de manter a progressão do ciclo celular em ordem. A degradação destas proteínas é muitas vezes controlada pela fosforilação, mediadas por quinases de sinalização celulares regulados 3,4. Por outro lado, as proteínas anormalmente dobradas são reconhecidos através degrons enigmáticas. Estas são as regiões que normalmente são escondidos na estrutura nativa e estão expostos em cima estrutura perturbação. Tais degrons incluem domínios hidrófobos e segmentos de 5-7 intrinsecamente desordenados 8.
Desde a descoberta seminal do sistema ubiquitina-proteína para degradação e a caracterização dos seus fundamentos em lisados de reticulócitos de 9, genética de leveduras foi instrumental na descoberta de muitos dos componentes do sistema ubiquitina 10. O sucesso da levedura como organismo modelo para a análise sistemática da degradação das proteínas pelo UPS é principalmente devido ao fato de que o UPS é altaly conservada em todos os eucariontes 4, juntamente com a sua receptividade como um sistema experimental. De facto, os sistemas à base de levedura são vulgarmente utilizados para decifrar os mecanismos de acção da máquina ubiquitinação.
Estudando a degradação da proteína por meios bioquímicos normalmente requer uma preparação de extractos celulares. Enquanto proteínas da célula animal pode ser extraída sob condições relativamente suaves que preservem as interacções e função de proteínas, a presença de uma parede celular de levedura 11 robusto no requer consideravelmente mais severas condições de perturbação, que podem afectar a recuperação de proteína. De fato, diferentes procedimentos de levedura rompimento celular variam consideravelmente em sua capacidade para recuperar proteínas intactas em quantidades que representem corretamente a sua abundância relativa celular. Além disso imprecisão é inerente aos diferentes métodos empregados para a determinação das taxas de degradação de proteínas específicas: experimentos metabólicos à base de rotulagem 'pulse-chase' seguido de immunoprecipitation, para isolar proteínas específicas 12, muitas vezes não é estritamente quantitativa. Assim, quando a degradação da proteína é comparada por este método, cuidado extra deve ser tomado na interpretação dos resultados. Para contornar este inconveniente, um ensaio perseguição cicloheximida alternativa (CHX) podem ser empregados 12. Neste ensaio, o inibidor da tradução é adicionado a culturas de células e alterações temporais nos níveis em estado estacionário da proteína são subsequentemente monitorizados. No entanto, o uso de CHX está limitado às proteínas com semi-vidas relativamente curtas (<90 min), como a inibição de longa duração da síntese de proteínas é citotóxica. Notavelmente, ambos os ensaios mencionados acima requerem a utilização de anticorpos específicos para a proteína, o que nem sempre estão disponíveis.
Para superar estas limitações técnicas, os investigadores têm desenvolvido vários métodos que não requerem a extracção de células e proteínas manuseamento directo. Uma abordagem baseia-se no estabelecimento de sim auxotróficoestirpes st, obtidos por deleção dos genes que codificam enzimas metabólicas essenciais. Tais genes incluem HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, que codifica para as enzimas necessárias para a biosíntese de aminoácidos, bem como URA3 que codifica OMP-descarboxilase (Ura3), uma enzima essencial da pirimidina ribonucleótido biossíntese. Ura3 tem sido amplamente utilizado em estudos de degradação de proteínas. Nestes ensaios, a expressão constitutiva de Ura3 resgata o crescimento de células ura3 em meio deficiente em uracilo-13. Consequentemente, desestabilizando Ura3 através da fusão de um degron pode diminuir o crescimento das células em meio mínimo sem uracilo. Este método tem sido utilizado em vários estudos de degradação de proteínas, incluindo a identificação dos determinantes da degradação 5, 14 e ligases E3 ubiquitinação auxiliar factores 15 e a descoberta de novos UPS degrons 16. Todos estes métodos empregues crescimento celular em placas de agar como o ensaio de leitura. No entanto, tele critério de crescimento (crescimento positivo / negativo), enquanto robusto e eficiente, é principalmente qualitativa e não fornece informação quantitativa que é importante para avaliar a potência de um degron ou a contribuição relativa dos diversos fatores de degradação auxiliares.
Temos, portanto, desenvolvidos e utilizados vetores de levedura e métodos de rastreio que permite uma análise sistemática e quantitativa da degradação de proteínas pela URA3 -degron sistema de fusão. O protocolo baseia-se em um ensaio de manusear fácil que mede a cinética do crescimento na cultura líquido sob condições selectivas (gils) e na geração de curvas de crescimento padrão. Cinética de crescimento de levedura são caracterizados por três fases principais - o atraso, o exponencial (log) e da fase estacionária. Cálculo da cinética de replicação de levedura durante a fase log em condições selectivas, que é determinada pelos níveis de expressão do Ura3-degron, fornece uma medição imparcial o quantitativof degradação da proteína. Este método pode ser aplicado para medir e comparar as taxas de degradação de vários substratos UPS simultaneamente em múltiplas linhagens e sob várias condições.
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Protocol
1. Cultura celular
- Transformar as células de levedura auxotróficos, adequados, tais como Try467 (Tabela 2), com um plasmídeo contendo (a) um URA3 -degron de fusão e (b) um marcador de selecção adicional para metabólica plasmídeo e manutenção.
NOTA: Um exemplo de um plasmídeo adequado é YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Este é um plasmídeo integrativo de levedura contendo uma proteína de fusão que compreende de Deg1 - degron um derivado da transcrição de levedura. factor de mat2 17, epitopo FLAG - para a detecção por imunotransferência, Vma12 - uma proteína ER estável, e Ura3 15,18 (Figura 3A). (Ver Tabela 3 para os plasmídeos usados neste estudo e para exemplos adicionais de plasmídeos apropriados.) - Para a selecção da manutenção do plasmídeo e, manter as células em placas de agar sintético adequado sob uma Definido (SD) meio sem marcadores de selecção amino ácidos
- Cultivar células S / N a 30 ° C num meio SD selectivo adequado para manutenção do plasmídeo, até uma fase estacionária é alcançada. Cresça as células em tubos de ensaio ou em uma placa de 96 cavidades, dependendo do número de amostras a serem examinadas (ponto 2).
2. Preparação de células para análise
- Quando um pequeno número de amostras (N≤15) está a ser ensaiada, diluir as células e substituir o meio como se segue:
- Dilui-se 50 ul de células a partir de uma cultura D / N com 150 ul de meio SD por poço numa placa de 96 poços (fundo claro). Note-se, a primeira amostra é designado como branco contém apenas médio.
- Determinar os valores de OD 600 amostras na placa de 96 poços utilizando um leitor de microplacas.
- Calcula-se a OD efectiva 600 em cada poço pela multiplicação da leitura de OD 600 pelo factor de diluição (x4), a partir which o valor da leitura do branco é subtraído. Normalizar os valores resultantes dividindo por 0,55 para obter um caminho de comprimento calculado de 1 cm de acordo com a lei de Beer-Lambert. Note-se, este valor é constante quando se mede o OD 600 de 200 ul de células em uma placa de 96 poços padrão.
- Calcule o volume exato necessário para a obtenção de células de levedura em montante equivalente a DO600 de 0,25 e transferir para um tubo Eppendorf.
- Girar as células a alta velocidade (12.000 xg) durante 1 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio selectivo apropriado (ver secção 3.1) para se obter DO600 de 0,25.
- Transferir 200 uL das estirpes diluídos para um novo poço de uma placa de 96 poços.
- Quando um grande número de amostras (N> 15) estão a ser testados, diluir as células e substituir o meio, sem medição OD 600 anterior, como segue:
- Transferir 10 ml de células estacionáriascrescida O / N em uma placa de 96 poços para uma nova placa de 96 poços contendo 190 ul (diluição de 1:20) dos meios selectivos apropriados (ver secção 3.1).
3. cinética de crescimento em cultura líquida em condições selectivas (Gils)
- Use os seguintes meios para medições de crescimento utilizando o repórter Ura3-degron:
- Para controles positivos de crescimento da levedura em condições não restritivas, o uso plasmídeo mídia SD seletiva (ver secção 1.2). Se nenhuma selecção plasmídeo é necessária, por exemplo, quando se usa um plasmídeo integrativo, tal como Deg1 -UV, meio SD contendo todos os aminoácidos necessários (SD completa) pode ser utilizado.
- Para amostras experimentais de medição de crescimento sob condições restritivas, use meio SD-URA.
- Definir um leitor de microplacas multimodo para:. Uma temperatura de incubação de 30 ° C, OD 600 intervalos de medição de 15 minutos, e um ciclos orbitais e lineares de agitação de 1 min a cada sete minutos <br /> NOTA: Esta-dual mode tremor foi otimizada para obter uma distribuição homogênea de células; no entanto, outros modos de agitação ou mesmo nenhuma agitação pode funcionar tão bem.
- Incubar as células a 30 ° C num leitor de microplacas O / N ou até que as células tenham atingido a fase estacionária (12-24 h).
- Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha.
- Determinar a cinética de crescimento de leveduras utilizando MDTcalc, um programa de software personalizado que calcula o tempo mínimo (em horas) para as células para dobrar seu tamanho populacional (Minimal tempo de duplicação (MDT); para mais detalhes ver seção 4).
4. O cálculo do tempo de duplicação Minimal (MDT): Princípios do Algoritmo MDTcalc
NOTA: Princípios do algoritmo MDTcalc, utilizando uma amostra representativa de células de levedura Try467 (Tabela 2) cultivadas em meio completo SD, são ilustrados na Tabela 1 e na Figura 1, que mostra uma folha de cálculo e dados de crescimento parcelas, respecpectivamente.
- Subtrair OD 600 valores em branco, obtido no respectivo poço, a partir de cada uma das leituras obtidas no poço da amostra. Separe as diferenças resultantes de 0,55 (por placas de 96 poços) para corrigir o comprimento do percurso da luz. Traça-se os valores finais (Tabela 1, Trans.) Contra o tempo para produzir a curva de crescimento de levedura real (OD 600 / hr) (Figura 1A).
- Calcular o log 2 (OD 600) para cada um dos valores transformados para converter a fase logarítmica de crescimento em uma curva linear (Figura 1B).
- Calcular o declive de um intervalo de 10 pontos temporais (N = 10) começando no tempo 0 e movendo um ponto de tempo de cada vez até N <10 (Tabela 1, Pista; Figura 1C).
- Calcula-se o valor inverso de cada inclinação para obter o tempo necessário para a população de células para dobrar (Tabela 1, 1 / Declive; Figura 1C). Calcula-se o mínimo1 / valor Slope para determinar o MDT (Tabela 1, retângulo preto; Figura 1C). Extrai-se a MDT calculada para células na amostra (Tabela 1, 1 / Slope, rectângulo preto) a partir do intervalo de tempo seleccionado (Tabela 1, delineada pelo rectângulo vermelho, as Figuras 1B, 1D).
NOTA: A taxa de crescimento celular em meio SD-URA é inversamente proporcional ao MDT.
5. Usando MDTcalc
- Copie os arquivos de programas suplementados em uma pasta designada no computador.
- Verifique se o arquivo de planilha que contém os dados de crescimento é salvo e fechado. Abra o programa de aplicação MDTcalc para ver o início da tela aparece.
- Insira as informações necessárias, como demonstrado na Figura 2:
- Em 'Caminho do arquivo ", clique no retângulo à direita para localizar o arquivo de planilha.
- Em 'Nome de folha ", escrever o nome da planilha onde tele dados brutos está localizado.
- Em "Posição inicial", insira coordenar a planilha de tempo 0 da primeira amostra.
- Em 'coluna Time', insira a letra que define a localização da coluna ponto de tempo (tempo deve ser fornecido em segundos).
- Sob 'coluna em branco ", inserir a carta que define a localização da coluna em branco (geralmente, mas não necessariamente no poço A1 da placa de 96 poços).
- Em 'valor OD', escolha o valor mínimo transformado OD 600 necessário para o início do cálculo MDT (geralmente ,15-0,25). A definição deste valor impede cálculos de MDT para as culturas em fase de latência, devido à diluição excessiva para que MDT é calculado apenas para as amostras que chegam ao valor DO600 definido ou superior.
- Uma vez que o último valor foi inserido, pressione o botão "calcular" na parte inferior da tela. Certifique-se de que a barra de progresso na direita muda gradualmente para green. Não abra o arquivo de planilha durante o processo de cálculo.
- Exportar os dois conjuntos de dados que aparecem automaticamente na tela após a conclusão do cálculo MDT em uma planilha. Certifique-se de que os dados incluem: (a) o valor MDT para cada bem que passa o teste do valor OD mínimo (como definido na seção 5.2.1.6) e (b) o ponto do intervalo a partir do qual o MDT foi calculado o tempo inicial (Iniciar tempo).
- Insira as informações necessárias, como demonstrado na Figura 2:
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Representative Results
Investigar o papel das enzimas da via Doa10 na degradação de um substrato de repórter
Para testar a validade do método gils que foi comparado com um ensaio de degradação de tradicional. Esta experiência avalia a contribuição relativa dos componentes da membrana localizada ER-Doa10-ligase E3 complexo de 20,21 para a degradação do substrato de proteína repórter de controlo de qualidade Deg1- VU (Figura 3A). O plasmídeo Deg1- VU foi integrado nas células do tipo selvagem ou em células sem o gene para a enzima de conjugação de E2, UBC7 (ubc7) e, subsequentemente, a estabilidade da proteína foi determinada por um ensaio CHX perseguição 6. Imunotransferência anti-FLAG revelaram uma banda de proteína Deg1 -VU estável em células ubc7 que estava ausente em células do tipo selvagem (Figura 3B). A ausência de Deg1 -VU em células do tipo selvagem é attributed para sua degradação contínua, que foi abolida em células ubc7, indicando que a estabilidade Deg1 -VU é fortemente dependente Ubc7.
Obviamente, a degradação de Deg1- VU é rápida. No entanto, a taxa relativa de degradação não pode ser determinada por um ensaio CHX vez que a proteína não é detectável em células do tipo selvagem, desde o início. Por conseguinte, o método de doseamento gils recentemente desenvolvido foi utilizado, a fim de comparar as diferenças relativas nas cinética de degradação da proteína entre o tipo selvagem e de várias estirpes mutantes (Figura 3C). Inicialmente, tipo, ubc6, ubc7 ou doa10 células selvagens expressando Deg1 -VU foram cultivadas em meio completo SD. Para medir gils, as células foram lavadas e incubadas em SD-URA. Cálculo MDT foi executado como exemplificado no protocolo. Figuras 3C, 3D mostram as curvas de crescimento similares e MDT calculado (~ 2,5 horas) para todas as cepas cultivadas em SD completa, excluding a possibilidade de que a supressão de qualquer um dos genes analisados afecta o crescimento celular. Em contraste, a incubação em SD-URA resultaram em baixos níveis de crescimento de células do tipo selvagem (MDT = 6,34), ao passo que apenas um defeito de crescimento menor foi observado nas estirpes mutantes (MDT) ~ 3 hr.
Examinar o efeito de diferentes mutantes da enzima E2 conjugar Ubc7 sobre a degradação da Deg1- VU
O facto de Ubc7 é absolutamente necessária para a degradação Deg1- VU permite uma avaliação precisa do mesmo efeitos parciais de vários mutantes de E2, uma vez que o intervalo experimental do sistema é muito vasta. Assim, plasmídeos contendo tipo selvagem ou mutante UBC7 foram integrados em células que expressam Ubc7 Deg1 -VU ea sua contribuição para a degradação foi determinada por Gils. Como esperado, a cinética de crescimento rápido foram observadas em células que expressam Ubc7 com a mu do sítio activotants C89S e N81A 22 (Figura 4). Além disso, dois mutantes previsto para impedir a degradação indirectamente Deg1 -VU (V25G e H94K) foram testados. Essas mutações também aumentou o crescimento de células, em comparação ao tipo selvagem Ubc7, ainda que em menor grau do que os mutantes do local activo (MDTS média de 3,4 horas por V25G e H94K comparação com MDTS média de 2,7 horas para C89S e N81K) (Figura 4 ). Assim, o método gils pode ser utilizado para a medição precisa da contribuição relativa de vários factores de degradação para a estabilidade de um substrato de repórter.
O isolamento e a avaliação de novos degrons
O sistema gils também foi empregue num formato de ecrã de alto rendimento para identificar novos degrons e quantificar a sua potência relativa, isto é, o grau pelo qual eles induzem degradação (Figura 5). Para otimizar a identificação de degrons de boa fé, um adicionalpasso de selecção, que é o crescimento na presença de ácido fluoroor�ico (5-FOA), foi adicionado. Ura3 converte eficientemente 5-FOA em um composto tóxico (5-fluorouracil) que pode servir como uma selecção positiva para o isolamento de estirpes de leveduras em que Ura3 é desestabilizada 16,23. Para identificar novos degrons, uma biblioteca de plasmídeos repórter foi gerada por fusão de fragmentos aleatórios derivados a partir de uma biblioteca de cDNA de levedura para Ura3-GFP plasmídeo 24 (Figura 5A). A porção de GFP foi adicionado a fim de permitir uma tela secundária e fornecer informações sobre a localização da degron fusão (ver discussão). A biblioteca foi transformada em levedura, em seguida, seleccionadas na presença de 5-FOA (Figura 5B) e os clones positivos foram isolados e re-semeadas em placas de agar em um formato de placa de 96 poços. Cada colónia foi transferido para placa de 96 poços, incubadas O / N, e dilui-se numa nova placa de 96 poços como descrito na secção 2.2. Espera-se que o crescimento de células em meio SD-URAirá correlacionar-se com o grau de expressão Ura3, que é o resultado da potência do degron para induzir a degradação. Este foi posteriormente confirmada pela aplicação Gils (Figura 5C). Nós confirmamos que todas as colônias tomados ao acaso que foram pré-selecionados com 5-FOA apresentaram valores semelhantes MDT, em meio SD-LEU (Figura 5C, bares vazios). Em contraste, todos os clones mostraram taxas de crescimento variáveis sobre SD-URA, que eram significativamente mais lento do que as células que expressam o controlo Ura3-GFP (dados não mostrados). Tal como indicado, existe uma relação inversa entre a taxa de crescimento em SD-URA e MDT. Assim, quanto maior for o MDT, quanto mais potente é o degron. Com efeito, todos os MDTS derivados de clones seleccionados positivamente foram maiores do que a do controlo (acima da linha vermelha) (Figura 5C, barras a cheio).
<strong> Tabela 1. Ilustração do cálculo de unidades de fermento MDT. Tempo são horas (h). Em branco e da amostra são de OD 600 lê. Transformation (Trans.) é o valor OD 600 após subtracção do branco e correção caminho de comprimento. Log 2 é calculado a partir dos dados transformados. Declive é o log 2 (OD 600) valores dentro de intervalos consecutivos de 10 pontos de tempo dividido pelo tempo. 1 / Declive é o tempo necessário para a população de células para se duplicar. rectângulo preto marca a MDT valor. rectângulo vermelho marca o intervalo de tempo a partir do qual foi calculada a MDT.
| Levedura | Genótipo | Fonte |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 | Euroscarf |
| Teste508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Este estudo |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Este estudo |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Este estudo |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Este estudo |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Este estudo |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Este estudo |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Este estudo |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Este estudo |
Tabela 2. Lista de cepas de leveduras utilizadas neste estudo.
| Os plasmídeos usados neste estudo | ||
| Plasmídeo | Marcadores relevantes | Fonte |
| pTR717 | YDpK-MET25p-Deg1-Flag-Vma12-Ura3 (integrativa plasmídeo contendo LYS1) | Este estudo |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Este estudo |
| Plasmídeos repórter adequados adicionais | ||
| Plasmídeo | Marcadores relevantes | Fonte |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis e Pelham |
Tabela 3. Lista de plasmídeos utilizados neste estudo de referência:.. Lewis, MJ & Pelham, HR ineficiente controle de qualidade de proteínas termossensíveis na membrana plasmática PLoS One 4, e5038, doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Figura 1. Princípios de cálculo do MDT. Células de levedura Try467 na DO600 de 0,22, foram incubadas em meio completo SD para o período de tempo indicado. OD 600 medidas foram tomadas todas as ~ 15 min e os dados foram coletados em uma planilha. (A) transformadas valores de DO 600 do Quadro 1 em função do tempo. (B)Log 2 de OD 600 em função do tempo Linha vermelha:. Marca o intervalo de tempo a partir do qual o MDT foi calculado (D). Taxa de crescimento (C) Levedura (declive) foi calculado medindo as alterações em OD 600 de 10 pontos de tempo consecutivos (linearidade assumindo) ao longo do tempo Tempo inicial:. O tempo de cálculo a partir do qual se iniciou. (D) O tempo requerido para a levedura de dobrar é o inverso da inclinação a partir de (C) (1 / Declive) MDT:. O tempo de duplicação mínima calculada (em horas).
Figura 2. MDTcalc tela inicial: Protocolo secção 5.1. Os valores de entrada típicos devem ser inscritas são mostrados.
Figura 4. Medição de taxas de degradação relativas de Deg1 -VU em Ubc7 cepas mutantes esquerda:. Plot das transformadas OD 600 valores, medidos durante a replicação do w-tipo DIP, ubc7 Δ e os mutantes Ubc7 indicados, em função do tempo. As células que expressam Deg1 -VU foram cultivadas em meio SD-URA e DO600 foi medida a cada ~ 15 min. Direita: O MDT para cada cepa foi calculado usando MDTcalc.
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Figura 5. Um ensaio de elevado rendimento para a identificação e isolamento de novos degrons. (A) Representação esquemática das características do repórter Ura3-GFP-cDNA. (B) Um fluxograma que descreve os passos experimentais para o isolamento de estirpes de levedura que transportam um degron. A biblioteca de plasmídeo descrito em A foi transformado em células Try467, seguido por selecção sobre placas de SD-LEU. As colônias foram replicados para placas SD-Leu contendo 5-FOA e colônias de crescimento rápido foram coletadas e organizadas em placas em um array ordenado. (C) As colónias expressando Ura3-GFP-cDNA que cresceram em placas contendo 5-FOA foram incubadas em ambos os suportes para 20 h SD-LEU ou SD-URA. DO600 foi medida a cada ~ 15 min e o tempo de duplicação mínimo de levedura (MDT) foi calculada utilizando o software MDTcalc n degron:. Um plasmídeo expressando Ura3-GFP sem um degron, serve como um controlo positivo para growth linha vermelha:. limite determinado pelo valor MDT do controle.
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Discussion
Aqui nós descrevemos um ensaio baseado no crescimento celular para determinar a taxa de degradação da proteína relativos, denominado 'A cinética do crescimento em cultura líquida sob condições selectivas "(Gils). O ensaio Gils tem várias vantagens: é simples de configurar, aquisição e análise de dados é simples e é extremamente modular. Consequentemente, Gils podem ser aplicadas simultaneamente para várias amostras em um amistoso formato de placa de multi-usuário que também pode ser adaptado a automação para aplicações de alto débito. Mais importante ainda, Gils fornece dados altamente reprodutíveis, quantitativos e robustas e é mais flexível do que os ensaios de crescimento baseado agar-placa que selecionam para o crescimento positivo / negativo. Além disso, gils é altamente sensível na medida em que pode detectar pequenas variações na taxa de degradação de proteínas ou os níveis de estado estacionário, o que reflecte a actividade dos componentes ou degrons UPS relevantes. Por fim, os ensaios de Gils exigem períodos de crescimento significativamente mais curtos (<12 horas) em comparação com growth ensaios em placas de agar (tipicamente 2-4 dias).
Enquanto o ensaio de gils é muito útil para estudar a degradação de proteínas, várias considerações importantes devem ser tidos em conta. Por exemplo, é essencial utilizar uma estirpe de levedura isogénica fundo devido a características de crescimento específica de estirpe. Além disso, para verificar a validade do ensaio, cada ensaio deve ser repetido pelo menos três vezes sob condições idênticas, mais importante, a densidade inicial das células (OD 600), temperatura de crescimento, cultura de células e intensidade da agitação não deve ser alterada. Por conseguinte, recomenda-se que o protocolo de ensaio específico é armazenada em software do leitor de microplacas para usos repetidos. Uma variável adicional que deve ser considerado é que o degron é posicionado dentro Ura3. Como a posição degron pode determinar a sua função, o posicionamento em qualquer das regiões C 'N ou' deve ser testado empiricamente.
A calibração do repórter protnível de expressão ein também é fundamental para o sucesso da aplicação de Gils. Um repórter óptima é aquela que é eficazmente degradado pelo sistema sob investigação e, assim, confere uracilo auxotrofia. No entanto, as variações na Auxotrofia também deve espelhar fielmente a estabilidade repórter. Isto pode ser determinado empiricamente através de testes antes da correlação entre as taxas de degradação da proteína repórter, determinados por métodos bioquímicos adicionais, e os valores de MDT, determinadas por gils (Figura 3B). Um problema comum quando se coloca a expressão em estado estacionário de um repórter basal não alcança um nível de limiar e, assim, é demasiado baixa para permitir o crescimento em SD-URA, mesmo quando ele está completamente estabilizado. Um tal problema pode ser superado através da colocação da expressão repórter sob o controlo de um promotor indutível que aumenta a expressão da proteína basal, sem afectar a degradação. Atividade do promotor em tais sistemas devem ser finamente calibrada para evitar o crescimento permanente no SD-URA devido a higOs níveis de proteína h e atividade da enzima repórter, mesmo quando é parcialmente degradada. Os promotores e as condições de expressão descritos neste estudo foram escolhidos porque permitem a regulação da expressão da proteína sensível: MET25p e p são os promotores de CUP1 induzida por metabólitos cuja actividade pode ser afinado por meio do controle de metionina e de cobre, respectivamente (Tabela 3).
Substratos repórter de controlo de qualidade (como os descritos no presente estudo) pode formar agregados intracelulares que pode sequestram Ura3 e impedir a sua função. Em tal caso uracilo auxotrofia pode ser erradamente interpretadas como resultado da degradação da proteína. Para testar a tendência de diferentes degrons para agregar, um repórter adicional deve ser empregue. Por exemplo, o repórter Ura3-GFP concebido para a tela degron (Figura 5A), permite a visualização de agregados intracelulares por microscopia de fluorescência de células em crescimento na presence de 5-FOA. Estes agregados aparece como focos densos GFP que se distinguem claramente a partir da aparência difusa da proteína solúvel (dados não mostrados). O repórter Ura3-GFP-degron pode ser utilizado de forma semelhante para determinar o efeito da proteína degron em co-localização e distribuição subcelular. Ele também pode ser usado para seguir a degradação dos substratos seleccionados por citometria de fluxo, como um ecrã secundário 25.
Uma vantagem mais significativa do método gils é que é suficientemente flexível e, portanto, pode ser facilmente adaptado para uma variedade de aplicações, para além das descritas no presente documento. Por exemplo, o método também pode ser utilizado para analisar a aptidão do proteassoma sob várias condições. Neste caso, um substrato não-proteassoma ubiquitylated tais como ornitina descarboxilase (ODC) é fundida com a Ura3. O método também pode testar a degradação de proteínas em compartimentos intracelulares distintas quando um sinal de localização específica é empregue.Neste estudo Vma12 ancorado o repórter para o ER-membrana (Figuras 3, 4). Do mesmo modo, um sinal de localização nuclear (NLS), o sinal de retenção do ER (KDEL) ou citosol (ausência de um sinal específico) pode ser empregue. Um sistema que permite a análise simultânea de degradação de proteínas em vários compartimentos intracelulares podem ter profundo impacto na nossa compreensão de como as redes de degradação de proteínas operar. Finalmente, os princípios do método de selecção pode ser aplicada à pesquisa de degradação da proteína em outros sistemas modelo baseados em células, a partir de bactérias para as células humanas, os quais requerem o produto do gene URA3 para a sobrevivência.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
- Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
- Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
- Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
- Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
- Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
- Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
- Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
- Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
- Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
- Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
- Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
- Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
- Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
- Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
- Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
- Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
- Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
- Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
- Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).
