Abstract
La degradación de proteínas por el sistema ubiquitina-proteasoma (UPS) es un mecanismo regulador importante para la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El enfoque estándar para la determinación de la degradación intracelular de proteínas se basa en ensayos bioquímicos para el seguimiento de la cinética de disminución de la proteína. Tales métodos son a menudo laborioso y consume mucho tiempo y por lo tanto no susceptible de experimentos dirigidos a evaluar múltiples sustratos y condiciones de degradación. Como alternativa, los ensayos basados en el crecimiento de células se han desarrollado, que son, en su formato convencional, ensayos de punto final que no puede determinar cuantitativamente los cambios relativos en los niveles de proteína.
Aquí se describe un método que determina fielmente los cambios en las tasas de degradación de proteínas mediante el acoplamiento a la cinética de crecimiento celular de la levadura. El método se basa en un sistema de selección establecido donde uracilo auxotrofía de URA3 -deleted células de levadura es rescatado por una proteína reportera expresada exógenamente, Compuesto de una fusión entre el gen URA3 esencial y determinante de degradación (degron). La proteína indicadora está diseñado de manera que su tasa de síntesis es constante mientras que su velocidad de degradación se determina por la degron. Como el crecimiento de células en medio sin uracilo deficiente es proporcional a los niveles relativos de Ura3, la cinética de crecimiento dependen enteramente de la degradación de la proteína reportera.
Este método mide con precisión los cambios en la cinética de degradación de proteínas intracelulares. Se aplicó a: (a) Evaluación de la contribución relativa de los factores de ubiquitina-conjugación conocidos a la proteolisis (b) la conjugación de la enzima E2 estructura-función analiza (c) Identificación y caracterización de nuevos degrons. La aplicación del sistema basado en URA3 degron- trasciende el campo de la degradación de proteínas, ya que también se puede adaptar a los cambios de monitorización de los niveles de proteína asociadas con las funciones de otras vías celulares.
Introduction
El sistema de degradación ubiquitina-proteasoma es una máquina reguladora importante, que ha sido implicado en el mantenimiento de la homeostasis de la proteína en todos los eucariotas. El UPS conjuga inicialmente múltiples moléculas de ubiquitina a una proteína diana después de lo cual la proteína poli-ubiquitina-etiquetado es degradada por el proteasoma 26S. En la mayoría de los casos, el paso limitante de la degradación mediada por ubiquitina es ubiquitylation sustrato, mediada por la conjugación de enzimas E2 y E3 ligando enzimas (E3 ligasas) 1. En consecuencia, la estabilidad intracelular de proteínas específicas refleja su susceptibilidad a la ubiquitina-conjugación y la actividad de sus enzimas ubiquitylation afines.
Ligasas E3 son los principales componentes de reconocimiento de sustrato de la UPS. Como tal, estas enzimas reconocen degrons dentro de sus sustratos que están ausentes o no expuestos en sus contrapartes estables 2. Por ejemplo, muchos reguladores del ciclo celular mUST ser sintetizado y degradado de manera temporal específica, a fin de mantener la progresión del ciclo celular en orden. La degradación de estas proteínas a menudo se controla por fosforilación, mediada por quinasas reguladas de señalización celular 3,4. Por otro lado, las proteínas plegadas de forma aberrante, se reconocen a través de degrons crípticos. Se trata de regiones que normalmente están ocultos en la estructura nativa y están expuestos a la estructura de la perturbación. Tales degrons incluyen dominios hidrofóbicos 5-7 y segmentos intrínsecamente desordenados 8.
Desde el descubrimiento seminal del sistema-ubiquitina para la degradación de proteínas y la caracterización de sus fundamentos en lisados de reticulocitos 9, la genética de la levadura fue instrumental en el descubrimiento de muchos de los componentes del sistema de ubiquitina 10. El éxito de la levadura como organismo modelo para el análisis sistemático de la degradación de proteínas por el UPS se debe principalmente al hecho de que el SAI es altoLy conserva en todos los eucariotas 4, junto con su amenability como un sistema experimental. De hecho, los sistemas basados en levaduras se emplean comúnmente para descifrar los mecanismos de acción de la maquinaria de ubiquitinación.
El estudio de la degradación de proteínas por medios bioquímicos por lo general requiere la preparación de extractos celulares. Mientras que las proteínas de células animales pueden ser extraídos en condiciones relativamente suaves que conservan las interacciones proteína y la función, la presencia de una pared celular de levadura robusto en condiciones de interrupción 11 requiere considerablemente más severas que pueden afectar a la recuperación de proteínas. De hecho, diferentes procedimientos para la interrupción de la célula de levadura varían considerablemente en su capacidad para recuperar las proteínas intactas en cantidades que representan correctamente su abundancia relativa celular. Además inexactitud inherente a los diferentes métodos utilizados para la determinación de las tasas de degradación de proteínas específicas: experimentos metabólicos basado etiquetado 'pulso-caza' seguido de immunoprecipitation, para aislar proteínas específicas 12, a menudo no es estrictamente cuantitativo. Por lo tanto, cuando la degradación de proteínas se compara con este método, la precaución adicional debe tener precaución en la interpretación de los resultados. Para evitar este inconveniente, una alternativa cicloheximida (CHX) ensayo de persecución se puede emplear 12. En este ensayo, se añade el inhibidor de la traducción a cultivos de células y los cambios temporales en los niveles de estado estable de proteínas son monitoreados posteriormente. Sin embargo, el uso de CHX se limita a las proteínas con vidas medias relativamente cortas (<90 min), como la inhibición a largo plazo de la síntesis de proteínas es citotóxico. En particular, tanto de los ensayos mencionados anteriormente requieren el uso de anticuerpos específicos para la proteína, que no siempre están disponibles.
Para superar estas limitaciones técnicas, los investigadores han desarrollado varios enfoques que no requieren la extracción de células y la manipulación directa de proteínas. Un enfoque se basa en el establecimiento de sí auxotróficocepas del st, obtenidos mediante la supresión de los genes que codifican las enzimas metabólicas esenciales. Tales genes incluyen HIS3, LEU2, LYS2 y TRP1, que codifica para las enzimas necesarias para la biosíntesis de aminoácidos, así como URA3 que codifica OMP descarboxilasa (Ura3), una enzima esencial de la biosíntesis de pirimidina ribonucleótido. Ura3 ha sido ampliamente utilizado en estudios de degradación de proteínas. En estos ensayos, la expresión constitutiva de Ura3 rescata crecimiento de las células ura3 en medio sin uracilo deficiente 13. En consecuencia, desestabilizando Ura3 a través de la fusión de un degron puede disminuir el crecimiento de células en medio mínimo carente de uracilo. Este método se ha utilizado en varios estudios de degradación de proteínas, incluyendo la identificación de determinantes de la degradación de 5, ligasas E3 14 y ubiquitylation auxiliar factores de 15 y el descubrimiento de nuevos UPS degrons 16. Todos estos métodos empleados crecimiento de las células en placas de agar como lectura del ensayo. Sin embargo, tque el criterio de crecimiento (crecimiento positivo / negativo), mientras robusta y eficiente, es sobre todo cualitativo y no proporciona información cuantitativa que es importante para evaluar la potencia de un degron o la contribución relativa de los diversos factores de degradación auxiliares.
Por ello, hemos desarrollado y utilizado los vectores de levadura y los métodos de detección que permite un análisis sistemático y cuantitativo de la degradación de proteínas por el URA3 -degron sistema de fusión. El protocolo se basa en un ensayo fácil de manejar que mide la cinética de crecimiento en cultivo líquido bajo condiciones selectivas (GILS) y en la generación de curvas de crecimiento estándar. Cinética de crecimiento de la levadura se caracterizan por tres fases principales - el desfase, la exponencial (de registro) y la fase estacionaria. Cálculo de la cinética de replicación de levadura durante la fase de registro en condiciones selectivas, que se determina por los niveles de expresión de la Ura3-degron, proporciona una medición cuantitativa o imparcialf degradación de proteínas. Este método se puede aplicar a la medición y la comparación de las tasas de degradación de múltiples sustratos UPS simultáneamente en múltiples cepas y bajo diversas condiciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
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