Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए रिपोर्टर-आधारित विकास परख

Published: November 6, 2014 doi: 10.3791/52021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

Abstract

Ubiquitin-एंटीबॉडी प्रणाली (यूपीएस) द्वारा प्रोटीन गिरावट सब यूकेरियोट्स में प्रोटीन समस्थिति के लिए एक प्रमुख विनियामक तंत्र है. intracellular प्रोटीन गिरावट का निर्धारण करने के लिए मानक दृष्टिकोण प्रोटीन गिरावट के कैनेटीक्स निम्न के लिए जैव रासायनिक assays पर निर्भर करता है. इस तरह के तरीके अक्सर श्रमसाध्य और समय लगता है और कई substrates और गिरावट की स्थिति का आकलन करने के उद्देश्य से प्रयोगों को इसलिए उत्तरदायी नहीं हैं. एक विकल्प के रूप में, सेल के विकास आधारित assays मात्रात्मक प्रोटीन के स्तर में रिश्तेदार परिवर्तन का निर्धारण नहीं किया जा सकता कि उनके पारंपरिक प्रारूप, अंत बिंदु assays में, कर रहे हैं कि विकसित किया गया है.

यहाँ हम ईमानदारी से खमीर सेल विकास कैनेटीक्स उन्हें युग्मन द्वारा प्रोटीन गिरावट दरों में परिवर्तन निर्धारित करता है कि एक विधि का वर्णन. विधि URA3 की uracil auxotrophy खमीर कोशिकाओं एक exogenously व्यक्त संवाददाता प्रोटीन से बचाया है -deleted जहां एक की स्थापना की चयन प्रणाली पर आधारित हैआवश्यक URA3 जीन और एक गिरावट निर्धारक (degron) के बीच एक संलयन के शामिल. संवाददाता प्रोटीन इसकी गिरावट दर degron द्वारा निर्धारित है जबकि इसकी संश्लेषण की दर स्थिर है कि इतनी बनाया गया है. Uracil कमी मध्यम में सेल के विकास Ura3 के सापेक्ष स्तरों के लिए आनुपातिक है, विकास कैनेटीक्स संवाददाता प्रोटीन गिरावट पर पूरी तरह निर्भर हैं.

इस विधि को सही रूप से intracellular प्रोटीन गिरावट कैनेटीक्स में परिवर्तन के उपाय. (क) E2 के conjugating एंजाइम की संरचना समारोह (ग) पहचान और उपन्यास degrons के लक्षण वर्णन का विश्लेषण करती है प्रोटियोलिसिस (ख) के लिए जाना जाता ubiquitin-conjugating कारकों के सापेक्ष योगदान का आकलन: यह करने के लिए लागू किया गया था. यह भी अन्य सेलुलर रास्ते के कार्यों के साथ जुड़े प्रोटीन के स्तर की निगरानी में परिवर्तन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में degron- URA3 आधारित प्रणाली के आवेदन, प्रोटीन गिरावट क्षेत्र अतिक्रमण.

Introduction

ubiquitin-एंटीबॉडी गिरावट प्रणाली सभी यूकेरियोट्स में प्रोटीन homeostasis के रखरखाव में शामिल किया गया है जो एक प्रमुख विनियामक मशीन, है. यूपीएस शुरू में पाली ubiquitin टैग प्रोटीन 26S एंटीबॉडी द्वारा अपमानित किया जाता है, जिसके बाद एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए कई ubiquitin अणुओं conjugates. ज्यादातर मामलों में, ubiquitin मध्यस्थता गिरावट के लिए कदम सीमित दर E2 के एंजाइमों conjugating और E3 एंजाइमों ligating द्वारा मध्यस्थता सब्सट्रेट ubiquitylation, (E3 के ligases) 1 है. नतीजतन, विशिष्ट प्रोटीन के intracellular स्थिरता उनके ubiquitin-विकार के लिए संवेदनशीलता और उनके आत्मीय ubiquitylation एंजाइम की गतिविधि को दर्शाता है.

E3 के ligases यूपीएस की प्रिंसिपल सब्सट्रेट मान्यता घटक हैं. जैसे, इन एंजाइमों अनुपस्थित या उनके स्थिर समकक्षों 2 में उजागर नहीं है कि या तो उनके substrates के भीतर degrons पहचाना. सेल चक्र एम के उदाहरण के लिए, कई नियामकोंउस्त संश्लेषित और क्रम में सेल चक्र प्रगति रखने के लिए एक अस्थायी विशिष्ट ढंग से अपमानित किया. इन प्रोटीनों की गिरावट अक्सर सेल संकेत विनियमित kinases 3,4 द्वारा मध्यस्थता, फास्फारिलीकरण द्वारा नियंत्रित किया जाता है. दूसरी ओर, aberrantly-मुड़ा हुआ प्रोटीन गुप्त degrons के माध्यम से मान्यता प्राप्त हैं. ये आम तौर पर देशी संरचना में छिपे हुए हैं और संरचना गड़बड़ी पर उजागर कर रहे हैं कि क्षेत्र हैं. इस तरह degrons हाइड्रोफोबिक डोमेन 5-7 और आंतरिक रूप से अव्यवस्थित क्षेत्रों 8 शामिल हैं.

Reticulocyte lysates 9 में प्रोटीन गिरावट और इसके मूल सिद्धांतों के लक्षण वर्णन के लिए ubiquitin-प्रणाली का मौलिक खोज के बाद से, खमीर आनुवंशिकी ubiquitin प्रणाली 10 के घटकों के कई की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. यूपीएस द्वारा प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए एक मॉडल जीव के रूप में खमीर की सफलता यूपीएस उच्च तथ्य यह है कि मुख्य रूप से की वजह से हैly एक प्रायोगिक प्रणाली के रूप में उनके ज़िम्मा के साथ मिलकर, सभी यूकेरियोट्स 4 में संरक्षित. दरअसल, खमीर आधारित प्रणाली सामान्यतः ubiquitylation मशीनरी की कार्रवाई के तंत्र को समझने के लिए कार्यरत हैं.

जैव रासायनिक तरीकों से प्रोटीन गिरावट का अध्ययन आमतौर पर सेल के अर्क की तैयारी की आवश्यकता है. पशु सेल प्रोटीन प्रोटीन बातचीत और समारोह के संरक्षण कि अपेक्षाकृत हल्के परिस्थितियों में निकाला जा सकता है, खमीर 11 में एक मजबूत सेल दीवार की उपस्थिति प्रोटीन वसूली प्रभावित हो सकता है जो काफी कठोर विघटन की स्थिति की आवश्यकता है. दरअसल, खमीर सेल विघटन के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं को सही ढंग से उनके रिश्तेदार सेलुलर बहुतायत का प्रतिनिधित्व करते हैं कि मात्रा में बरकरार प्रोटीन ठीक करने के लिए अपनी क्षमता में काफी भिन्नता है. इसके अलावा अशुद्धि विशिष्ट प्रोटीन की गिरावट दरों का निर्धारण करने के लिए कार्यरत विभिन्न तरीकों में निहित है: आईएम द्वारा पीछा मेटाबोलिक लेबलिंग आधारित 'पल्स-पीछा' प्रयोगोंmunoprecipitation, विशिष्ट प्रोटीन 12 अलग करने के लिए, अक्सर सख्ती से मात्रात्मक नहीं है. प्रोटीन गिरावट इस विधि से तुलना की जाती है जब इस प्रकार, अतिरिक्त सावधानी परिणामों की व्याख्या में प्रयोग किया जाना चाहिए. इस खामी को नाकाम करने के लिए, एक वैकल्पिक cycloheximide (CHX) पीछा परख 12 नियोजित किया जा सकता. इस परख में अनुवाद अवरोध बाद में निगरानी कर रहे हैं सेल संस्कृतियों और प्रोटीन स्थिर राज्य स्तर में अस्थायी परिवर्तन करने के लिए जोड़ा गया है. फिर भी, CHX का प्रयोग अपेक्षाकृत कम आधा जीवन (<90 मिनट), प्रोटीन संश्लेषण के रूप में लंबे समय तक निषेध साइटोटोक्सिक है साथ प्रोटीन के लिए सीमित है. विशेष रूप से, उपर्युक्त assays के दोनों हमेशा उपलब्ध नहीं हैं, जो प्रोटीन विशिष्ट एंटीबॉडी, के उपयोग की आवश्यकता.

इन तकनीकी सीमाओं को पार करने के लिए, शोधकर्ताओं सेल निष्कर्षण और प्रत्यक्ष प्रोटीन से निपटने की आवश्यकता नहीं है कि कई दृष्टिकोण विकसित किया है. एक दृष्टिकोण auxotrophic हाँ की स्थापना पर आधारित हैआवश्यक चयापचय एंजाइम एन्कोडिंग जीन का विलोपन द्वारा प्राप्त सेंट उपभेदों,. इस तरह के जीन OMP decarboxylase encodes कि HIS3, LEU2, LYS2 और TRP1, अमीनो एसिड जैवसंश्लेषण के लिए आवश्यक एंजाइमों के लिए एन्कोडिंग, साथ ही URA3 (Ura3), pyrimidine ribonucleotide जैवसंश्लेषण की एक आवश्यक एंजाइम शामिल हैं. Ura3 व्यापक रूप से प्रोटीन गिरावट के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. इन assays में, Ura3 के विधान अभिव्यक्ति uracil कमी मध्यम 13 में ura3 कोशिकाओं के विकास को बचाता है. नतीजतन, एक degron के विलय के माध्यम से Ura3 को अस्थिर न्यूनतम मध्यम कमी uracil पर सेल के विकास को कम कर सकते हैं. इस विधि गिरावट की पहचान सहित विभिन्न प्रोटीन गिरावट पढ़ाई में 5 निर्धारकों इस्तेमाल किया गया है, E3 के 14 ligases और सहायक ubiquitylation 15 कारकों और उपन्यास यूपीएस degrons 16 की खोज. इन तरीकों के सभी परख readout के रूप में अगर प्लेट पर सेल के विकास कार्यरत हैं. हालांकि, टीवह विकास कसौटी (सकारात्मक / नकारात्मक वृद्धि), मजबूत और कुशल, ज्यादातर गुणात्मक है और एक degron की शक्ति या विभिन्न सहायक गिरावट कारकों के सापेक्ष योगदान का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करता है.

इसलिए हम विकसित और फ्यूजन प्रणाली -degron URA3 द्वारा प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित और मात्रात्मक विश्लेषण को सक्षम करने खमीर वैक्टर और स्क्रीनिंग तरीकों का उपयोग किया है. प्रोटोकॉल चुनिंदा परिस्थितियों में तरल संस्कृति (gils) में और मानक विकास घटता की पीढ़ी पर विकास कैनेटीक्स उपाय है कि एक आसान-संभाल परख पर आधारित है. अंतराल, घातीय (प्रवेश) और स्थिर चरण - खमीर विकास कैनेटीक्स तीन मुख्य चरणों की विशेषता है. Ura3-degron की अभिव्यक्ति के स्तर से निर्धारित होता है जो चुनिंदा परिस्थितियों में लॉग चरण के दौरान खमीर प्रतिकृति कैनेटीक्स की गणना, एक निष्पक्ष मात्रात्मक माप ओ प्रदान करता हैएफ प्रोटीन गिरावट. इस विधि को मापने और एक साथ कई उपभेदों में और विभिन्न परिस्थितियों में कई यूपीएस substrates की गिरावट दरों की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. प्लाज्मिड चयन और रखरखाव के लिए फ्यूजन और (ख) एक अतिरिक्त चयापचय मार्कर -degron (क) एक URA3 युक्त एक प्लाज्मिड के साथ, इस तरह के Try467 (तालिका 2) के रूप में उपयुक्त auxotrophic खमीर कोशिकाओं, रूपांतरण.
    . नोट: - खमीर प्रतिलेखन से ली गई एक degron एक उपयुक्त प्लाज्मिड का एक उदाहरण YDpK-MET25p-Deg1 झंडा-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- यूवी) इस Deg1 की जिसमें एक संलयन प्रोटीन युक्त एक खमीर एकीकृत प्लाज्मिड है कारक Mat2 17, झंडा मिलान - एक स्थिर ईआर प्रोटीन, और Ura3 15,18 (चित्रा 3 ए) - immunoblotting, Vma12 से पता लगाने के लिए. (इस अध्ययन में और उपयुक्त plasmids के अतिरिक्त उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया प्लास्मिड के लिए 3 टेबल देखें.)
  2. प्लाज्मिड चयन और रखरखाव के लिए परिभाषित एक उपयुक्त सिंथेटिक तहत अगर प्लेटों में कोशिकाओं रखने (एसडी) मध्यम अमीनो एसिड चयन मार्कर कमी Deg1 -UV चयन किया जाता है और एसडी LYS चुनिंदा मीडिया के तहत बनाए रखा).
  3. एक स्थिर चरण तक पहुँच जाता है प्लाज्मिड रखरखाव के लिए एक उपयुक्त चयनात्मक एसडी माध्यम में 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन बढ़ें. नमूनों की संख्या (खंड 2) की जांच की जा करने के लिए पर निर्भर करता है, टेस्ट ट्यूब में या एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं को विकसित.

विश्लेषण के लिए 2. सेल तैयार

  1. नमूने की एक छोटी संख्या (N≤15) assayed हो रहे हैं, कोशिकाओं को कमजोर और के रूप में मध्यम जगह:
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली (स्पष्ट नीचे) में अच्छी तरह से प्रति एसडी माध्यम के 150 μl के साथ एक हे / एन संस्कृति से कोशिकाओं के 50 μl पतला. रिक्त केवल मध्यम होता है के रूप में पहला नमूना नामित है, ध्यान दें.
    2. एक microplate रीडर का उपयोग 96 अच्छी तरह से थाली में नमूने के 600 आयुध डिपो मूल्यों का निर्धारण करते हैं.
    3. क से, अच्छी तरह से कमजोर पड़ने कारक (X4) से 600 आयुध डिपो पढ़ने गुणा करके प्रत्येक में वास्तविक 600 आयुध डिपो की गणनारिक्त पढ़ने के मूल्य आईसीएच घटाया जाता है. बीयर-लैम्बर्ट कानून के अनुसार 1 सेमी की गणना पथ लंबाई प्राप्त करने के लिए 0.55 से विभाजित करके परिणामस्वरूप मूल्यों मानक के अनुसार. एक मानक 96 अच्छी तरह से थाली में आयुध डिपो कोशिकाओं के 600 से 200 के μl मापने जब ​​इस मूल्य स्थिर है, ध्यान दें.
    4. 0.25 के 600 आयुध डिपो और एक Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण करने के लिए राशि के बराबर में खमीर कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए आवश्यक सटीक मात्रा की गणना.
    5. 1 मिनट के लिए उच्च गति (12,000 XG) में कोशिकाओं नीचे स्पिन.
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें और उपयुक्त चयनात्मक माध्यम से 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend आयुध डिपो 0.25 के 600 प्राप्त करने के लिए (अनुभाग 3.1 देखें).
    7. एक 96 अच्छी तरह से थाली में एक नया अच्छी तरह से करने के लिए पतला स्ट्रेन के 200 μl स्थानांतरण.
  2. नमूनों की एक बड़ी संख्या (एन> 15) का परीक्षण किया जा करने के लिए कर रहे हैं, इस प्रकार, कोशिकाओं को कमजोर और पूर्व 600 आयुध डिपो माप के बिना मध्यम जगह:
    1. स्थिर कोशिकाओं के 10 μl स्थानांतरणउपयुक्त चयनात्मक मीडिया के 190 μl (कमजोर पड़ने 1:20) युक्त एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में एक 96 अच्छी तरह से थाली में वृद्धि हुई हे / एन (अनुभाग 3.1 देखें).

चयनित शर्तों के तहत तरल संस्कृति में 3. विकास कैनेटीक्स (gils)

  1. Ura3-degron रिपोर्टर का उपयोग विकास के मापन के लिए निम्न मीडिया का उपयोग करें:
    1. गैर-प्रतिबंधक शर्तों के तहत खमीर विकास, उपयोग प्लाज्मिड चयनात्मक एसडी मीडिया की सकारात्मक नियंत्रण के लिए (अनुभाग 1.2 देखें). कोई प्लाज्मिड चयन की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए, ऐसे Deg1 -UV, सभी आवश्यक अमीनो एसिड (पूरा एसडी) युक्त एसडी माध्यम के रूप में एक एकीकृत प्लाज्मिड का उपयोग करते समय इस्तेमाल किया जा सकता है.
    2. प्रतिबंधात्मक शर्तों के तहत विकास को मापने प्रयोगात्मक नमूने लिए, एसडी URA माध्यम का उपयोग.
  2. एक बहुपद्वति microplate रीडर को सेट करें:. 15 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस, 600 आयुध डिपो माप अंतराल के एक ऊष्मायन तापमान, और 1 मिनट के हर सात मिनट की एक कक्षीय और रैखिक मिलाते चक्र <br /> नोट: इस दोहरे मोड कोशिकाओं के समरूप वितरण प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था मिलाते; हालांकि, अन्य मिलाते मोड या यहां तक ​​कि कोई झटकों के रूप में अच्छी तरह से काम कर सकते हैं.
  3. में 30 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते एक microplate पाठक ओ / एन या कोशिकाओं स्थिर चरण (12-24 घंटा) तक पहुँच चुके हैं जब तक.
  4. एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए कच्चे डेटा निर्यात करें.
  5. (; विवरण धारा 4 को देखने के लिए कम से कम दोगुना समय (एमडीटी)) कोशिकाओं उनकी जनसंख्या के आकार को दोगुना करने के लिए MDTcalc, (मानव संसाधन में) कम से कम समय की गणना करता है कि एक स्वनिर्धारित सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग खमीर विकास कैनेटीक्स निर्धारण करते हैं.

मिनिमल दुगनी समय की 4. गणना (एमडीटी): MDTcalc एल्गोरिथ्म के सिद्धांतों

नोट: MDTcalc एल्गोरिथ्म के सिद्धांतों, एसडी पूरा मीडिया में उगाई Try467 खमीर कोशिकाओं (तालिका 2) के एक प्रतिनिधि नमूने का उपयोग कर, एक डेटा स्प्रेडशीट और विकास भूखंडों दिखा, 1 टेबल और चित्रा 1 में सचित्र हैं, क्रमशःअपेक्षाकृत.

  1. अच्छी तरह से नमूने में प्राप्त रीडिंग में से प्रत्येक से संबंधित अच्छी तरह से प्राप्त की, आयुध डिपो के 600 रिक्त मूल्यों घटाएँ. 0.55 से परिणामस्वरूप मतभेद फूट डालो (96 अच्छी तरह प्लेटों के लिए) प्रकाश पथ की लंबाई के लिए सही करने के लिए. अंतिम मूल्यों (1 टेबल, ट्रांस.) प्लॉट समय के खिलाफ वास्तविक खमीर विकास की अवस्था (600 आयुध डिपो / घंटा) (चित्रा 1 ए) के उत्पादन के लिए.
  2. एक रेखीय वक्र (चित्रा 1 बी) में लघुगणक विकास के चरण में परिवर्तित करने के लिए बदल मूल्यों से प्रत्येक के लिए प्रवेश 2 (600 आयुध डिपो) की गणना.
  3. (; चित्रा 1C तालिका 1, ढलान) एक 10 समय-अंक अंतराल (एन = 10) समय 0 पर शुरू और एन <10 तक एक बार में एक ही समय बिंदु हिलाने की ढलान की गणना.
  4. डबल करने के लिए सेल की आबादी के लिए आवश्यक समय प्राप्त करने के लिए प्रत्येक ढलान का उलटा मूल्य की गणना (1 टेबल, 1 / ढाल, चित्रा 1C). न्यूनतम गणना1 / ढाल मूल्य एमडीटी (; चित्रा 1C 1 टेबल, काले आयत) निर्धारित करने के लिए. चयनित समय अंतराल से नमूने में कोशिकाओं (तालिका 1, 1 / ढाल, काले आयत) के लिए गणना की एमडीटी निकालें (लाल आयत द्वारा उल्लिखित तालिका 1, 1 बी, 1D आंकड़े).
    नोट: एसडी URA माध्यम पर सेल के विकास की दर एमडीटी के विपरीत आनुपातिक है.

5. MDTcalc का उपयोग

  1. कंप्यूटर में एक निर्दिष्ट फ़ोल्डर में पूरक प्रोग्राम फाइल कॉपी.
  2. विकास डेटा युक्त स्प्रेडशीट फ़ाइल को बचाया और बंद हो गया है सुनिश्चित करें. स्क्रीन प्रकट शुरुआत के देखने के लिए MDTcalc आवेदन प्रोग्राम को खोलें.
    1. चित्रा 2 में प्रदर्शन के रूप में, आवश्यक जानकारी डालें:
      1. 'फ़ाइल पथ' के तहत, स्प्रेडशीट फ़ाइल का पता लगाने के लिए सही पर आयत पर क्लिक करें.
      2. जहां टी 'शीट नाम' के तहत, स्प्रेडशीट नाम लिखनावह कच्चे डेटा स्थित है.
      3. 'स्थिति शुरू' के तहत, स्प्रेडशीट पहला नमूना के समय 0 से समन्वय डालें.
      4. 'टाइम स्तंभ' के तहत, समय बिंदु स्तंभ का स्थान (समय सेकंड में प्रदान की जानी चाहिए) को परिभाषित पत्र डालें.
      5. 'खाली कॉलम' के तहत, रिक्त स्तंभ के स्थान को परिभाषित पत्र डालने (आमतौर लेकिन 96 अच्छी तरह से थाली की जरूरी नहीं कि में अच्छी तरह ए 1).
      6. 'आयुध डिपो मूल्य' के तहत, एमडीटी गणना की दीक्षा (आमतौर पर 0.15-0.25) के लिए आवश्यक न्यूनतम तब्दील 600 आयुध डिपो मूल्य का चयन करें. एमडीटी केवल परिभाषित 600 आयुध डिपो मूल्य या अधिक पहुँच कि नमूने के लिए गणना की है कि तो यह मान सेट अत्यधिक होने के कारण कमजोर पड़ने के लिए अंतराल चरण में संस्कृतियों के लिए एमडीटी की गणना रोकता है.
    2. पिछले मान दर्ज किया गया है, स्क्रीन के नीचे 'गणना' बटन दबाएँ. सही पर प्रगति बार धीरे-धीरे छ कि परिवर्तन सुनिश्चित करेंREEN. गणना प्रक्रिया के दौरान स्प्रेडशीट फ़ाइल खुला नहीं है.
    3. एक स्प्रेडशीट में एमडीटी गणना के पूरा होने पर स्क्रीन पर स्वतः प्रकट होने वाले डेटा के दो सेट निर्यात करें. (क) न्यूनतम आयुध डिपो मूल्य (खंड 5.2.1.6 में सेट के रूप में) परीक्षण और (ख) एमडीटी गणना की गई जिसमें से अंतराल के प्रारंभिक समय बिंदु से गुजरता है कि प्रत्येक के लिए अच्छी तरह एमडीटी मूल्य (प्रारंभ: डेटा शामिल है कि सुनिश्चित करें समय).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक संवाददाता सब्सट्रेट की गिरावट में Doa10 मार्ग के एंजाइम की भूमिका की जांच

यह एक पारंपरिक गिरावट परख की तुलना में था gils विधि की वैधता का परीक्षण करने के लिए. इस प्रयोग ईआर झिल्ली के घटकों के सापेक्ष योगदान का आकलन स्थानीयकृत प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण संवाददाता सब्सट्रेट Deg1- नजरों से देख (चित्रा 3 ए) की गिरावट के लिए 20,21 जटिल Doa10 E3-ligase. Deg1- नजरों से देख प्लाज्मिड जंगली प्रकार की कोशिकाओं में या E2 के conjugating एंजाइम के लिए जीन की कमी कोशिकाओं में एकीकृत किया गया था, UBC7 (ubc7) और प्रोटीन स्थिरता बाद में एक CHX पीछा परख 6 द्वारा निर्धारित किया गया था. विरोधी झंडा immunoblotting जंगली प्रकार की कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) में अनुपस्थित था कि ubc7 कोशिकाओं में एक स्थिर Deg1 -VU प्रोटीन बैंड का पता चला. जंगली प्रकार की कोशिकाओं में Deg1 -VU के अभाव attribu हैDeg1 -VU स्थिरता Ubc7 पर दृढ़ता से निर्भर है यह दर्शाता है कि ubc7 कोशिकाओं में समाप्त कर दिया गया था कि इसकी निरंतर क्षरण करने के लिए टेड.

जाहिर है, Deg1- नजरों से देख की गिरावट तेजी है. हालांकि, गिरावट के रिश्तेदार दर प्रोटीन शुरू से जंगली प्रकार की कोशिकाओं में undetectable है के बाद से एक CHX परख द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है. नतीजतन, नव विकसित gils परख विधि जंगली प्रकार और विभिन्न उत्परिवर्ती उपभेदों (चित्रा -3 सी) के बीच प्रोटीन गिरावट के कैनेटीक्स में रिश्तेदार मतभेदों की तुलना करने के लिए, नियोजित किया गया था. प्रारंभ में, Deg1 -VU व्यक्त जंगली प्रकार, ubc6, ubc7 या doa10 कोशिकाओं एसडी पूरा मध्यम पर बड़े हो रहे थे. Gils मापने के लिए, कोशिकाओं धोया और एसडी URA में incubated रहे थे. एमडीटी गणना प्रोटोकॉल में उदाहरण के रूप में मार डाला गया था. आंकड़े -3 सी, 3 डी excludi, पूरा एसडी में उगाई सभी स्ट्रेन के लिए समान विकास घटता है और गणना एमडीटी (~ 2.5 घंटा) दिखानेएनजी जांच जीनों में से किसी का विलोपन सेल के विकास को प्रभावित करता है कि संभावना है. केवल एक मामूली वृद्धि दोष उत्परिवर्ती उपभेदों (एमडीटी ~ 3 घंटा) में मनाया गया, जबकि इसके विपरीत, एसडी URA में ऊष्मायन, जंगली प्रकार की कोशिकाओं (एमडीटी = 6.34) के गरीबों के विकास में हुई.

Deg1- नजरों से देख की गिरावट पर E2 के conjugating एंजाइम Ubc7 के विभिन्न म्यूटेंट के प्रभाव की जांच

प्रणाली की प्रायोगिक रेंज बहुत व्यापक है क्योंकि Ubc7 बिल्कुल Deg1- नजरों से देख गिरावट के लिए आवश्यक है कि तथ्य, विभिन्न E2 म्यूटेंट की भी आंशिक प्रभाव का सटीक आकलन में सक्षम बनाता है. तदनुसार, जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती UBC7 युक्त प्लास्मिड Deg1 -VU और गिरावट के लिए उनके योगदान gils द्वारा निर्धारित किया गया था व्यक्त Ubc7 कोशिकाओं में एकीकृत कर रहे थे. जैसी कि उम्मीद थी, तेजी से विकास कैनेटीक्स सक्रिय साइट म्यू साथ Ubc7 व्यक्त कोशिकाओं में मनाया गयाtants C89S और N81A 22 (चित्रा 4). इसके अलावा, दो म्यूटेंट परोक्ष रूप से Deg1 -VU गिरावट (V25G और H94K) का परीक्षण किया गया बाधा की भविष्यवाणी की. ये परिवर्तन भी सक्रिय साइट म्यूटेंट से एक डिग्री कम (चित्रा 4 (C89S और N81K के लिए 2.7 घंटे की औसत MDTs की तुलना V25G और H94K के लिए 3.4 घंटे की औसत MDTs) के लिए हालांकि, जंगली प्रकार Ubc7 की तुलना में, सेल के विकास बढ़ाया ). इस प्रकार, gils विधि एक संवाददाता सब्सट्रेट की स्थिरता के लिए विभिन्न गिरावट कारकों के सापेक्ष योगदान का सही माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अलगाव और उपन्यास degrons का मूल्यांकन

Gils प्रणाली भी उपन्यास degrons की पहचान और यानी उनके रिश्तेदार शक्ति, वे गिरावट (चित्रा 5) प्रेरित है जिसके द्वारा डिग्री यों एक उच्च throughput स्क्रीन प्रारूप में नियोजित किया गया था. एक अतिरिक्त सदाशयी degrons की पहचान करने के लिए अनुकूलनFluoroorotic एसिड (5 FOA) की उपस्थिति में वृद्धि है जो चयन कदम, कहा गया था. Ura3 कुशलतापूर्वक Ura3 16,23 अस्थिर है जहां खमीर उपभेदों के अलगाव के लिए एक सकारात्मक चयन के रूप में सेवा कर सकते हैं कि एक जहरीले यौगिक (5 fluorouracil) में 5-FOA धर्मान्तरित. उपन्यास degrons की पहचान करने के लिए, संवाददाता plasmids के एक पुस्तकालय Ura3-GFP प्लाज्मिड 24 (चित्रा 5A) को एक खमीर सीडीएनए लाइब्रेरी से ली गई यादृच्छिक टुकड़े fusing द्वारा उत्पन्न किया गया था. GFP के आधा भाग (चर्चा देखें) संलयन degron के स्थानीयकरण के बारे में जानकारी एक माध्यमिक स्क्रीन सक्षम और प्रदान करने के लिए जोड़ा गया है. पुस्तकालय तो अलग थे 5-FOA (चित्रा 5 ब) और सकारात्मक क्लोन की उपस्थिति में चयनित और एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में अगर प्लेटों पर फिर से वरीयता प्राप्त, खमीर में तब्दील हो गया था. खंड 2.2 में वर्णित के रूप में प्रत्येक कॉलोनी में एक नया 96 अच्छी तरह से थाली में, 96 अच्छी तरह से थाली में स्थानांतरित हे / एन incubated, और पतला था. यह एसडी URA मध्यम में कोशिकाओं की है कि विकास की उम्मीद हैdegron की शक्ति का परिणाम गिरावट प्रेरित करने के लिए है जो Ura3 अभिव्यक्ति की डिग्री, के साथ संबंध स्थापित करेगा. यह बाद में gils (चित्रा 5C) को लागू करने से पुष्टि की गई. 5-FOA साथ पूर्व चयनित किए गए सभी बेतरतीब ढंग से उठाया कालोनियों एसडी लियू मध्यम (चित्रा 5C, खाली सलाखों) पर, इसी तरह एमडीटी मूल्यों से पता चला है कि हम इस बात की पुष्टि. इसके विपरीत, सभी क्लोन नियंत्रण Ura3-GFP (नहीं दिखाया डेटा) व्यक्त कोशिकाओं की तुलना में काफी धीमी थे जो एसडी URA पर चर विकास दर, दिखाया. संकेत के रूप में, एसडी URA और एमडीटी पर विकास दर के बीच एक व्युत्क्रम संबंध नहीं है. इस प्रकार, एमडीटी अधिक, और अधिक शक्तिशाली degron है. दरअसल, सकारात्मक चयनित क्लोन से प्राप्त सभी MDTs नियंत्रण (लाल रेखा से ऊपर) (चित्रा 5C, भरे सलाखों) की तुलना में अधिक थे.

तालिका 1
<खमीर एमडीटी. समय इकाइयों की गणना की strong> तालिका 1. चित्रण घंटे (मानव संसाधन) कर रहे हैं. 600 आयुध डिपो पढ़ता से खाली और नमूना है. परिवर्तन (ट्रांस.) रिक्त घटाव और पथ-लंबाई सुधार के बाद 600 आयुध डिपो मूल्य है. प्रवेश 2 तब्दील डेटा से गणना की है. ढाल प्रवेश 2 (600 आयुध डिपो) समय से विभाजित 10 समय बिंदुओं के अंतराल के लगातार भीतर मूल्यों है. 1 / ढाल ही नकल करने के लिए सेल की आबादी के लिए आवश्यक समय है. काले आयत एमडीटी के निशान मूल्य. लाल आयत एमडीटी गणना की गई जिसमें से समय अंतराल के निशान.

खमीर जीनोटाइप स्रोत
TRy467 α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ; 0 Euroscarf
TRy508 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 इस अध्ययन
TRy528 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 इस अध्ययन
TRy530 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 इस अध्ययन
TRy532 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 इस अध्ययन
TRy556 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 इस अध्ययन
TRy563 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX इस अध्ययन
TRy633 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 इस अध्ययन
TRy786 α, HIS3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: अपने, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: Met25-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: लियू, doa10Δ :: HIS3 इस अध्ययन

इस अध्ययन में इस्तेमाल खमीर उपभेदों तालिका 2 सूची.

इस अध्ययन में इस्तेमाल प्लास्मिड
प्लास्मिड प्रासंगिक मार्करों स्रोत
pTR717 YDpK-MET25p-Deg1-ध्वज-Vma12-Ura3 (एकीकृत प्लाज्मिड LYS1 युक्त) इस अध्ययन
pTR1412 pRS315-CUP1p-URA3-हा-GFP (लियू) इस अध्ययन
अतिरिक्त उपयुक्त संवाददाता प्लास्मिड
प्लास्मिड प्रासंगिक मार्करों स्रोत
pOC9-CL1 pOC9-CUP1p-हा-URA3 (TRP1) (17)
URA3-2 (GFP) pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP लुईस और Pelham

टेबल इस अध्ययन में इस्तेमाल plasmids के 3. सूची संदर्भ:.. लुईस, एम.जे. और Pelham, प्लाज्मा झिल्ली पर thermosensitive प्रोटीन के मानव संसाधन अक्षम गुणवत्ता नियंत्रण एक PLoS 4, e5038, Doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).

चित्रा 1
एमडीटी की गणना की 1. सिद्धांतों चित्रा. आयुध डिपो 600 0.22 पर Try467 खमीर कोशिकाओं, संकेत समय अवधि के लिए एसडी पूरा मीडिया में incubated रहे थे. आयुध डिपो के 600 माप हर ~ 15 मिनट के लिए ले जाया गया और डेटा एक स्प्रेडशीट में एकत्र किया गया था. (ए) 1 टेबल से परिवर्तित 600 आयुध डिपो मूल्यों समय के खिलाफ साजिश रची है. (बी). 600 आयुध डिपो के 2 समय के खिलाफ साजिश रची लाल लाइन Log: एमडीटी गणना की गई जिसमें से समय अंतराल (डी) का प्रतीक है. (सी) खमीर विकास दर (ढलान) समय के साथ लगातार 10 बार के अंक (संभालने रैखिकता) के 600 आयुध डिपो में परिवर्तन को मापने के द्वारा गणना की गई समय शुरू:. गणना शुरू किया गया था, जहां से समय. . (मानव संसाधन में) की गणना की न्यूनतम दुगनी समय: (डी) दोगुना करने के लिए खमीर के लिए आवश्यक समय (सी) (1 / ढाल) एमडीटी से ढाल का उलटा है.

चित्रा 2
नयाचार अनुभाग 5.1: चित्रा 2. स्क्रीन शुरू MDTcalc. विशिष्ट इनपुट मूल्यों दिखाए जाते प्रवेश किया.

Deg1 -VU की गिरावट मापने चित्रा 3. (ए) Deg1 -VU और ईआर झिल्ली में अपने संगठन के विभिन्न प्रोटीन तत्वों की योजनाबद्ध प्रस्तुति. जंगली में CHX परख द्वारा Deg1 -VU की गिरावट (बी) निर्धारण प्रकार और ubc7 कोशिकाओं. बार शून्य पर या CHX साथ 30 मिनट lysed गया और प्रोटीन 5-15% एसडीएस पृष्ठ. Deg1 -VU से अलग हो गए थे के बाद एकत्र कोशिकाओं विरोधी झंडा एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting द्वारा कल्पना की गई थी. G6PD धुंधला हो जाना एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य किया. Deg1 -VU व्यक्त (सी) ने संकेत उपभेदों, 20 घंटा के लिए एसडी पूर्ण या एसडी URA मीडिया में incubated रहे थे और 600 आयुध डिपो हर 15 मिनट मापा गया था. आयुध डिपो के 600 से बदल रहे हैं मूल्यों. (डी) एमडीटी प्रत्येक तनाव के लिए MDTcalc उपयोग कर की गणना की गई थी.

चित्रा 4
Ubc7 उत्परिवर्ती उपभेदों में Deg1 -VU चित्रा 4. मापने रिश्तेदार गिरावट दरों वाम:. डब्ल्यू आईएलडी-प्रकार, ubc7 Δ और संकेत दिया Ubc7 म्यूटेंट, बनाम समय की प्रतिकृति के दौरान मापा तब्दील 600 आयुध डिपो मूल्यों का प्लॉट,. Deg1 -VU व्यक्त कोशिकाओं एसडी URA माध्यम पर बड़े हो रहे थे और 600 आयुध डिपो हर ~ 15 मिनट मापा गया था. अधिकार: प्रत्येक तनाव के लिए एमडीटी MDTcalc उपयोग कर की गणना की गई थी.

1 / 52021fig5highres.jpg "चौड़ाई =" 500px "/>
चित्रा 5. उपन्यास degrons की पहचान और अलगाव के लिए एक उच्च throughput परख. (ए) Ura3-GFP-सीडीएनए रिपोर्टर की सुविधाओं के योजनाबद्ध प्रस्तुति. (बी) एक degron ले जाने खमीर उपभेदों के अलगाव के लिए प्रयोगात्मक चरणों का वर्णन एक फ्लो चार्ट. एक में वर्णित प्लाज्मिड पुस्तकालय एसडी लियू प्लेटों पर चयन के बाद Try467 कोशिकाओं में तब्दील हो गया था. कालोनियों एसडी लियू 5-FOA युक्त प्लेटें और तेजी से बढ़ रही कालोनियों को दोहराया गया एकत्र और एक आदेश सरणी में प्लेटों पर आयोजित किए गए. (सी) कालोनियों एसडी लियू या एसडी URA 20 घंटा के लिए मीडिया या तो में incubated रहे थे 5-FOA युक्त प्लेटों पर बढ़ी कि Ura3-GFP-सीडीएनए व्यक्त. आयुध डिपो के 600 MDTcalc सॉफ्टवेयर का उपयोग कर गणना की गई हर ~ 15 मिनट और कम से कम खमीर दुगनी समय (एमडीटी) मापा गया था कोई degron:. एक degron बिना Ura3-GFP व्यक्त एक प्लाज्मिड, जीआर के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता हैowth रेड लाइन:. नियंत्रण की एमडीटी मूल्य द्वारा निर्धारित सीमा.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ हम (gils) 'चुनिंदा परिस्थितियों में तरल संस्कृति में विकास कैनेटीक्स' करार दिया सापेक्ष प्रोटीन गिरावट दरों का निर्धारण करने के लिए सेल के विकास पर आधारित एक परख का वर्णन. इसे स्थापित करने के लिए सरल है डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण सीधा है और यह अत्यंत मॉड्यूलर है: gils परख के कई फायदे हैं. नतीजतन, gils उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए स्वचालन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि एक उपयोगकर्ता के अनुकूल बहु अच्छी तरह से थाली प्रारूप में कई नमूने को एक साथ लागू किया जा सकता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, gils अत्यधिक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रात्मक और मजबूत डेटा प्रदान करता है और सकारात्मक / नकारात्मक विकास के लिए चयन कि अगर प्लेट आधारित विकास assays के तुलना में अधिक लचीला है. इसके अलावा, gils प्रासंगिक यूपीएस घटकों या degrons की गतिविधि को दर्शाती है, यह प्रोटीन गिरावट दरों या स्थिर राज्य स्तर में छोटे बदलाव का पता लगा सकते हैं कि में अत्यधिक संवेदनशील है. अंत में, gils assays के growt की तुलना में (<12 घंटा) काफी कम विकास समय की आवश्यकताअगर प्लेट (आमतौर पर 2-4 दिन) पर ज assays के.

Gils परख प्रोटीन गिरावट के अध्ययन के लिए बहुत उपयोगी है, वहीं कई महत्वपूर्ण बातों को ध्यान में रखा जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, यह कारण तनाव-विशिष्ट विकास विशेषताओं के लिए एक isogenic खमीर तनाव पृष्ठभूमि का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, परख वैधता का पता लगाने के लिए, प्रत्येक परख समान परिस्थितियों में कम से कम तीन बार दोहराया जाना चाहिए, सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रारंभिक सेल घनत्व (600 आयुध डिपो), विकास तापमान, और सेल संस्कृति झटकों की तीव्रता बदल नहीं किया जाना चाहिए. इसलिए यह विशिष्ट परख प्रोटोकॉल दोहराया उपयोगों के लिए microplate रीडर के सॉफ्टवेयर में संग्रहीत किया जाता है की सिफारिश की है. Degron Ura3 भीतर तैनात है जहां विचार किया जाना चाहिए कि एक अतिरिक्त चर रहा है. Degron स्थिति सी 'या' एन क्षेत्रों में या तो स्थिति, अपने कार्य को निर्धारित कर सकते हैं जैसा अनुभव से परीक्षण किया जाना चाहिए.

संवाददाता prot की कैलिब्रेशनEin अभिव्यक्ति के स्तर भी gils के सफल आवेदन के लिए महत्वपूर्ण है. एक इष्टतम संवाददाता कुशलता से जांच के तहत प्रणाली द्वारा अपमानित किया जाता है और इस प्रकार uracil auxotrophy प्रदान करता है. हालांकि, auxotrophy में बदलाव भी ईमानदारी संवाददाता स्थिरता दर्पण चाहिए. इस gils (3B चित्रा) द्वारा निर्धारित अतिरिक्त जैव रासायनिक विधियों द्वारा निर्धारित संवाददाता प्रोटीन गिरावट दरें, और एमडीटी मूल्यों, के बीच संबंध की पूर्व परीक्षण से अनुभव से निर्धारित किया जा सकता है. एक आम समस्या एक पत्रकार के बेसल स्थिर राज्य अभिव्यक्ति एक सीमा स्तर तक पहुँच नहीं है जब उठता है और यह पूरी तरह से स्थिर है, तब भी जब एसडी URA पर विकास को सक्षम करने के लिए इस प्रकार बहुत कम है. ऐसी समस्या गिरावट को प्रभावित किए बिना बेसल प्रोटीन अभिव्यक्ति बढ़ जाती है कि एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण में संवाददाता अभिव्यक्ति रखकर दूर किया जा सकता है. ऐसी व्यवस्था में प्रमोटर गतिविधि सूक्ष्मता के कारण hig के लिए एसडी URA पर स्थायी विकास से बचने के लिए calibrated किया जाना चाहिएएच प्रोटीन का स्तर और यह आंशिक रूप से अपमानित होने पर भी रिपोर्टर एंजाइम गतिविधि. वे प्रोटीन अभिव्यक्ति की संवेदनशील विनियमन की अनुमति क्योंकि इस अध्ययन में वर्णित प्रमोटरों और अभिव्यक्ति की स्थिति को चुना गया: MET25p और CUP1 पी मेटाबोलाइट प्रेरित प्रमोटरों सूक्ष्मता methionine और तांबा, क्रमशः (तालिका 3) के नियंत्रण के माध्यम से देखते जा सकते हैं जो की गतिविधि कर रहे हैं.

(इस अध्ययन में वर्णित उन के रूप में) गुणवत्ता नियंत्रण संवाददाता substrates के Ura3 पृथक और अपने कार्य को रोकने सकता है कि intracellular समुच्चय फार्म कर सकते हैं. ऐसे एक मामले में uracil auxotrophy गलती से प्रोटीन गिरावट के परिणाम के रूप में व्याख्या की जा सकती है. कुल के विभिन्न degrons की प्रवृत्ति का परीक्षण करने के लिए, एक अतिरिक्त रिपोर्टर नियोजित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, degron स्क्रीन (चित्रा 5A) के लिए बनाया गया Ura3-GFP संवाददाता, prese में बढ़ कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा इंट्रासेल्युलर समुच्चय के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है5-FOA की nce. ये समुच्चय स्पष्ट रूप से घुलनशील प्रोटीन की फैलाना उपस्थिति से साफ़ कर रहे हैं कि के रूप में घने GFP foci प्रकट (नहीं दिखाया डेटा). Ura3-GFP-degron रिपोर्टर इसी तरह प्रोटीन सह स्थानीयकरण और subcellular वितरण पर degron के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी एक माध्यमिक स्क्रीन के रूप में 25, फ्लो द्वारा चयनित substrates की गिरावट निम्न के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Gils विधि की एक सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह पर्याप्त रूप से लचीला है और इस तरह आसानी के साथ साथ में वर्णित उन के अलावा आवेदनों की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, विधि भी विभिन्न परिस्थितियों में एंटीबॉडी की फिटनेस की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, एक गैर ubiquitylated एंटीबॉडी सब्सट्रेट ओर्निथिन decarboxylase (ODC) Ura3 से जुड़े हुए है जैसे. एक विशिष्ट स्थानीयकरण संकेत कार्यरत है जब विधि भी अलग intracellular डिब्बों में प्रोटीन गिरावट जांच कर सकता है.इस अध्ययन में Vma12 (आंकड़े 3, 4) ईआर झिल्ली को संवाददाता लंगर डाले. इसी तरह, एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस), ईआर प्रतिधारण संकेत (KDEL) या cytosol (एक विशिष्ट संकेत के अभाव) नियोजित किया जा सकता. विभिन्न intracellular डिब्बों में प्रोटीन गिरावट का एक साथ विश्लेषण सक्षम प्रणाली प्रोटीन गिरावट नेटवर्क कैसे काम के बारे में हमारी समझ पर गहरा प्रभाव हो सकता है. अंत में, चयन पद्धति के सिद्धांतों के अस्तित्व के लिए URA3 जीन उत्पाद की आवश्यकता होती है जो सभी मानव कोशिकाओं को बैक्टीरिया, से, अन्य मॉडल सेल आधारित प्रणाली में प्रोटीन गिरावट के अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate BD Biosciences 233520 For yeast growth on SD minimal media.  Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan
Ammonium sulfate Sigma - Aldrich A4418
Glucose Sigma - Aldrich 16325
Adenine Sigma - Aldrich A8626
Uracil Sigma - Aldrich U0750
Amino acids Highest purity available 
96-well plates Nunc 167008 Any other compatible brand can be used
Cyclohexamide  Sigma - Aldrich C7698 Working conc. 0.5 mg/ml
Infinite 200 PRO series Tecan For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used.
MDTcalc Experimental software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
  3. Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
  4. Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
  5. Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
  6. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  7. Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
  8. Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
  9. Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
  12. Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
  13. Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
  14. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
  15. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
  16. Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
  17. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  18. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
  19. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
  20. Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
  21. Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
  22. Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
  23. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
  24. Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
  25. Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).

Tags

सेलुलर जीवविज्ञान अंक 93 प्रोटीन गिरावट Ubiquitin एंटीबॉडी बेकर की खमीर विकास कैनेटीक्स दुगनी समय
प्रोटीन गिरावट के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए रिपोर्टर-आधारित विकास परख
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G.,… More

Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation. J. Vis. Exp. (93), e52021, doi:10.3791/52021 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter