Abstract
Der Proteinabbau durch das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für Proteinhomöostase in allen Eukaryonten. Die Standardmethode zur Bestimmung der intrazellulären Proteinabbaus beruht auf biochemischen Assays für folgende die Kinetik der Proteinniedergang. Solche Verfahren sind oft umständlich und zeitaufwendig und daher nicht zugänglich sind Versuche zur Beurteilung mehrere Substrate und Abbaubedingungen ab. Als Alternative wurden Zellwachstum basierenden Assays entwickelt worden, die sich in ihrer herkömmlichen Format Endpunktassays, die nicht quantitativ relativen Veränderungen in der Proteinspiegel zu bestimmen können.
Hier beschreiben wir eine Methode, die originalgetreu bestimmt Veränderungen in der Proteinabbauraten durch Kopplung an Hefezelle-Wachstumskinetik. Das Verfahren basiert auf einem System, in dem festgelegten Auswahl Uracil-Auxotrophie des URA3 -deleted Hefezellen durch eine exogen exprimierten Reporterproteins gerettet basierend, Einer Fusion zwischen dem wesentlichen URA3-Gen und einem Abbau Determinante (Degron) besteht. Das Reporterprotein ist so ausgelegt, dass ihre Syntheserate konstant ist, während seine Abbaurate wird durch die Degron bestimmt. Zellwachstum in Uracil-defizientem Medium proportional zu der relativen Pegel Ura3 sind Wachstumskinetik völlig abhängig von der Reporter-Protein-Abbau.
Diese Methode misst genau Veränderungen der intrazellulären Proteinabbau Kinetik. (A) Die Beurteilung der relative Beitrag der bekannten Ubiquitinkonjugierenden Faktoren Proteolyse (b) E2 konjugierende Enzym Struktur-Funktions-Analysen (c) Identifizierung und Charakterisierung von neuen degrons: Es wurde angewandt. Anwendung des degron- URA3 -basierten System überwindet die Abbaufeld Protein, wie es auch zur Überwachung von Veränderungen der Proteinspiegel mit Funktionen der anderen zellulären Wege angepasst zu werden.
Introduction
Das Ubiquitin-Proteasom-Abbausystem ist ein Hauptregulierungs Maschine, die bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Protein in Eukaryoten beteiligt ist. Der UPS-Konjugate zunächst mehrere Ubiquitin-Moleküle an ein Zielprotein nach der die Poly-Ubiquitin-markierten Protein durch das 26S Proteasom abgebaut. In den meisten Fällen ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Ubiquitin-vermittelten Abbau Substrat Ubiquitinierung von E2 konjugierenden Enzyme und Liga E3-Enzymen (E3 Ligasen) 1. Folglich intrazelluläre Stabilität spezifischer Proteine spiegelt ihre Anfälligkeit für Ubiquitin-Konjugation und die Aktivität ihres zugehörigen Ubiquitinierung Enzyme.
E3-Ligasen sind die Hauptsubstraterkennung Komponenten des UPS. Als solche sind diese Enzyme erkennen degrons innerhalb ihrer Substrate, die entweder nicht vorhanden oder nicht in ihrer stabilen Gegen 2 ausgesetzt sind. Zum Beispiel sind viele Regulatoren des Zellzyklus must synthetisiert und in einer zeitlich bestimmten Weise, um die Zellzyklusprogression in Ordnung zu halten abgebaut werden. Der Abbau dieser Proteine wird häufig durch Phosphorylierung gesteuert durch zelluläre Signale regulierte Kinasen 3,4 vermittelt. Auf der anderen Seite, sind aberrant-gefaltete Proteine durch kryptische degrons anerkannt. Dies sind Bereiche, die normalerweise in der nativen Struktur verborgen sind und werden beim Aufbau Störung ausgesetzt. Solche degrons gehören hydrophoben Domänen 5-7 und intrinsisch ungeordneten Segmente 8.
Da der Samen Entdeckung des Ubiquitin-Proteinabbau und Charakterisierung der Grundlagen in Retikulozyten-Lysaten 9 war Hefegenetik an der Entdeckung von vielen der Komponenten des Ubiquitin-Systems 10. Der Erfolg von Hefe als Modellorganismus für die systematische Analyse von Proteinabbau durch die USV ist vor allem aufgrund der Tatsache, dass die USV ist hochly konserviert in allen Eukaryoten 4, verbunden mit ihrer Zugänglichkeit als Versuchssystem. Tatsächlich werden auf Hefe basierenden Systemen üblicherweise verwendet, um die Wirkmechanismen der Ubiquitinierung Maschinen entziffern.
Studieren Proteinabbau durch biochemische Mittel erfordert in der Regel Herstellung von Zellextrakten. Während tierische Zellproteinen kann unter relativ milden Bedingungen, die Proteinwechselwirkungen und Funktion zu erhalten extrahiert werden, das Vorhandensein eines robusten Zellwand der Hefe 11 benötigt deutlich härteren Bedingungen, die Störung der Proteingewinnung beeinflussen können. Tatsächlich unterschiedliche Verfahren für Hefe Zellaufschluss variieren erheblich in ihrer Fähigkeit, intakte Proteine in Mengen, die ihre relative Zellüberfluss korrekt darstellen zu erholen. Weitere Ungenauigkeit ist inhärent in den verschiedenen zur Bestimmung Abbauraten von spezifischen Proteinen angewandten Methoden: Metabolische Markierung basierten 'Pulse-Chase-Experimente, gefolgt von immunoprecipitation, um spezifische Proteine 12 zu isolieren, ist häufig nicht streng quantitativ. Somit wird, wenn Proteinabbau wird durch dieses Verfahren im Vergleich, extra Vorsicht bei der Interpretation der Ergebnisse geboten. Um diesen Nachteil zu umgehen, kann eine alternative Cycloheximid (CHX) chase Assay verwendet werden 12. In diesem Assay wird die Übersetzung Inhibitor-Zellkulturen und zeitlichen Veränderungen der Protein stationären Ebenen hinzugefügt werden anschließend überwacht. Dennoch ist die Verwendung von CHX Proteine mit relativ kurzen Halbwertszeiten (<90 min), als langfristige Hemmung der Proteinsynthese ist zytotoxisch beschränkt. Bemerkenswert ist, beide der oben genannten Tests erfordern die Verwendung von Protein-spezifischen Antikörpern, die nicht immer verfügbar sind.
Um diese technischen Einschränkungen zu überwinden, haben die Forscher mehrere Ansätze, die nicht Zellextraktion und direkte Protein Handhabung erfordern entwickelt. Ein Ansatz basiert auf der Einrichtung von auxotrophen yea basiertst Stämme, durch die Deletion von Genen wesentlichen metabolischen Enzyme codieren, erhalten werden. Solche Gene umfassen HIS3, LEU2, LYS2 und TRP1, kodierend für Enzyme, die für die Aminosäure-Biosynthese erforderlich ist, als auch URA3, die OMP-Decarboxylase codiert (Ura3), ein essentielles Enzym der Pyrimidin-Biosynthese Ribonukleotid. Ura3 wurde vielfach in der Proteinabbaustudien eingesetzt. In diesen Assays rettet konstitutive Expression Ura3 Wachstum von Zellen in ura3 Uracil-Mangelmedium 13. Folglich Destabilisierung Ura3 durch die Fusion einer Degron kann das Zellwachstum auf Minimalmedium ohne Uracil verringern. Diese Methode wurde in verschiedenen Proteinabbaustudien eingesetzt, einschließlich der Festlegung von Abbaufaktoren 5, E3 Ligasen 14 und Hilfs Ubiquitinierung Faktoren 15 und die Entdeckung von neuen USV degrons 16. Alle diese Verfahren verwendet das Zellwachstum auf Agarplatten als Testanzeige. Jedoch ter Wachstumskriterium (positive / negative Wachstum), während robuste und effiziente, ist meist qualitative und nicht quantitative Informationen, die wichtig für die Bewertung Potenz eines Degron oder den relativen Beitrag der verschiedenen Hilfsabbaufaktoren ist.
Wir haben daher entwickelt und verwendet Hefevektoren und Screeningverfahren zur systematischen und quantitativen Analyse der Proteinabbau durch das URA3 -degron Fusionssystem. Das Protokoll basiert auf einer einfach zu handhabenden Test, der Wachstumskinetik misst in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL) und auf der Erzeugung von Standardwachstumskurven. Lag die exponentielle (log) und der stationären Phase - Hefe Wachstumskinetik werden durch drei Hauptphasen gekennzeichnet. Berechnung der Hefe-Replikations Kinetik während der log-Phase unter selektiven Bedingungen, die durch die Höhe der Expression des URA3-Degron bestimmt wird, liefert eine objektive quantitative Messung of Proteinabbau. Dieses Verfahren kann zum Messen und Vergleichen Abbauraten von mehreren UPS Substrate gleichzeitig in mehrere Stämme und unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden.
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Protocol
1. Zellkultur
- Transformation der geeigneten auxotrophen Hefe-Zellen, wie Try467 (Tabelle 2), die mit einem Plasmid, enthaltend (a) ein URA3 -degron Fusion und (b) einer zusätzlichen Stoffwechselmarker für Plasmidselektion und Wartung.
HINWEIS: Ein Beispiel für ein geeignetes Plasmid ist YDpK-MET25p-deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Dies ist eine Hefe integrative Plasmid ein Fusionsprotein bestehend aus deg1 enthält - eine Degron aus der Hefe-Transkriptions abgeleitet. Faktor Mat2 17, FLAG-Epitop - zur Detektion durch Immunoblotting Vma12 - einem stabilen ER-Protein und Ura3 15,18 (Abbildung 3A). (Siehe Tabelle 3 für die Plasmide in dieser Studie und zusätzliche Beispiele für geeignete Plasmide verwendet.) - Für Plasmid Auswahl und Wartung, halten Zellen in Agar-Platten unter einem geeigneten Kunst Defined (SD) Medium ohne Aminosäure Selektionsmarker
- Wachsen Zellen O / N bei 30 ° C in einem geeigneten selektiven Medium für SD Plasmids, bis eine stationäre Phase erreicht ist. Wachsen die Zellen in Teströhrchen oder in einer Platte mit 96 Vertiefungen, abhängig von der Anzahl von Proben (Abschnitt 2) untersucht werden.
2. Zellpräparation für Analysis
- Wenn eine kleine Anzahl von Proben (N≤15) werden untersucht werden, verdünnt, die Zellen und Ersetzen des Mediums wie folgt:
- Verdünnte 50 ul Zellen aus einem O / N-Kultur mit 150 & mgr; l SD-Medium pro Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen (clear bottom). Beachten, die erste Probe bezeichnet als Leer enthält nur Medium.
- Bestimmen Sie die OD 600 Werte der Proben in der 96-Well-Platte mit Hilfe eines Mikroplatten-Reader.
- Berechnung des tatsächlichen OD 600 in jeder Vertiefung durch Multiplizieren der OD 600 Lesen durch den Verdünnungsfaktor (x4), von whICH den Wert der Blindwert subtrahiert. Normalisierung der resultierenden Werte durch Dividieren durch 0,55, um eine berechnete Pfadlänge von 1 cm nach dem Beer-Lambert Gesetz erhalten. Hinweis, dieser Wert konstant ist, wenn die Messung der OD 600 von 200 ul der Zellen in einem Standard-96-Well-Platte.
- Berechnet das genaue Volumen zum Erhalten Hefezellen bei äquivalenten Menge bis zu einer OD 600 von 0,25 und sie auf ein Eppendorf-Röhrchen benötigt.
- Spin-down der Zellen bei hoher Geschwindigkeit (12.000 xg) für 1 min.
- Entfernen Sie den Überstand und die Zellen resuspendieren in 1 ml des entsprechenden Selektionsmedium (siehe Abschnitt 3.1), um OD erhalten 600 von 0,25.
- Transfer 200 ul der verdünnten Stämme zu einer neuen Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen.
- Wenn eine große Anzahl von Proben (N> 15) getestet werden soll, verdünnt, die Zellen und das Medium ohne vorherige OD 600 Messung ersetzt, wie folgt:
- Transfer 10 ul stationären Zellengrown O / N in einer 96-Well-Platte in eine neue 96-Well-Platte mit 190 ul (Verdünnung 1:20) der geeigneten selektiven Medien (siehe Abschnitt 3.1).
3. Wachstum Kinetics in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen (GIL)
- Verwenden Sie die folgenden Medien für Wachstum Messungen mit dem Ura3-Degron Reporter:
- Für positive Kontrollen von Hefe Wachstum unter Nicht restriktiven Bedingungen, die Verwendung Plasmid selektive SD-Medien (siehe Abschnitt 1.2). Wenn keine Plasmid-Selektion erforderlich ist, beispielsweise bei Verwendung eines integrativen Plasmid wie deg1 -UV, SD-Medium, das alle erforderlichen Aminosäuren (SD vollständig) können verwendet werden.
- Für experimentelle Proben Mess Wachstum unter restriktiven Bedingungen, verwenden Sie SD-URA Medium.
- Stellen Sie einen Multimode-Mikroplatten-Reader zu:. Einer Inkubationstemperatur von 30 ° C, OD 600 Messintervallen von 15 min und einer Orbital und lineare Schütteln Zyklen von 1 min alle sieben min <br /> Hinweis: Diese Dual-Mode-Schütteln wurde optimiert, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erhalten; jedoch können auch andere Modi Schütteln oder sogar kein Schütteln so gut funktionieren.
- Inkubieren der Zellen bei 30 ° C in einem Mikroplattenleser O / N oder bis die Zellen die stationäre Phase (12-24 h) erreicht.
- Exportieren Sie die Rohdaten in ein Tabellenkalkulationsdatei.
- Bestimmen Sie das Wachstum der Hefe Kinetik mit MDTcalc, eine maßgeschneiderte Software, die die minimale Zeit berechnet (in h) für Zellen, ihre Populationsgröße verdoppeln (Minimal Verdopplungszeit (MDT); für Details siehe Abschnitt 4).
4. Berechnung des Minimal-Verdopplungszeit (MDT): Grundsätze der MDTcalc Algorithm
HINWEIS: Grundsätze der MDTcalc Algorithmus unter Verwendung einer repräsentativen Auswahl von Try467 Hefezellen (Tabelle 2) in SD-Medium gezüchtet abgeschlossen, sind in Tabelle 1 und Figur 1 dargestellt, die eine Datentabellenkalkulation und Wachstumsgrund, respectiv.
- Subtrahieren OD 600 Blindwerte in die entsprechende Wanne erhalten wird, von jeder der in der Probenwerte erhalten. Teilen die resultierenden Differenzen von 0,55 (für 96-Well-Platten), um die Lichtpfadlänge zu korrigieren. Zeichnen Sie die endgültigen Werte (Tabelle 1, Trans.) Gegen die Zeit, um die tatsächliche Hefe Wachstumskurve (OD 600 / h) (1A) zu produzieren.
- Log 2 (OD 600) für jeden der transformierten Werten zu berechnen, um die logarithmische Wachstumsphase in eine lineare Kurve (1B) zu konvertieren.
- Berechnen der Steigung einer 10 Zeitpunkte Intervall (N = 10), beginnend bei der Zeit 0 und Bewegen von einem Zeitpunkt, zu einer Zeit, bis N <10 (Tabelle 1, Slope; 1C).
- Berechnung der inversen Wert jeder Steigung, die Zeit für die Zellpopulation erforderlich ist, um doppelt zu erhalten (Tabelle 1, 1 / Steigung; 1C). Berechnen Sie die minimale1 / Slope-Wert, um die MDT (; 1C Tabelle 1, schwarzes Rechteck) zu bestimmen. Entpacken Sie die berechnete MDT für Zellen in der Probe (Tabelle 1, 1 / Slope, schwarzes Rechteck) aus dem gewählten Zeitintervall (Tabelle 1, durch rotes Rechteck skizziert, 1B, 1D).
HINWEIS: Die Geschwindigkeit des Zellwachstums auf SD-URA Medium ist umgekehrt proportional zu der MDT.
5. Mit MDTcalc
- Kopieren Sie die Programmdateien ergänzt in einem bestimmten Ordner auf dem Computer.
- Stellen Sie sicher, das Tabellenkalkulationsdatei, die die Wachstumsdaten gespeichert und geschlossen. Öffnen Sie die MDTcalc Anwendungsprogramm, um den Startbildschirm erscheint sehen.
- Legen Sie die erforderlichen Informationen, wie in Abbildung 2 gezeigt:
- Unter "Dateipfad", klicken Sie auf das Rechteck über das Recht auf die Kalkulationstabelle Datei zu suchen.
- Unter "Blattname", schreiben die Tabelle Namen, wo ter Rohdaten befindet.
- Unter 'Startposition', legen Sie die Tabellenkalkulation Koordinate Zeitpunkt 0 der ersten Probe.
- Unter 'Time Spalte ", legen Sie die Buchstaben die Festlegung des Orts der Zeitpunkt Spalte (Zeit sollte in Sekunden zur Verfügung gestellt werden).
- Unter 'Blank Spalte ", legen Sie die Buchstaben definieren die Position der leeren Spalte (in der Regel, aber nicht notwendigerweise in A1 der 96-Well-Platte).
- Unter 'OD-Wert ", wählen Sie den minimalen transformiert OD 600-Wert für die Einleitung der MDT Berechnung (in der Regel 0,15-0,25) erforderlich. Wird dieser Wert verhindert Berechnungen der MDT für Kulturen in Lag-Phase wegen zu hoher Verdünnung, so dass MDT ist nur für Proben, die den definierten OD 600-Wert oder höher zu erreichen, berechnet.
- Sobald der letzte Wert eingegeben wurde, drücken Sie die "berechnen" -Button am unteren Rand des Bildschirms. Stellen Sie sicher, dass der Fortschrittsbalken auf der rechten Seite allmählich in gReen. Die Kalkulationstabellendatei während des Rechenprozesses nicht öffnen.
- Exportieren der zwei Sätze von Daten, die automatisch auf dem Bildschirm bei der Beendigung der Berechnung MDT in ein Arbeitsblatt angezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Daten enthält: Start (a) die MDT-Wert für jeden gut, dass die minimale OD-Wert-Test (wie in Abschnitt 5.2.1.6 festgelegt) und (b) den Anfangszeitpunkt des Intervalls aus dem die MDT berechnet gibt ( Zeit).
- Legen Sie die erforderlichen Informationen, wie in Abbildung 2 gezeigt:
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Representative Results
Untersuchung der Rolle der Enzyme der Doa10 Weg zum Abbau eines Reportersubstrat
Um die Gültigkeit der GIL Verfahren wurde mit einem herkömmlichen Assay Abbau verglichen zu testen. Dieses Experiment beurteilt die relativen Beitrag der Komponenten der ER-Membran lokalisiert Doa10 E3-Ligase-Komplex 20,21 zum Abbau des Proteins Qualitätskontrolle Reportersubstrat Deg1- VU (3A). Die Deg1- VU Plasmid wurde in Wildtyp-Zellen oder in Zellen fehlt das Gen für das E2 konjugierende Enzym integriert wurde UBC7 (ubc7) und Proteinstabilität anschließend durch eine CHX Chase Assay 6 bestimmt. Anti-Flag Immunoblotting zeigte eine stabile deg1 -Vu Proteinbande in ubc7 Zellen, die in Wildtyp-Zellen (3B) fehlte. Das Fehlen von deg1 -Vu in Wildtyp-Zellen ist attribuTed seiner kontinuierlichen Abbau, der in ubc7 Zellen abgeschafft wurde, was darauf hinweist, dass deg1 -Vu Stabilität ist stark abhängig von Ubc7.
Offensichtlich ist der Abbau von Deg1- VU schnell. Jedoch kann die relative Geschwindigkeit des Abbaus nicht durch eine CHX-Test bestimmt werden, da das Protein nicht nachweisbar in Wildtyp-Zellen von Anfang an. Folglich wurde der neu entwickelten GILS Testverfahren eingesetzt, um die relativen Unterschiede in der Kinetik der Proteinabbau zwischen Wildtyp und verschiedene Mutantenstämme (3C) zu vergleichen. Zunächst wurden Wildtyp, ubc6, ubc7 oder doa10 exprimierenden Zellen deg1 -Vu auf SD Vollmedium gewachsen. Zur Messung Gils wurden die Zellen gewaschen und in SD-URA inkubiert. MDT Berechnung wurde wie in dem Protokoll beispielhaft ausgeführt. 3C, 3D zeigen ähnliche Wachstumskurven und berechnet MDT (~ 2,5 h) für alle Stämme in SD abgeschlossen, excludi gezüchtetng die Möglichkeit, dass die Streichung von einem der untersuchten Gene beeinflusst Zellwachstum. Dagegen Inkubation in SD-URA zu schlechten Wachstum der Wildtyp-Zellen (MDT = 6,34), wohingegen nur eine geringe Wachstumsdefekt wurde in den mutierten Stämmen (MDT ~ 3 h) beobachtet.
Untersuchung der Wirkung verschiedener Mutanten des E2 konjugierenden Enzyms Ubc7 auf den Abbau von Deg1- VU
Die Tatsache, dass Ubc7 ist absolut Deg1- VU Abbau erforderliche ermöglicht eine genaue Beurteilung der auch teilweise Wirkungen verschiedener E2 Mutanten, da die Versuchsbereich des Systems ist sehr breit. Dementsprechend wurden Plasmide, die Wildtyp oder Mutante UBC7 in Ubc7 exprimierenden Zellen deg1 -Vu und ihren Beitrag zum Abbau wurde von Gils bestimmt integriert. Wie erwartet, wurden schnell Wachstumskinetik in Zellen, die Ubc7 mit dem aktiven Zentrum mu beobachtetnern C89S und N81A 22 (Figur 4). Zusätzlich vorhergesagten zwei Mutanten, indirekt behindern deg1 -Vu Abbau (V25G und H94K) getestet. Diese Mutationen auch verbesserte Zellwachstum im Vergleich zum Wildtyp Ubc7, wenn auch in geringerem Maße als den aktiven Ort Mutanten (durchschnittliche MDTs von 3,4 h für V25G und H94K Vergleich zu durchschnittlichen MDTs von 2,7 h für C89S und N81K) (Abbildung 4 ). Somit kann die GILS Verfahren zur genauen Messung der relative Beitrag der verschiedenen Verschlechterungsfaktoren für die Stabilität eines Reportersubstrat verwendet werden.
Isolierung und Evaluierung neuer degrons
Die GIL System wurde ebenfalls in einem Hochdurchsatz-Screening-Format neuartige degrons Identifizierung und Quantifizierung ihrer relativen Potenz, das heißt, das Ausmaß, in dem sie veran Abbau (Figur 5) eingesetzt. Um die Identifizierung von bona fide degrons optimieren, eine zusätzlicheSelektionsschritt, das Wachstum in Gegenwart von Fluororotsäure (5-FOA) ist, zugegeben. Ura3 effizient wandelt 5-FOA in eine toxische Verbindung (5-Fluorouracil), die als eine positive Selektion zur Isolierung von Hefestämmen, wo Ura3 destabilisiert 16,23 dienen kann. Neuartige degrons identifizieren, wurde eine Bibliothek von Reporter-Plasmide durch Verschmelzen Zufallsfragmente aus einer Hefe-cDNA-Bibliothek, um Ura3-GFP-Plasmid 24 (5A) abgeleitet erzeugt wird. Das GFP-Einheit wurde um einen zweiten Bildschirm aktivieren und geben Auskunft über die Lokalisierung des Fusions Degron (siehe Diskussion) aufgenommen. Die Bibliothek wurde in Hefe transformiert und dann in Anwesenheit von 5-FOA (5B), und positive Klone ausgewählt wurden isoliert und auf Agar-Platten in einer 96-Well-Plattenformat Wieder ausgesät. Jede Kolonie wurde in 96-Well-Platte, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben übertragen, inkubiert O / N, und verdünnt in einem neuen 96-Well-Platte. Es wird erwartet, dass das Wachstum von Zellen in SD-URA Mediumwird mit dem Grad der Ura3 Ausdruck, der das Ergebnis des Degron Potenz, um den Abbau zu induzieren korrelieren. Dieser wurde in der Folge durch die Anwendung Gils (5C) bestätigt. Wir bestätigten, dass alle nach dem Zufallsprinzip ausgesuchten Kolonien, die mit 5-FOA-pre ausgewählt wurden, zeigten ähnliche MDT Werte, auf SD-Leu-Medium (5C, leere Balken). Im Gegensatz dazu zeigten alle Klone variable Wachstumsraten auf SD-URA, die deutlich langsamer als Zellen, die Steuer Ura3-GFP (Daten nicht gezeigt) waren. Wie angedeutet, gibt es eine inverse Beziehung zwischen Wachstumsrate auf SD-URA und MDT. Je höher also die MDT ist die Degron desto potenter. Tatsächlich waren alle MDTs von positiv selektierten Klonen abgeleitet höher als die der Kontrolle (über der roten Linie) (5C, gefüllte Balken).
<strong> Tabelle 1 Illustration der Berechnung von Hefe MDT. Zeiteinheiten sind Stunden (h). Blank und Probe sind von OD 600 liest. Transformation (Trans.) ist der OD 600-Wert nach lassen Subtraktion und Pfad-Längenkorrektur. Anmelden 2 wird aus den transformierten Daten berechnet. Slope ist das Log 2 (OD 600) aufeinanderfolgende Werte innerhalb der Intervalle von 10 Zeitpunkten dividiert durch die Zeit. 1 / Steigung ist die Zeit der Zellpopulation erforderlich ist, um sich selbst zu duplizieren. schwarzes Rechteck markiert das MDT Wert. rotes Rechteck markiert den Zeitintervall, aus dem die MDT wurde berechnet.
| Hefe | Genotyp | Quelle |
| TRy467 | α, his3Δ1, lys2Δ0, ura3Δ0, leu2Δ0 | EUROSCARF |
| TRy508 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2 | Diese Studie |
| TRy528 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [N81A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Diese Studie |
| TRy530 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [C89S] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Diese Studie |
| TRy532 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [H94K] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Diese Studie |
| TRy556 | α, his3-Δ200 :: pRS303 :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7Δ :: LEU2 | Diese Studie |
| TRy563 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 Δ :: LEU2, ubc6Δ :: KanMX | Diese Studie |
| TRy633 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7 [V25A] -3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1- 1, ubc7Δ :: LEU2 | Diese Studie |
| TRy786 | α, his3-Δ200 :: pRS303 / Ubc7prom-Ubc7-3HA :: HIS, leu2-3,112, ura3-5, lys2-801 :: MET25-deg1-Flag-Vma12-Ura3 :: LYS, trp1-1, ubc7 :: LEU, doa10Δ :: HIS3 | Diese Studie |
Tabelle 2: Liste der Hefestämme in dieser Studie verwendet.
| Plasmide in dieser Studie verwendet | ||
| Plasmid | Relevante Marker | Quelle |
| pTR717 | YDpK-MET25p-deg1-Flag-Vma12-Ura3 (integrative Plasmid, das Lys1) | Diese Studie |
| pTR1412 | pRS315-CUP1p-URA3-HA-GFP (LEU) | Diese Studie |
| Zusätzliche geeignete Reporterplasmide | ||
| Plasmid | Relevante Marker | Quelle |
| pOC9-CL1 | pOC9-CUP1p-HA-URA3 (TRP1) | (17) |
| URA3-2 (GFP) | pPS414-TRP1p-MYC-ura3-2-GFP | Lewis und Pelham |
Tabelle 3. Liste der Plasmide in dieser Studie verwendet. Referenz:. Lewis, MJ & Pelham, HR Ineffiziente Qualitätskontrolle von wärmeempfindlichen Proteinen an der Plasmamembran PLoS One 4, e5038, doi: 10.1371 / journal.pone.0005038 (2009).
Abbildung 1. Grundlagen der Berechnung des MDT. Try467 Hefezellen bei einer OD 600 von 0,22 wurden in Komplettmedium SD für den angegebenen Zeitraum inkubiert. OD 600 Messungen wurden alle ~ 15 min entnommen und die Daten wurden in ein Tabellenkalkulations gesammelt. (A) transformierten OD 600 Werte aus Tabelle 1 gegen die Zeit aufgetragen. (B)Melden 2 von OD 600 gegen die Zeit aufgetragen Rote Linie:. Markiert das Zeitintervall, aus dem die MDT berechnet wurde (D). (C) Hefe Wachstumsrate (Steigung) wurde durch Messung der Veränderungen der OD 600 von aufeinanderfolgenden 10 Zeitpunkten (unter der Annahme, Linearität) über die Zeit berechnet Startzeit:. Die Zeit, aus der Berechnung initiiert wurde. (D) Die für Hefe erforderlich, um doppelte Zeit ist der Kehrwert der Steigung von (C) (1 / Slope) MDT:. Der berechnete Minimal Verdopplungszeit (in h).
Protokoll Abschnitt 5.1: Abbildung 2. MDTcalc Bildschirm starten. Typische Eingangswerte angezeigt eingegeben werden.
Abbildung 4. Messung der relativen Abbauraten deg1 -Vu in Ubc7 Mutantenstämme. Links: Plot der transformierten OD 600 Werten, bei der Replikation w ild-Typ ubc7 Δ und die angegebenen Ubc7 Mutanten, als Funktion der Zeit gemessen. Exprimierenden Zellen deg1 -Vu wurden auf SD-URA-Medium und OD 600 wurde alle ~ 15 min gemessen. Rechts: Die MDT für jeden Stamm wurde berechnet unter Verwendung MDTcalc.
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Figur 5. Ein Assay mit hohem Durchsatz zur Identifizierung und Isolierung neuer degrons. (A) Schematische Darstellung der Merkmale des URA3-GFP-cDNA-Reporter. (B) ein Flußdiagramm, das die experimentellen Schritte zur Isolierung von Hefe-Stämmen, die eine Degron. Die in A beschriebenen Plasmid Bibliothek wurde in Try467 Zellen, gefolgt von Selektion auf SD-Leu-Platten umgewandelt. Kolonien wurden auf SD-leu-Platten, enthaltend 5-FOA und schnell wachsenden Kolonien repliziert wurden gesammelt und auf Platten in einer geordneten Anordnung organisiert. (C) Kolonien ausdrücken Ura3-GFP-cDNA, die auf Platten, die 5-FOA wurden entweder in SD-LEU oder SD-URA-Medium für 20 Stunden inkubiert wuchs. OD 600 wurde jeden ~ 15 min und der minimalen Hefe Verdopplungszeit (MDT) wurde berechnet unter Verwendung der Software vorhanden MDTcalc Degron. Ein Plasmid, das Ura3-GFP ohne Degron, dient als positive Kontrolle für growth Rote Linie:. Schwelle durch die MDT-Wert der Kontrolle bestimmt.
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Discussion
Hier beschreiben wir einen Test auf Basis von Zellwachstum zur Bestimmung der relativen Proteinabbauraten, genannt 'Wachstumskinetik in Flüssigkultur unter selektiven Bedingungen "(GIL). Die Gils Assay hat mehrere Vorteile: Es ist einfach einzurichten, Datenerfassung und Analyse ist einfach und es ist extrem modular ist. Folglich GILS können gleichzeitig mehrere Proben in einer benutzerfreundlichen Multi-Well-Plattenformat, die angepasst werden können, um für Anwendungen mit hohem Durchsatz Automatisierung verwendet werden. Am wichtigsten ist, bietet Gils hoch reproduzierbare, quantitative und robuste Daten und ist flexibler als Agar-Platte auf der Basis-Wachstumsassays, die für positive / negative Wachstums auszuwählen. Darüber hinaus ist Gils, dass es kleine Abweichungen in der Proteinabbauraten oder stationären Ebenen erfassen hochempfindlich, was die Aktivität der betreffenden USV-Komponenten oder degrons. Schließlich Gils Assays erfordern deutlich kürzere Wachstumsperioden (<12 h) im Vergleich zu growth Assays auf Agarplatten (üblicherweise 2-4 Tage).
Während die Gils Assay ist sehr nützlich für das Studium der Proteinabbau, sollten einige wichtige Aspekte berücksichtigt werden. Zum Beispiel ist es wesentlich, eine isogene Hefestamm Hintergrund aufgrund Stamm-spezifische Wachstumseigenschaften zu verwenden. Ferner sind Test Gültigkeit festzustellen, wobei jeder Test mindestens drei Mal unter identischen Bedingungen wiederholt werden, vor allem die Anfangszelldichte (OD 600), Wachstumstemperatur und Zellkultur Schüttelintensität sollte nicht geändert werden. Es wird daher empfohlen, daß die spezifischen Assay-Protokoll ist in der Software für die wiederholte Verwendung des Mikroplattenleser gespeichert. Eine zusätzliche Variable, die berücksichtigt werden sollte, ist, wo die Degron innerhalb Ura3 positioniert. Wie der Degron Position kann ihre Funktion zu bestimmen, die Positionierung entweder am C 'oder N' Regionen müssen empirisch überprüft werden.
Kalibrierung von Reporter protEin Expressionsniveau ist auch entscheidend für die erfolgreiche Anwendung von Gils. Eine optimale Reporter ist eine, die wirksam durch das untersuchte System abgebaut wird, und verleiht somit Uracil-Auxotrophie. Allerdings sollten Abweichungen in Auxotrophie auch spiegeln getreu dem Reporter Stabilität. Dies kann empirisch durch vorherige Prüfung der Korrelation zwischen Reporterprotein Abbauraten, durch zusätzliche biochemische Methoden bestimmt und MDT-Werte, von Gils (3B) bestimmt werden. Ein häufiges Problem entsteht, wenn die Basis stationären Expression eines Reporter nicht einen Schwellenwert erreichen, und ist daher zu gering, um das Wachstum auf SD-URA, selbst wenn es vollständig stabilisiert ist, zu ermöglichen. Ein solches Problem kann durch Anordnen der Reporter-Expression unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors, der basalen Proteinexpression erhöht ohne Beeinträchtigung Abbau überwinden. Promotoraktivität in solchen Systemen sollte fein kalibriert, um dauerhaftes Wachstum auf SD-URA vermeiden aufgrund high-Proteinspiegel und Reporter-Enzym-Aktivität, auch wenn es teilweise abgebaut ist. Die in dieser Studie beschriebenen Promotoren und Expressionsbedingungen wurden ausgewählt, weil sie erlauben feinfühlige Regelung der Proteinexpression: MET25p und CUP1 p Metabolit-induzierte Promotoren die Aktivität von denen fein durch Steuerung von Methionin und Kupfer (Tabelle 3) abgestimmt werden.
Qualitätskontrollreportersubstrate (wie die in dieser Studie beschrieben) können intrazelluläre Aggregate, Ura3 maskieren und seine Funktion beeinträchtigen könnten bilden. In einem solchen Fall kann Uracil-Auxotrophie irrtümlich als Ergebnis der Proteinabbau interpretiert werden. Um die Tendenz der verschiedenen degrons Testen zu aggregieren, sollte eine zusätzliche Reporter verwendet werden. B. URA3-GFP-Reporter für die Degron Bildschirm (5A) ausgebildet ist, ermöglicht die Visualisierung der intrazellulären Aggregaten durch Fluoreszenzmikroskopie von Zellen, die in der Presence von 5-FOA. Diese Aggregate erscheinen als dichte Foci GFP, die deutlich von der diffuse Erscheinungsbild des löslichen Proteins sind (Daten nicht gezeigt). URA3-GFP-Degron Reporter können in ähnlicher Weise verwendet, um die Wirkung des Proteins auf Degron Co-Lokalisation und subzelluläre Verteilung zu bestimmen. Es kann auch für den Abbau von folgenden ausgewählten Substraten durch Flusszytometrie als Sekundärbild 25 verwendet werden.
Ein besonders signifikanter Vorteil der GIL Verfahren ist, dass es ausreichend flexibel und kann somit leicht in einer Vielzahl von Anwendungen zusätzlich zu den im hier beschriebenen angepaßt werden. Beispielsweise kann das Verfahren auch für die Untersuchung der Eignung des Proteasoms unter verschiedenen Bedingungen verwendet werden. In diesem Fall wird ein nicht-ubiquitinierten Proteasom Substrat wie Ornithin-Decarboxylase (ODC) nach Ura3 fusioniert. Das Verfahren kann auch den Proteinabbau zu testen in verschiedenen intrazellulären Kompartimenten, wenn eine bestimmte Lokalisationssignal verwendet wird.In dieser Studie Vma12 verankert den Reporter an die ER-Membran (3, 4). Ebenso kann ein Kernlokalisierungssignal (NLS), ER-Retentionssignal (KDEL) oder Cytosol (Fehlen eines spezifischen Signals) verwendet werden. Ein System ermöglicht die gleichzeitige Analyse der Proteinabbau in verschiedenen intrazellulären Kompartimenten könnte tiefgreifende Auswirkungen auf unser Verständnis davon, wie Proteinabbau Netze betreiben. Schließlich können die Prinzipien der Selektionsmethode die Forschung des Proteinabbaus in anderen Modellzellbasierten Systemen angewendet werden, die von Bakterien an menschliche Zellen, die alle erfordern die URA3 Gen-Produkt für das Überleben.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Difco yeast nitrogen base w/o amino acids and ammonium sulfate | BD Biosciences | 233520 | For yeast growth on SD minimal media. Amino acids to be supplied are: Arginine, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Methionine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophan |
| Ammonium sulfate | Sigma - Aldrich | A4418 | |
| Glucose | Sigma - Aldrich | 16325 | |
| Adenine | Sigma - Aldrich | A8626 | |
| Uracil | Sigma - Aldrich | U0750 | |
| Amino acids | Highest purity available | ||
| 96-well plates | Nunc | 167008 | Any other compatible brand can be used |
| Cyclohexamide | Sigma - Aldrich | C7698 | Working conc. 0.5 mg/ml |
| Infinite 200 PRO series | Tecan | For yeast incubation and OD600 measurements. Any other compatible temp-controled reader can be used. | |
| MDTcalc | Experimental software |
References
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