Summary
אבות להביע Nestin הם אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של אבות עצביים במוח הקטן מתפתח. שימוש בטכניקת microdissection מוצגת כאן בשילוב עם מיון תא הופעל ניאון, אוכלוסיית תא זו יכולה להיות מטוהרת ללא זיהום מאזורים אחרים של מוח קטנים ויכולה להיות מתורבת למחקרים נוספים.
Abstract
Microdissection הוא שיטה חדשנית שיכול לבודד אזורים ספציפיים של רקמות ולמנוע זיהום ממקורות סלולריים באזורים סמוכים. שיטה זו נוצלה לראשונה במחקר של אבות (NEPs) להביע Nestin, אוכלוסייה זיהתה לאחרונה של תאים בשכבה החיצונית של המוח הקטן הנבטיה (EGL). באמצעות microdissection בשילוב עם מיון המופעל ניאון תא (FACS), אוכלוסייה טהורה של NEPs נאספה בנפרד ממבשרי נוירונים גרגיר קונבנציונליים בEGL ומתאים מזהמים אחרים Nestin להביע במוח הקטן. ללא microdissection, ניתוחים תפקודיים של NEPs לא היו אפשריים עם השיטות הנוכחיות זמינות, כגון צנטריפוגה שיפוע Percoll וmicrodissection ללכוד לייזר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לשימוש עם רקמות שונות המכילות גם אזורים מוכרים או תאי fluorescently שכותרתו. והכי חשוב, יתרון עיקרי של microdissectio זהטכניקת n היא שתאים מבודדים חיים ויכולים להיות מתורבת לניסויים נוספים, שנמצא כרגע לא אפשרי עם שיטות שתוארו אחרות.
Introduction
המוח הקטן מורכב משכבות תאים מרובות, כל סוגי תאים שונים המכילים. במהלך פיתוח, EGL מכיל מתרבים מבשרי נוירונים גרגיר (GNPs) ואילו השכבה המולקולרית ושכבת פורקינג מכילים נוירונים גליה ברגמן ופורקינג, בהתאמה. עמוק בתוך המוח הקטן נמצא חומר הלבן, אשר מכיל תאי גזע עצביים (NSCs) וoligodendrocytes 1.
קיפוד סוניק (ששש) משחק תפקיד קריטי בויסות התפתחות המוח הקטן ובפרט, זה מקדם את ההתפשטות של GNPs באמצעות קשירה לקולטן שלו טלוא (PTC), רגולטור שלילי של ששש איתות 2-4. הפעלה חריגה של איתות ששש מייצרת מדולובלסטומה (MB), גידול במוח הממאיר השכיח ביותר בילדים 5,6.
מודלים עכבר PTC MB המוטציה מהונדסים הם כלים רבי עוצמה ללימוד MB ולפתח גידולים דומים MB האנושי 7,8. באמצעות אלהעכברים, התגלו כי GNPs הוא התא ממוצא לקיפוד מהסוג MB 7. יתר על כן, בנוסף לGNPs, יש לנו לאחרונה זיהו אוכלוסייה ייחודית של אבות עצביים בתוך EGL של המוח הקטן ומתפתח, שיכול גם לגרום לMB. תאים אלה מבטאים רמות גבוהות של החלבון מסוג VI נימה ביניים, Nestin, ומכונים NEPs 9. NEPs נמצא בתוך החלק העמוק של EGL וקיים זמני בלבד במהלך התפתחות המוח הקטן בילוד. הם מחויבים לשושלת תא גרגיר כGNPs אבל נבדלים כפי שהם שקטים ולא מבטאים את Math1, סמן מבוסס היטב לGNPs הקונבנציונלי 10. בנוסף, NEPs להצמיח MB יעילות רב יותר מאשר GNPs לאחר ההפעלה של המסלול ששש איתות 9, שהופך אותם מקור חדש ליצירת גידולי MB.
בודדנו בעבר NEPs מEGL המוח הקטן ביום הלידה 4 (P4) על ידי טכניקת microdissectionמתואר כאן 9. Microdissection באמצעות הדמיה מיקרוסקופית ישירה של הרקמות מאפשר לנתיחה ספציפית של EGL המוח הקטן. זה הוא הכרחי מכיוון Nestin בא לידי ביטוי גם על ידי NSCs בחומר הלבן במוח הקטן ועל ידי גליה ברגמן בשכבה המולקולרית 1,7,11,12 וזה היה קריטי, כי תאים אלה לא ייכללו, כפי שהם היו לבלבל את הניתוח. התאים מבודדים מרקמת microdissected ניתן להשתמש באופן מיידי לניתוח מולקולרי או שהם יכולים להיות מתורבת ליישומים נוספים.
כדי לסייע באופן ספציפי microdissecting EGL ולטהר נוסף NEPs, Math1-GFP (חלבון פלואורסצנטי הירוק) עכברים היו שלובות עם Nestin-CFP (חלבון פלואורסצנטי ציאן) עכברים. גורם השעתוק Math1 בא לידי הביטוי באופן ספציפי על ידי GNPs והביטוי של GFP נראה בבירור בEGL 9,13. עכברי Nestin-CFP להביע צורה גרעינית של CFP ויכולים להיות דמיינו בקלות בשכבה המולקולרית 9,14. יחד, GFP וביטוי CFP ליצור גבולות לmicrodissection של EGL (ראה איור 1). NEPs CFP החיובי בודדו לאחר מכן על ידי FACS, הבא דיסוציאציה האנזימטית של EGLs גזור.
נכון לעכשיו, השיטה הכי מנוצלת היטב לבודד תאים מEGL היא צנטריפוגה שיפוע Percoll של רקמת המוח הקטן כל 15,16. שיטה זו, עם זאת, אינה יכולה שלא לכלול לגמרי אוכלוסיות תאי Nestin + מהשכבה המולקולרית וחומר לבן ולכן לא ניתן להשתמש לחקר NEPs. microdissection ללכוד לייזר, אשר עושה שימוש בהעברת אנרגיית לייזר להסרת תאים של עניין, הוא שיטה אחרת המשמשת לבודד תאים ספציפיים בתוך רקמה הטרוגנית 17,18 אבל תאים שנתפסו יכולים לשמש רק להתאוששות של DNA, RNA וחלבון ואינם תוכל להיות מתורבת.
פרוטוקול זה מספק דרך לבודד אוכלוסייה בחיים, טהורה של NEPs מEGL במיוחד.טכניקה זו יכולה להיות מיושמת גם לסוגי רקמות שונים שיש להם גם ארכיטקטורה אנטומיים מוכרת או תאים / אזורים שכותרתו fluorescently. לכן, היתרון הגדול של שילוב טכניקת microdissection רומן הזה לפרוטוקולי בידוד תא הוא שיכולים להיות מבודדים תאים מאזורי רקמה ספציפיים לחסל את זיהום השכן רקמה וניתן לאסוף את התאים באופן מיידי לניתוח או מתורבת עבור יישומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שימוש בבעלי החיים בפרוטוקול זה בוצע בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדה למלחמה בסרטן מרכז הטיפול בבעלי חיים והשימוש פוקס צ'ייס.
.1 הכנת מכשירים, פתרונות, וCoverslips
- שתי קבוצות נקיות של 5 # מלקחיים בסדר, קבוצה אחת של 7 # מלקחיים מעוקלים בסדר, מספריים אחד גדולים כירורגים, מספריים microdissecting אחד, מרית אחת וכף אחת מחוררת. מניחים את המכשירים בכיס עיקור עצמי איטום וחיטוי. שמור מכשירים בכיס עד לשימוש.
- הכן פתרון agarose טמפרטורת התכה הנמוכה של 3%.
- הוסף 1.5 agarose גרם ל50 מ"ל של בופר פוספט של Dulbecco סטרילי (DPBS) לאחר מכן למקם במיקרוגל וחום עד בועות מופיעות. בקבוק המערבולת ולחמם עד שכל agarose נמס. מערבבים פתרון עם בר ומערבב לפני החימום אם גושים מופיעים.
- פתרון חנות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עד צורך.
- לstorag לטווח ארוךדואר, לאחסן את פתרון agarose לשימוש עתידי בטמפרטורת חדר או על 4 מעלות צלזיוס במשך חודשים. לחמם במיקרוגל לנזל. לחימום חוזר ונשנה של פתרון agarose, לשקול את הבקבוק לפני החימום כדי לשמור על המשקל הראשוני שלו עם מים מזוקקים סטריליים חמים.
- הכן את הפתרונות לניתוק תא המבוסס על פפאין כפי שתוארו קודם לכן 2 הבאים:
- פתרון פפאין עם פפאין (100 U / ml), ציסטאין (0.2 מ"ג / מ"ל) וDNase (250 U / ml) בפנול סטרילי אדום המכיל DPBS.
- פתרון ovomucoid עם אלבומין בסרום שור (BSA; 8 מ"ג / מ"ל), מעכב סויה טריפסין (8 מ"ג / מ"ל)) וDNase (250 U / ml) הבמכיל אדום DPBS פנול סטרילי.
סנן לעקר את שני הפתרונות ולהתאים את pH לחזור צבע מקורי של המכיל אדום DPBS פנול.
- הכן תקשורת תרבית תאים (NB / B27): להשלים תקשורת בסיסית עם פירובט מ"מ 1 נתרן, L-גלוטמין 2 מ"מ, 1% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S) ותוסף B27. Filter לעקר ולהגן מפני אור. לאזן תקשורת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 לפני השימוש.
- הכן חיץ FACS: 5% בסרום שור העובר (FBS) בDPBS. הוסף 2.5 FBS מ"ל ל47.5 DPBS מ"ל.
- הכן פולי-D-ליזין (PDL) coverslips -coated.
- coverslips זכוכית החדש החיטוי.
- מעיל coverslips עם PDL (100 / מיקרוגרם מ"ל במים מזוקקים סטריליים) ודגירה עבור שעה 2 ב 37 ° C או בטמפרטורת חדר למשך הלילה.
- לשטוף coverslips עם מים מזוקקים סטריליים. לשטוף פעם עם תקשורת NB / B27. בואו coverslips להתייבש לחלוטין בשכונת תרביות רקמה לפני השימוש.
.2 Dissection והכנה של פרוסות רקמה
- ביום לנתיחה, לנגב את האזור לנתיחה עם אתנול 70% ולכסות עם כרית סופגת.
- הסר כלים לנתיחה מכיס העיקור. להוסיף קרח קר, DPBS סטרילי S / P / 1% לצלחת פטרי קטן ומניחים על קרח.
- לערוף P4 Math1-GFגורי עכבר P / Nestin-CFP עם מספריים כירורגיות גדולים אז להחזיק את הראש למטה עם מלקחיים מעוקלים בסדר. הסר את העור בעדינות לקלף את הגולגולת עם # 5 מלקחיים בסדר לאחר מכן לגרוף את המוח מהגולגולת בעזרת מרית ולהעביר אותו לצלחת פטרי המכילה / 1% S / P DPBS.
- באמצעות # 5 מלקחיים בסדר, להפריד בזהירות את המוח הקטן משאר המוח. הקפד לנתח גור אחד בכל פעם מהר ככל האפשר.
- לאסוף מינימום של 8 cerebella על מנת לקבל מספיק NEPs לניתוחים מולקולריים ופונקציונליים.
- מלא עובש הטבעת מדידת 2 X 2 X 2 סנטימטר עם 3% פתרון agarose טמפרטורת התכה נמוכה. ודא שהטמפרטורה של agarose היא לא C יותר מ 37 מעלות.
- הסר את נוזלי עודפים מהמוח קטן על ידי מספיג בעדינות על רקמות במעבדה. הנח המוח הקטן לתוך תבנית במצב אנכי. מניחים את התבנית על קרח כדי לאפשר לו לגבש במהירות. השתמש ~ 4 cerebella לכל בלוק.
- להשיג liחלקי רקמות וינג עם vibratome להב רוטט. Trim בלוק agarose המכיל cerebella בסכין גילוח. מדביק את בלוק agarose לצלחת vibratome עם cerebella אוריינטציה במצב אנכי.
- מלא את המגש של vibratome עם DPBS סטרילית קר כקרח / 1% P / S קרח ומקום מתחת.
- חותך 600 מיקרומטר סעיפים לאורך כל אורכו של המוח הקטן. לאסוף חלקים ממגש הקרח בעזרת כף מחוררת. סעיפי מקום בצלחת פטרי מלאים DPBS / 1% P / S על קרח.
.3 Microdissection ודיסוציאציה הסלולרי
- מניחים את צלחת פטרי המכילה פרוסות רקמה תחת מיקרוסקופ לנתח ניאון.
- להפריד בזהירות את EGL משאר סעיף המוח הקטן באמצעות מלקחיים בסדר ידי לנתח בבין CFP + השכבה המולקולרית וGFP + EGL (ראה קו מקווקו באיור 1). היזהר שלא כולל כל חלק של השכבה המולקולרית, אשר יגרוםזיהום של גליה ברגמן להביע Nestin.
- להשלים שלב זה במהירות אפשרית ולשמור על הרקמה על קרח, כדי למנוע מוות של תאים.
- הסר את agarose המקיף את הרקמות לפני שתמשיך לשלב הבא.
- לעכל את רקמת microdissected EGL באמצעות פרוטוקול מבוסס פפאין כפי שתואר לעיל 2 לקבל השעיה תא בודדת.
- Re-להשעות תאי חיץ FACS לאוסף של תאי CFP החיוביים באמצעות FACS.
.4 מיון תא וציפוי
- תאי מיין לקרינת CFP באמצעות זרימת סטרילי, במהירות גבוהה cytometer המכיל מסנן CFP מתאים ולאסוף תאים במאגר FACS על קרח. להשיג כ -100,000 NEPs מכל המוח הקטן P4.
- תאי צנטריפוגה XG 300 5 דקות. להשתמש בתאים באופן מיידי לניתוח או תרבות מולקולריים לניסויים נוספים.
- לתאי תרבות, מחדש להשעות את התאים מ 'מראש חימם NB / B27עדיה וצלחת על coverslips מצופה PDL כפי שתוארו קודם לכן 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שניתן לראות באיור 1 א, פרוסות המוח הקטן הוכנו מP4 Math1-GFP / עכברי Nestin-CFP, שבי EGL המוח הקטן נשלט על ידי GNPs להביע GFP והשכבה המולקולרית הועשרה על ידי תאי גלייה CFP-חיובי. כדי לבודד NEPs הממוקמים בחלק העמוק של EGL, פרוסות היו microdissected בין EGL והשכבה המולקולרית (לאורך קו מקווקו; איור 1 א). EGLs הגזור (איור 1) ולאחר מכן נאספו לניתוק האנזימטית אחרי FACS.
כצפוי, רובם (יותר מ 85%) של תאים בEGL גזור היו GNPs הקונבנציונלי, שהיו חיוביים לGFP (איור 2 א). NEPs חשבון (CFP +) רק כ -5% מאוכלוסיית תא EGL. כמעט אף אחד מהתאים היו כפולים חיובי לGFP וCFP המבוסס על ניתוח FACS. תאי CFP + מטוהרים על ידי FACS, היו בתרבית במבחנה לבחון את pote הבידולntial. כפי שניתן לראות באיור 2, NEPs באופן בלעדי הוליד β טובולין + נוירונים לאחר 4 ימים בתרבות, NEPs מציע הם אבות עצביים מוגבל שושלת.
על ידי פרוטוקול microdissection זה, NEPs וGNPs היו גם מטוהר מהמוח הקטן חסר EGL של PTC. על ההשתלה תוך גולגולתי, NEPs לפתח MBs במהירות רב יותר בהשוואה לGNPs, מצביע על כך שNEPs רגיש במיוחד לשינוי שבעור 9.
איור .1 זיהוי האזור לmicrodissection EGL. תמונות פלורסנט מP4 Math1-GFP / בעלי החיים Nestin-CFP. () ביטוי של GFP ממוקם בEGL, ואילו הרוב המכריע של ביטוי CFP ממוקם בשכבה המולקולרית. Microdissection נעשה לאורך tהוא קו מקווקו צהוב. EGLs (ב) נאסף לניתוק רקמות. נתון זה שונה מLi et al 9.
NEPs .2 איור מייצג אוכלוסייה קטנה של תאים בEGL והם אבות עצביים מוגבל שושלת. () Cytometry זרימת ניתוח CFP התאים + המבודדים מEGL microdissected. NEPs (ב) היה בתרבית בתנאי בידול במשך 4 ימים ומוכתמים עבור β טובולין (אדום) וcounterstained עם DAPI (כחול). נתון זה שונה מאל Li et. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת microdissection המתוארת כאן היא ההליך הראשון הצליח לבודד אוכלוסייה טהורה של תאי חיים לשימוש בניתוחים מולקולריים ופונקציונליים. כפי שהודגם על ידי Li et al. 9, NEPs מתקבל על ידי שיטה זו יכול להיות מתורבת ושולב ניסויים שונים ובגלל טוהר הגבוה שלהם, יכול לשמש גם לניתוח microarray.
חשוב מאוד לקחת את הזמן כדי להיות בקיא בטכניקת microdissection זה. NEPs ממוקם באזור העמוק של EGL הסמוך מאוד לשכבה המולקולרית, שבו גליה ברגמן להביע Nestin יכולה לזהם את בידוד התא נס ר ולהתפשר טוהר. Microdissection ולכן צריך להיעשות באופן שמרני כדי להפוך לתאים בטוחים זיהום ברקמות סמוכות אינם כלולות. היתרון העיקרי של טכניקת microdissection המתוארת כאן הוא היכולת להשיג תאי חיים שיכולים להיות מתורבת לfurtheניסויים r. מסיבה זו, חשוב כי ייעשו כל הצעדים במהלך הליך זה במהירות וברקמות שתישמרנה על קרח ככל האפשר. כמו כן, כל המכשירים וחומרים הכימיים חייבים להיות סטרילי. בעקבות צעדים אלה יפחית מוות של תאים וזיהום תרבית תאים. בנוסף, cerebella מרובה הרכבה לכל בלוק agarose יסייע בהפחתת זמן ההליך.
טכניקה זו אינה מוגבלת לבידודה של NEPs והוא יכול לשמש לאיסוף תאים מאזורים אחרים של המוח הקטן, כגון תאי גליה מהשכבה המולקולרית ותאי גזע עצביים מהחומר הלבן. לצד המוח הקטן, microdissection ניתן להשתמש עם רקמות אחרות המכילות אזורים מוכרים, כמו בהיפוקמפוס, למשל. השימוש בtransgenes ניאון, כמנוצל כאן, יכול לסייע ביצירת גבולות או לזהות אזורים לנתיחה, אשר יכולה להיות שימושית במיוחד ברקמות שחסרות אזורים לזיהוי בקלות ושאחרת לא יוכלו להיות מ 'icrodissected. טכניקה זו ולכן יכולה לסייע בpurifications תא במגוון רחב של תחומי מחקר ויישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לג'יימס Oesterling לcytometry זרימת סיוע. מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמכון הלאומי לסרטן בארה"ב (R01-CA178380, ZY) ומענק אמריקאי הלאומיים מכוני דוקטורים אימון (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
