Summary
Progenitori nestina-esprimendo sono una popolazione recentemente identificato di progenitori neuronali del cervelletto in via di sviluppo. Utilizzando la tecnica di microdissezione qui presentata in combinazione con fluorescenza-attivato cell sorting, questa popolazione cellulare può essere purificato senza contaminazione da altre regioni cerebellari e può essere coltivato per ulteriori studi.
Abstract
Microdissezione è una nuova tecnica in grado di isolare le regioni specifiche di un tessuto ed eliminare la contaminazione da fonti cellulari in aree adiacenti. Questo metodo è stato utilizzato nello studio di nestina-esprimendo progenitrici (NEP), una popolazione di recente identificato delle cellule dello strato germinativo cerebellare esterno (EGL). Utilizzando microdissection in combinazione con l'ordinamento delle cellule fluorescenti-attivata (FACS), una popolazione pura di NEP è stato raccolto separatamente dagli convenzionali precursori neuronali dei granuli in EGL e da altri contaminanti cellule nestina-esprimono nel cervelletto. Senza microdissezione, analisi funzionali della NEP, non sarebbe stato possibile con i metodi attualmente disponibili, come Percoll centrifugazione in gradiente e microdissezione laser. Questa tecnica può essere applicata anche per l'utilizzo con vari tessuti che contengono sia regioni riconoscibili o cellule fluorescenza marcata. Ancora più importante, un grande vantaggio di questo microdissectiotecnica n è che le cellule isolate vivono e possono essere coltivate per ulteriori sperimentazioni, che non è attualmente possibile con altri metodi descritti.
Introduction
Il cervelletto è costituito da più strati di cellule, ciascuna contenente tipi cellulari distinti. Durante lo sviluppo, la EGL contiene proliferazione dei precursori neuronali dei granuli (PNL), mentre lo strato molecolare e strato di Purkinje contengono Bergmann glia e neuroni di Purkinje, rispettivamente. Nel profondo del cervelletto si trova la sostanza bianca, che contiene le cellule staminali neurali (NSC) e oligodendrociti 1.
Sonic hedgehog (Shh) svolge un ruolo critico nella regolazione dello sviluppo cerebellare e, in particolare, promuove la proliferazione di PNL tramite legame al suo recettore Patched (Ptc), un regolatore negativo di Shh segnalazione 2-4. L'attivazione aberrante di segnalazione Shh genera medulloblastoma (MB), il tumore cerebrale maligno più comune nei bambini 5,6.
Ptc MB mutanti modelli di topi transgenici sono strumenti potenti per lo studio di MB e si sviluppano i tumori che assomigliano MB umano 7,8. L'utilizzo di questitopi, si è scoperto che PNL sono la cellula di origine per riccio di tipo MB 7. Inoltre, oltre al PNL, abbiamo recentemente identificato una popolazione unica di progenitori neuronali all'interno EGL del cervelletto sviluppo che può anche dar luogo a MB. Queste cellule esprimono alti livelli di tipo VI, proteina dei filamenti intermedi, Nestin, e sono chiamati NEP 9. NEP si trovano all'interno della parte profonda della EGL ed esistono transitoriamente solo durante lo sviluppo cerebellare neonatale. Essi si sono impegnati per la linea cellulare dei granuli come PNL, ma sono distinte come sono quiescenti e non esprimono Math1, un marker ben consolidata per la PNL convenzionali 10. Inoltre, NEP danno luogo a MB più efficiente rispetto PNL dopo l'attivazione della via di segnalazione Shh 9, che li un romanzo origine per MB tumorigenesi fa.
Abbiamo già NEP dalla cerebellare EGL isolati al giorno postnatale 4 (P4) con la tecnica microdissezionedescritto qui 9. Microdissezione tramite la visualizzazione microscopica diretta del tessuto permette di specifico dissezione del cerebellare EGL. Questo è necessario in quanto Nestin viene espressa anche dal NSC nella sostanza bianca cerebellare e da Bergmann glia nello strato molecolare 1,7,11,12 ed era fondamentale che queste cellule non essere inclusi, come avrebbero confondere l'analisi. Le cellule isolate dal tessuto microdissezione possono essere utilizzati immediatamente per l'analisi molecolare oppure possono essere coltivati per ulteriori applicazioni.
Per aiutare in modo specifico microdissecting la EGL e per purificare ulteriormente NEP, topi Math1-GFP (green fluorescent protein) sono stati incrociati con topi Nestin-CFP (proteina fluorescente ciano). Il fattore di trascrizione Math1 è specificamente espresso da PNL e l'espressione della GFP è chiaramente visibile nella EGL 9,13. Topi Nestin-PCP esprimono una forma nucleare di PCP e possono essere facilmente visualizzati nello strato molecolare 9,14. Insieme, GFP e di espressione CFP creano confini per microdissezione del EGL (vedi Figura 1). NEP CFP-positivi sono stati poi isolati da FACS, dopo dissociazione enzimatica delle EGLS sezionati.
Attualmente, il metodo più ben utilizzato per isolare le cellule dal EGL è Percoll centrifugazione in gradiente di tutto il tessuto cerebellare 15,16. Questo metodo, tuttavia, è in grado di escludere completamente popolazioni di cellule nestina + dal livello molecolare e la materia bianca e pertanto non può essere utilizzato per lo studio della NEP. Laser cattura microdissezione, che utilizza il trasferimento di energia laser per rimuovere le cellule di interesse, è un altro metodo usato per isolare cellule specifiche all'interno di un tessuto eterogeneo 17,18 ma cellule catturate possono essere utilizzate solo per il recupero di DNA, RNA e proteine e non sono in grado di essere coltivato.
Questo protocollo fornisce un modo per isolare in particolare un vivo, popolazione pura della NEP dal EGL.Questa tecnica può essere applicata a diversi tipi di tessuto che hanno o architettura anatomica riconoscibile o fluorescente cellule / regioni. Pertanto, il principale vantaggio di incorporare questa nuova tecnica di microdissezione nei protocolli di isolamento delle cellule è che le cellule possono essere isolate dalle regioni tissutali specifici per eliminare la contaminazione dei tessuti vicini e le cellule possono essere raccolte immediatamente per l'analisi o in coltura per altre applicazioni.
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Protocol
L'uso di animali in questo protocollo è stata effettuata in conformità con le procedure approvate dal Cancer Center Animal Care and Use Committee Fox Chase.
1 preparazione di strumenti, soluzioni e coprioggetto
- Pulire i due set di # 5 pinza sottile, un set di 7 # pinze curve sottili, una grande forbice chirurgica, una forbice microdissecting, una spatola e un cucchiaio forato. Mettere gli strumenti in un sacchetto di sterilizzazione autosigillante e autoclave. Mantenere gli strumenti in sacchetto fino al momento dell'uso.
- Preparare una soluzione di agarosio temperatura 3% basso punto di fusione.
- Aggiungere 1,5 g di agarosio in 50 ml di sterile Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS) poi posizionare in forno a microonde e fino alla comparsa di bolle. Pallone Swirl e riscaldare fino a quando tutti agarosio è sciolto. Mescolare la soluzione con una ancoretta prima del riscaldamento, se appaiono grumi.
- Conservare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 ° C fino al momento dell'uso.
- Per conten-lungo terminee, conservare la soluzione di agarosio per uso futuro a temperatura ambiente oa 4 ° C per mesi. Riscaldate in forno a microonde per liquefare. Per il riscaldamento ripetuto della soluzione di agarosio, pesare il pallone prima di riscaldare per mantenere il suo peso iniziale con acqua distillata sterile tiepida.
- Preparare le seguenti soluzioni basate papaina-dissociazione cella come descritto in precedenza 2:
- Una soluzione di papaina con papaina (100 U / ml), cisteina (0,2 mg / ml) e DNasi (250 U / ml) in fenolo sterile rossi contenenti DPBS.
- Una soluzione ovomucoid con albumina di siero bovino (BSA; 8 mg / ml), inibitore di tripsina di soia (8 mg / ml)) e DNasi (250 U / ml) in fenolo sterile rossi contenenti DPBS.
Filtro sterilizzare entrambe le soluzioni e regolare il pH a restituire il colore originale di rosso fenolo contenenti DPBS.
- Preparare mezzi di coltura cellulare (NB / B27): integrare i media basale con 1 mM di sodio piruvato, 2 mM L-glutammina, 1% di penicillina-streptomicina (P / S) e B27 supplemento. Filter sterilizzare e proteggere dalla luce. Equilibrare i media a 37 ° C e 5% di CO 2 prima dell'uso.
- Preparare tampone FACS: 5% di siero fetale bovino (FBS) in DPBS. Aggiungere 2,5 ml di FBS 47,5 ml DPBS.
- Preparare poli-D-lisina (PDL) coprioggetto Rivestiti.
- Autoclave nuovi vetrini.
- Cappotto i coprioggetti con PDL (100 mcg / ml in acqua distillata sterile) e incubare per 2 ore a 37 ° C oa temperatura ambiente per una notte.
- Lavare coprioggetto con acqua distillata sterile. Lavare una volta con NB / B27 media. Lasciate asciugare completamente coprioggetto in cappa coltura tissutale prima dell'uso.
2 dissezione e preparazione di fette di tessuto
- Il giorno della dissezione, pulire l'area dissezione con etanolo al 70% e la copertura con un tampone assorbente.
- Rimuovere strumenti di dissezione dal sacchetto di sterilizzazione. Aggiungere ghiaccio freddo, DPBS sterile / 1% P / S a una piccola scatola di Petri e posto sul ghiaccio.
- Decapitare P4 Math1-GFP / Nestin-CFP cuccioli di topo con grandi forbici chirurgiche poi tenere la testa in giù con pinze curve sottili. Togliere la pelle e rimuovere delicatamente il cranio con 5 # pinza sottile con una spatola poi scavare il cervello dal cranio e trasferirlo alla piastra di Petri contenente DPBS / 1% P / S.
- Uso # 5 pinza sottile, separare accuratamente il cervelletto dal resto del cervello. Assicurati di sezionare un cucciolo alla volta il più rapidamente possibile.
- Raccogliere un minimo di 8 cerebella al fine di ottenere sufficienti NEP per analisi molecolari e funzionali.
- Riempire uno stampo embedding misura 2 x 2 x 2 cm con 3% soluzione di agarosio a bassa temperatura di fusione. Assicurarsi che la temperatura di agarosio non è più di 37 ° C.
- Rimuovere il liquido in eccesso dal cervelletto tamponando delicatamente su un tessuto di laboratorio. Inserire cervelletto in stampo in posizione verticale. Mettere lo stampo sul ghiaccio per consentirgli di solidificare rapidamente. Utilizzare ~ 4 cerebella per blocco.
- Ottenere lisezioni di tessuto Ving con lama vibratome vibrante. Trim-cerebella blocco contenitore di agarosio con una lama di rasoio. Incollare il blocco di agarosio al piatto vibratome con cerebella orientato in posizione verticale.
- Riempire il vassoio del vibratome con ghiaccio-freddo DPBS sterile / 1% P / S e posto sotto ghiaccio.
- Tagliare 600 micron sezioni attraverso tutta la lunghezza del cervelletto. Raccogliere sezioni dal vassoio di ghiaccio con un cucchiaio forato. Posizionare le sezioni in una capsula di Petri riempita con DPBS / 1% P / S sul ghiaccio.
3. Microdissezione e dissociazione cellulare
- Porre la capsula di Petri contenente fette di tessuto con un microscopio a fluorescenza dissezione.
- Separare con cautela la EGL dal resto della sezione cerebellare utilizzando una pinza sottile sezionando tra lo strato PCP + molecolare e la GFP + EGL (vedi linea tratteggiata in figura 1). Fare attenzione a non includere alcuna parte del livello molecolare, che si tradurrà incontaminazione del-Nestin esprimere Bergmann glia.
- Completare questo passaggio il più rapidamente possibile e mantenere il tessuto in ghiaccio per evitare la morte delle cellule.
- Rimuovere l'agarosio circonda il tessuto prima di procedere alla fase successiva.
- Digerire il tessuto EGL microdissezione utilizzando un protocollo basato papaina, come precedentemente descritto 2 per ottenere una sospensione di cellule singole.
- Risospendere le cellule in tampone FACS per la raccolta di cellule CFP-positivi tramite FACS.
4. cellulare Ordinamento e placcatura
- Cellule Ordina per PCP fluorescenza utilizzando una sterile, flusso ad alta velocità citometro contenente un filtro PCP appropriato e raccogliere le cellule in tampone FACS su ghiaccio. Ottenere circa 100.000 NEP di ogni cervelletto P4.
- Cellule centrifugare a 300 xg per 5 min. Utilizzare immediatamente le cellule per l'analisi molecolare o cultura per ulteriori sperimentazioni.
- Per le cellule di coltura, risospendere le cellule in pre-riscaldato NB / B27 media e piastra su vetrini PDL rivestite come precedentemente descritto 2.
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Representative Results
Come mostrato nella Figura 1A, fettine cerebellari sono stati preparati da P4 Math1-GFP / topi Nestin-PCP, in cui il cerebellare EGL è stata dominata da PNL-GFP che esprimono e lo strato molecolare è stata arricchita da cellule gliali CFP-positivi. Per isolare NEP che si trovano nella parte profonda della EGL, fette sono state microdissezionate tra EGL e lo strato molecolare (lungo la linea tratteggiata; Figura 1A). EGLS sezionato (Figura 1B) sono stati poi raccolti per dissociazione enzimatica seguita da FACS.
Come previsto, la maggioranza (oltre il 85%) delle cellule nel EGL sezionato erano PNL convenzionali, che erano positive per GFP (Figura 2A). NEP (PCP +) rappresentano solo il 5% della popolazione di cellule EGL. Quasi nessuna delle celle erano doppio-positive per GFP e CFP sulla base dell'analisi FACS. Cellule PCP + purificate da FACS, sono state coltivate in vitro per esaminare il pote differenziazionential. Come mostrato nella Figura 2B, NEP esclusivamente dato luogo alla β-tubulina + neuroni dopo 4 giorni di coltura, suggerendo NEP sono progenitori neuronali lignaggio limitato.
Con questo protocollo microdissezione, NEP e PNL sono stati purificati dal EGL di Ptc cervelletto carente. Dopo il trapianto intracranica, NEP MB sviluppano più rapidamente rispetto al PNL, che indica che NEP sono particolarmente suscettibili di trasformazione oncogenica 9.
Figura 1 Identificazione della regione per EGL microdissezione. Immagini fluorescenti da P4 Math1-GFP / animali Nestin-PCP. (A) espressione della GFP si trova nel EGL, mentre la maggioranza di espressione CFP si trova nello strato molecolare. Microdissezione è stato fatto lungo tegli giallo linea tratteggiata. (B) EGLS sono stati raccolti per la dissociazione dei tessuti. Questo dato è stato modificato da Li et al 9.
Figura 2. NEP rappresentano una piccola popolazione di cellule nel EGL e sono progenitori neuronali lignaggio limitato. (A) l'analisi di citometria a flusso delle PCP + cellule isolate da microdissezione EGL. (B) NEP sono state coltivate in condizioni di differenziazione per 4 giorni e colorate per la β-tubulina (rosso) e counterstained con DAPI (blu). Questo dato è stato modificato da Li et al. 9
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Discussion
Il metodo microdissezione qui descritto è il primo procedimento in grado di isolare una popolazione pura di cellule viventi per uso nelle analisi molecolari e funzionali. Come dimostrato da Li et al. 9, NEP ottenuti con tale metodo può essere coltivato e incorporati in vari esperimenti e per la loro elevata purezza, possono essere utilizzati anche per analisi microarray.
E 'molto importante prendersi il tempo per diventare esperti con questa tecnica microdissezione. NEP si trovano nella regione profonda del EGL molto vicino al livello molecolare, in cui-Nestin esprimendo Bergmann glia potrebbe contaminare l'isolamento delle cellule NEP e compromettere la purezza. Microdissezione dovrebbe quindi essere fatto in modo conservativo per assicurarsi che le cellule contaminanti nei tessuti adiacenti non sono inclusi. Il principale vantaggio della tecnica microdissezione qui descritta è la possibilità di ottenere cellule viventi che possono essere coltivate per further sperimentazione. Per questo motivo, è fondamentale che tutti i passaggi durante questa procedura essere eseguite rapidamente e che il tessuto tenuti in ghiaccio il più possibile. Inoltre, tutti gli strumenti e reagenti devono essere sterili. Seguendo questi passaggi si riduce la morte cellulare e la contaminazione coltura cellulare. Inoltre, il montaggio cerebella multipla per blocco di agarosio sarà di aiuto nel ridurre il tempo di procedura.
Questa tecnica non è limitato a isolamento di NEP e può essere utilizzato per raccogliere cellule da altre aree del cervelletto, come le cellule gliali dallo strato molecolare e cellule staminali neurali dalla sostanza bianca. Accanto al cervelletto, microdissezione può essere utilizzato con altri tessuti che contengono regioni riconoscibili, come l'ippocampo, per esempio. L'uso di transgeni fluorescenti, come utilizzato qui, può aiutare nella creazione di confini o di identificare le regioni per la dissezione, che può essere particolarmente utile nei tessuti che mancano aree facilmente identificabili e che non sarebbero altrimenti in grado di essere microdissected. Questa tecnica potrebbe quindi aiutare a purificazioni cellulari in una vasta gamma di aree di ricerca e delle applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare James Oesterling per citometria a flusso assistenza. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del US National Cancer Institute (R01-CA178380, ZY) e una sovvenzione US National Institutes Postdoctoral formazione (5T32CA009035-37, LWY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
