Summary
Nestin व्यक्त progenitors विकासशील सेरिबैलम में neuronal progenitors के एक नव पहचान आबादी हैं. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई के साथ संयोजन में यहाँ प्रस्तुत microdissection तकनीक का उपयोग करना, इस सेल की आबादी अन्य अनुमस्तिष्क क्षेत्रों से कोई संदूषण के साथ शुद्ध किया जा सकता है और आगे के अध्ययन के लिए संवर्धित किया जा सकता है.
Abstract
Microdissection एक ऊतक के विशिष्ट क्षेत्रों को अलग और आसन्न क्षेत्रों में सेलुलर स्रोतों से प्रदूषण को समाप्त कर सकते हैं कि एक उपन्यास तकनीक है. इस विधि पहले के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था nestin व्यक्त progenitors (NEPs), अनुमस्तिष्क बाहरी कीटाणु परत (EGL) में कोशिकाओं के एक नव पहचान आबादी. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ संयोजन में microdissection का प्रयोग, NEPs की एक शुद्ध आबादी सेरिबैलम में EGL में पारंपरिक दाना न्यूरॉन व्यापारियों से और अन्य contaminating nestin व्यक्त कोशिकाओं से अलग से एकत्र किया गया था. Microdissection बिना, NEPs के कार्यात्मक विश्लेषण ऐसे Percoll ढाल centrifugation और लेजर कब्जा microdissection के रूप में उपलब्ध मौजूदा तरीकों, साथ संभव नहीं होता. इस तकनीक को भी पहचानने योग्य क्षेत्रों या fluorescently लेबल कोशिकाओं या तो होते हैं कि विभिन्न ऊतकों के साथ उपयोग के लिए लागू किया जा सकता है. इस microdissectio की सबसे महत्वपूर्ण बात, एक प्रमुख लाभn तकनीक अलग कक्षों रह रहे हैं और अन्य वर्णित तरीकों के साथ वर्तमान में संभव नहीं है जो आगे प्रयोग, के लिए संवर्धित किया जा सकता है.
Introduction
सेरिबैलम कई सेल परतों, प्रत्येक युक्त विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के शामिल है. आणविक परत और Purkinje परत क्रमशः, Bergmann glia और Purkinje न्यूरॉन्स होते हैं जबकि विकास के दौरान, EGL दाना न्यूरॉन व्यापारियों (GNPs) proliferating होता. सेरिबैलम के भीतर दीप तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) और oligodendrocytes 1 जिसमें सफेद पदार्थ, निहित है.
ध्वनि का हाथी (श्श्श) अनुमस्तिष्क विकास को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और विशेष रूप से, यह समझौता इसकी रिसेप्टर (पीटीसी), श्श्श 2-4 संकेत की एक नकारात्मक नियामक के लिए बाध्य के माध्यम से GNPs के प्रसार को बढ़ावा देता है. श्श्श सिगनल की न्यायपालिका सक्रियण medulloblastoma (एमबी), बच्चों 5,6 में सबसे आम घातक ब्रेन ट्यूमर को उत्पन्न करता है.
पीटीसी उत्परिवर्ती एमबी ट्रांसजेनिक माउस मॉडल एमबी के अध्ययन के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं और मानव एमबी 7,8 जैसी ट्यूमर का विकास. का उपयोग इनचूहों, यह GNPs हाथी प्रकार एमबी 7 के लिए मूल के सेल हैं कि खोज की थी. इसके अलावा, GNPs के अलावा, हम हाल ही में भी एमबी को जन्म दे सकता है कि विकासशील सेरिबैलम के EGL भीतर neuronal progenitors के एक अद्वितीय आबादी की पहचान की है. इन कोशिकाओं प्रकार छठी मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन, nestin के उच्च स्तर व्यक्त, और NEPs 9 कहा जाता है. NEPs EGL के गहरे हिस्से के भीतर स्थित है और केवल नवजात अनुमस्तिष्क विकास के दौरान क्षणिक मौजूद रहे. वे GNPs रूप दाना सेल वंश के लिए प्रतिबद्ध है, लेकिन वे मौन हैं और Math1, पारंपरिक GNPs 10 के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मार्कर व्यक्त नहीं करते के रूप में अलग कर रहे हैं. इसके अलावा, NEPs उन्हें एमबी tumorigenesis के लिए एक उपन्यास मूल बनाता है जो श्श्श संकेतन मार्ग 9, की सक्रियता के बाद एमबी को जन्म अधिक कुशलता से GNPs दे.
हम पहले microdissection तकनीक से प्रसव के बाद सुबह 4 (पी 4) पर अनुमस्तिष्क EGL से NEPs पृथकयहां 9 में वर्णित है. ऊतक के प्रत्यक्ष सूक्ष्म दृश्य के माध्यम से Microdissection अनुमस्तिष्क EGL की विशिष्ट विच्छेदन के लिए अनुमति देता है. Nestin भी अनुमस्तिष्क सफेद पदार्थ में और आणविक परत 1,7,11,12 में Bergmann glia द्वारा एनएससी द्वारा व्यक्त की और कहा कि वे विश्लेषण उलझाना चाहते हैं, क्योंकि यह इन कोशिकाओं को शामिल नहीं किया है कि महत्वपूर्ण था है के रूप में यह आवश्यक है. Microdissected ऊतक से अलग कक्षों आणविक विश्लेषण के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या वे आगे अनुप्रयोगों के लिए संवर्धित किया जा सकता है.
विशेष रूप से EGL microdissecting में सहायता करने के लिए और आगे NEPs शुद्ध करने के लिए, Math1-GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) चूहों nestin-रवांडा (सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन) चूहों के साथ पार कर रहे थे. Math1 विशेष रूप से GNPs और GFP अभिव्यक्ति द्वारा व्यक्त की है प्रतिलेखन कारक EGL 9,13 में स्पष्ट रूप से दिख रहा है. nestin-पाकिस्तानी चूहों हांगकांग के एक परमाणु फार्म व्यक्त करते हैं और आसानी से आणविक परत 9,14 में देखे जा सकते हैं. साथ में, GFP और पाकिस्तानी अभिव्यक्ति EGL के microdissection के लिए सीमाओं बनाने (चित्रा 1 देखें). पाकिस्तानी पॉजिटिव NEPs तो विच्छेदित EGLs के enzymatic हदबंदी के बाद, FACS द्वारा अलग थे.
वर्तमान में, EGL से कोशिकाओं को अलग करने के लिए सबसे अच्छी तरह से उपयोग विधि पूरी अनुमस्तिष्क ऊतक 15,16 के Percoll ढाल centrifugation है. इस विधि, तथापि, पूरी तरह से आणविक परत और सफेद पदार्थ से nestin + सेल आबादी को बाहर करने में असमर्थ है और इसलिए NEPs के अध्ययन के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. ब्याज की कोशिकाओं को हटाने के लिए लेजर ऊर्जा के हस्तांतरण का उपयोग करता है जो लेजर कब्जा microdissection, एक विषम ऊतक 17,18 के भीतर विशिष्ट कोशिकाओं को अलग किया लेकिन कब्जा कर लिया कोशिकाओं ही डीएनए, आरएनए और प्रोटीन की वसूली के लिए इस्तेमाल किया और नहीं किया जा सकता है एक और तरीका है सक्षम सुसंस्कृत होने के लिए.
इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से EGL से NEPs का एक जिंदा, शुद्ध आबादी को अलग करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है.इस तकनीक को भी पहचानने योग्य शारीरिक संरचना या fluorescently लेबल कोशिकाओं / क्षेत्रों या तो है कि विभिन्न प्रकार के ऊतकों को लागू किया जा सकता है. इसलिए, सेल अलगाव प्रोटोकॉल में इस उपन्यास microdissection तकनीक शामिल करने का प्रमुख लाभ कोशिकाओं ऊतक पड़ोसी contaminating को खत्म करने के लिए विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों से अलग किया जा सकता है और कोशिकाओं अन्य अनुप्रयोगों के लिए विश्लेषण या सुसंस्कृत लिए तुरंत एकत्र किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
इस प्रोटोकॉल में पशुओं के उपयोग फॉक्स चेस कैंसर केंद्र पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया है.
उपकरण, समाधान, और coverslips के 1. तैयारी
- # 5 ठीक संदंश की साफ दो सेट, # 7 के एक सेट ठीक घुमावदार संदंश, एक बड़ी शल्य कैंची, एक microdissecting कैंची, एक रंग और एक छिद्रित चम्मच. एक आत्म सील नसबंदी पाउच और आटोक्लेव में यंत्र रखें. उपयोग के लिए तैयार है जब तक थैली में यंत्र रखें.
- एक 3% कम पिघलने तापमान agarose समाधान तैयार करें.
- बुलबुले दिखाई देते हैं जब तक बाँझ Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा (DPBS) के 50 एमएल में 1.5 जी agarose जोड़ें तो माइक्रोवेव और गर्मी में जगह है. सभी agarose जब तक भंवर कुप्पी और गरम करना भंग कर दिया है. Clumps प्रकट यदि पूर्व हीटिंग के लिए हलचल पट्टी के साथ समाधान मिलाएं.
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्टोर समाधान जब तक जरूरत है.
- लंबी अवधि के storag के लिएई, महीनों के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर भविष्य में उपयोग के लिए agarose समाधान की दुकान. दव्र को माइक्रोवेव में गर्म कर लें. Agarose समाधान के दोहराया हीटिंग के लिए, गर्म बाँझ आसुत जल के साथ अपने आरंभिक वजन को बनाए रखने के लिए हीटिंग से कुप्पी तौलना.
- पहले 2 के रूप में वर्णित papain आधारित सेल हदबंदी के लिए निम्न समाधानों को तैयार:
- बाँझ फिनोल DPBS लाल युक्त में papain (100 यू / एमएल), सिस्टीन (0.2 मिलीग्राम / एमएल) और DNase (250 यू / एमएल) के साथ एक papain समाधान.
- गोजातीय सीरम albumin के साथ एक ovomucoid समाधान (बीएसए, 8 मिलीग्राम / एमएल), सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला (8 मिलीग्राम / एमएल)) और DNase (250 यू / एमएल) बाँझ फिनोल लाल युक्त DPBS में.
फ़िल्टर दोनों के समाधान बाँझ और फिनोल लाल युक्त DPBS के मूल रंग वापस करने के लिए पीएच को समायोजित.
- सेल संस्कृति मीडिया (नो / B27) तैयार करें: 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी एल glutamine, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) और B27 पूरक साथ बेसल मीडिया के पूरक. Filteआर बाँझ और प्रकाश से रक्षा करते हैं. उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया और 5% सीओ 2 संतुलित करना.
- FACS बफर तैयार: 5% भ्रूण गोजातीय सीरम DPBS में (FBS). 47.5 मिलीलीटर DPBS के लिए 2.5 एमएल FBS जोड़ें.
- पाली डी lysine (पीडीएल) लिपटे coverslips तैयार करें.
- आटोक्लेव नया कांच coverslips.
- कोट पीडीएल के साथ coverslips (बाँझ आसुत जल में 100 माइक्रोग्राम / एमएल) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं या रात भर कमरे के तापमान.
- धो बाँझ आसुत जल के साथ coverslips. नायब / B27 मीडिया के साथ एक बार धोएं. Coverslips का उपयोग करने से पहले टिशू कल्चर हुड में पूरी तरह से सूखी.
ऊतक स्लाइस की 2 विच्छेदन और तैयारी
- विच्छेदन के दिन, एक शोषक पैड के साथ 70% इथेनॉल और कवर के साथ विच्छेदन क्षेत्र नीचे पोंछे.
- नसबंदी थैली से विच्छेदन उपकरण निकालें. बर्फ ठंड, बर्फ पर एक छोटा सा पेट्री डिश और जगह को बाँझ DPBS / 1% पी / एस जोड़ें.
- सिर काटना पी 4 Math1-GFबड़ी शल्य कैंची के साथ पी / nestin-पाकिस्तानी माउस पिल्ले तो ठीक घुमावदार संदंश के साथ सिर नीचे पकड़. त्वचा निकालें और धीरे ठीक संदंश तो एक रंग का उपयोग खोपड़ी से मस्तिष्क बाहर निकालना और DPBS / 1% पी / एस युक्त पेट्री डिश को हस्तांतरण # 5 के साथ खोपड़ी दूर छील.
- # 5 ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान से मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से सेरिबैलम अलग. यथासंभव जल्दी से एक समय में एक पिल्ला टुकड़े करना सुनिश्चित करें.
- आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त NEPs प्राप्त करने के लिए 8 cerebella की एक न्यूनतम जमा.
- 3% कम पिघलने तापमान agarose समाधान के साथ 2 एक्स 2 एक्स 2 सेमी को मापने के लिए एक एम्बेड ढालना भरें. Agarose के तापमान अधिक नहीं 37 डिग्री सेल्सियस है कि सुनिश्चित करें.
- एक प्रयोगशाला ऊतक पर धीरे dabbing द्वारा सेरिबैलम से अतिरिक्त तरल निकालें. एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में मोल्ड में सेरिबैलम रखें. यह जल्दी जमना करने की अनुमति बर्फ पर मोल्ड रखें. ब्लॉक प्रति ~ 4 cerebella का प्रयोग करें.
- ली प्राप्तएक हिल ब्लेड vibratome साथ ving ऊतक वर्गों. एक धार के साथ cerebella युक्त agarose ब्लॉक ट्रिम. एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में उन्मुख cerebella साथ vibratome थाली को agarose ब्लॉक गोंद.
- नीचे ठंडा बाँझ DPBS / 1% पी / एस और जगह बर्फ के साथ vibratome की ट्रे भरें.
- सेरिबैलम की पूरी लंबाई के माध्यम से 600 माइक्रोन वर्गों में कटौती. एक छिद्रित चम्मच का उपयोग कर बर्फ ट्रे से वर्गों लीजिए. बर्फ पर DPBS / 1% पी / एस से भरा एक पेट्री डिश में रखें वर्गों.
3 Microdissection और सेल हदबंदी
- एक फ्लोरोसेंट विदारक खुर्दबीन के नीचे ऊतक स्लाइस युक्त पेट्री डिश रखें.
- ध्यान से (चित्र 1 में बिंदीदार रेखा को देखें) पाकिस्तानी + आणविक परत और GFP + EGL के बीच में विदारक से ठीक संदंश का उपयोग अनुमस्तिष्क खंड के बाकी हिस्सों से EGL अलग. में परिणाम होगा, जो आणविक परत के किसी भी भाग में शामिल नहीं करने के लिए सावधान रहेंnestin व्यक्त Bergmann glia के प्रदूषण.
- जितना ज्यादा हो सके इस चरण को पूरा और कोशिका मृत्यु से बचने के लिए बर्फ पर ऊतक रहते हैं.
- अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले ऊतक आसपास agarose निकालें.
- पहले एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए 2 में वर्णित के रूप में एक papain आधारित प्रोटोकॉल का उपयोग microdissected EGL ऊतक डाइजेस्ट.
- FACS के माध्यम से पाकिस्तानी पॉजिटिव कोशिकाओं के संग्रह के लिए FACS बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित.
4 सेल छँटाई और चढ़ाना
- एक उपयुक्त पाकिस्तानी फिल्टर युक्त और बर्फ पर FACS बफर में कोशिकाओं को इकट्ठा कोशिकामापी एक बाँझ, उच्च गति प्रवाह का उपयोग पाकिस्तानी प्रतिदीप्ति के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं. प्रत्येक पी 4 सेरिबैलम से लगभग 100,000 NEPs प्राप्त करते हैं.
- 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं. आगे प्रयोग के लिए आणविक विश्लेषण या संस्कृति के लिए तुरंत कोशिकाओं का प्रयोग करें.
- संस्कृति कोशिकाओं को, पूर्व गर्म नायब / B27 मीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबितपीडीएल लेपित coverslips पर edia और थाली के रूप में पहले 2 का वर्णन किया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, अनुमस्तिष्क स्लाइस जिसमें अनुमस्तिष्क EGL GFP- व्यक्त GNPs का वर्चस्व था और आणविक परत पाकिस्तानी पॉजिटिव glial कोशिकाओं से समृद्ध था, पी 4 Math1-GFP / nestin-पाकिस्तानी चूहों से तैयार थे. (; चित्रा 1 ए धराशायी रेखा के साथ) EGL के गहरे हिस्से में स्थित हैं कि NEPs को अलग करने के लिए, स्लाइस EGL और आणविक परत के बीच microdissected गया. विच्छेदित EGLs (चित्रा 1 बी) तो FACS द्वारा पीछा एंजाइमी हदबंदी के लिए एकत्र किए गए थे.
जैसी कि उम्मीद थी, विच्छेदित EGL में कोशिकाओं के बहुमत (85% से अधिक) GFP (2A चित्रा) के लिए सकारात्मक थे जो पारंपरिक GNPs थे. NEPs EGL सेल जनसंख्या का केवल 5% के आसपास के लिए (पाकिस्तानी +) खाते. लगभग कोशिकाओं से कोई FACS विश्लेषण पर आधारित GFP और हांगकांग के लिए डबल सकारात्मक थे. FACS द्वारा शुद्ध पाकिस्तानी + कोशिकाओं, भेदभाव pote जांच करने के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत थेntial. चित्रा 2B में दिखाया गया है, NEPs विशेष रूप से β ट्यूबिलिन को + न्यूरॉन्स संस्कृति में 4 दिनों के बाद जन्म दिया, सुझाव NEPs वंश प्रतिबंधित neuronal progenitors हैं.
इस microdissection प्रोटोकॉल द्वारा, NEPs और GNPs भी EGL PTC के कमी सेरिबैलम से शुद्ध किया गया. Intracranial प्रत्यारोपण पर, NEPs NEPs oncogenic परिवर्तन 9 के लिए विशेष रूप से अतिसंवेदनशील होते हैं यह दर्शाता है कि GNPs के साथ तुलना में अधिक तेजी से एमबीएस विकास.
EGL microdissection के लिए क्षेत्र के चित्रा 1 पहचान. पी 4 Math1-GFP / nestin-पाकिस्तानी जानवरों से फ्लोरोसेंट छवियों. पाकिस्तानी अभिव्यक्ति का बहुमत आणविक परत में स्थित है, जबकि (ए) GFP अभिव्यक्ति, EGL में स्थित है. Microdissection टी के साथ किया गया थावह पीले बिंदीदार रेखा. (बी) EGLs ऊतक हदबंदी के लिए एकत्र किए गए थे. यह आंकड़ा ली एट अल 9 से संशोधित किया गया है.
चित्रा 2 NEPs EGL में कोशिकाओं की एक छोटी सी आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं और वंश प्रतिबंधित neuronal progenitors हैं. (ए). Microdissected EGL से अलग पाकिस्तानी + कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण (बी) NEPs 4 दिनों के लिए भेदभाव परिस्थितियों में सभ्य और β ट्यूबिलिन (लाल) के लिए दाग रहे थे और DAPI (नीला) के साथ counterstained. यह आंकड़ा ली एट अल से संशोधित किया गया है. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ वर्णित microdissection विधि आणविक और कार्यात्मक विश्लेषण में उपयोग के लिए जीवित कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी को अलग करने में सक्षम पहली प्रक्रिया है. ली एट अल. 9 द्वारा प्रदर्शन के रूप में, इस विधि द्वारा प्राप्त NEPs सभ्य और विभिन्न प्रयोगों में शामिल है और क्योंकि उनके उच्च शुद्धता की, भी माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किया जा सकता है.
यह इस microdissection तकनीक के साथ कुशल बनने के लिए समय लेने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. NEPs nestin व्यक्त Bergmann glia एनईपी सेल अलगाव को दूषित और शुद्धता से समझौता कर सकता है जिसमें आणविक परत, बहुत करीब निकटता में EGL के गहरे क्षेत्र में स्थित हैं. Microdissection इसलिए शामिल नहीं हैं आसन्न ऊतकों में यकीन contaminating कोशिकाओं बनाने के लिए परंपरागत ढंग से किया जाना चाहिए. यहाँ वर्णित microdissection तकनीक का प्रमुख लाभ furthe के लिए संवर्धित किया जा सकता है कि जीवित कोशिकाओं को प्राप्त करने की क्षमता हैआर प्रयोग. इस वजह से, यह इस प्रक्रिया के दौरान सभी कदम जल्दी से किया जा सकता है और ऊतक कि जितना संभव बर्फ पर रखा जाना है कि महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, सभी उपकरणों और अभिकर्मकों बाँझ होना चाहिए. इन कदमों के बाद कोशिका मृत्यु और सेल संस्कृति संदूषण कम हो जाएगा. इसके अलावा, agarose ब्लॉक प्रति बढ़ते कई cerebella प्रक्रिया समय को कम करने में सहायता करेगा.
इस तकनीक NEPs के अलगाव तक सीमित नहीं है और इस तरह के सफेद पदार्थ से आणविक परत और तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से glial कोशिकाओं के रूप में सेरिबैलम के अन्य क्षेत्रों से कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेरिबैलम के अलावा, microdissection उदाहरण के लिए, ऐसे हिप्पोकैम्पस के रूप में पहचानने योग्य क्षेत्रों में होते हैं कि अन्य ऊतकों के साथ प्रयोग किया जा सकता है. यहाँ उपयोग के रूप में फ्लोरोसेंट transgenes के उपयोग, सीमाओं बनाने में सहायता या आसानी से पहचाना क्षेत्रों की कमी है कि ऊतकों में विशेष रूप से सहायक हो सकता है और नहीं तो मीटर होने के लिए सक्षम नहीं होगा जो विच्छेदन के लिए क्षेत्रों की पहचान कर सकते हैंicrodissected. इस तकनीक को इसलिए अनुसंधान क्षेत्रों और आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला में सेल purifications में सहायता कर सकते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों सहायता प्रवाह cytometry के लिए जेम्स Oesterling धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध अमेरिका के राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (R01-CA178380, ZY) और एक अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों Postdoctoral प्रशिक्षण अनुदान (5T32CA009035-37, LWY) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
