Summary
Нестин-выражения предшественники являются недавно выявленный население нейронных клеток-предшественников в развивающемся мозжечке. Используя технику микродиссекции представленные здесь в сочетании с флуоресцентной активированный сортировки клеток, это популяция клеток может быть очищен и загрязнение от других мозжечка регионах и могут культивироваться для дальнейших исследований.
Abstract
Микродиссекция является новым методом, который может выделить конкретные регионы ткани и ликвидации загрязнения из клеточных источников в прилегающих районах. Этот метод был впервые использован в исследовании Нестин-экспрессирующих клеток-предшественников (ПОШ), недавно идентифицированный популяция клеток в коре внешнего зародышевого слоя (EGL). Использование микродиссекции в сочетании с флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS), чистый население ПОШ были собраны отдельно от обычных предшественников гранула нейронных в EGL и от других загрязняющих Нестин-экспрессирующих клеток в мозжечке. Без микродиссекции, функциональный анализ ПОШ не было бы возможно с текущими методов, доступных, таких как Перколла градиентного центрифугирования и лазерного захвата микродиссекции. Этот способ также может быть применен для использования с различных тканей, которые содержат либо распознаваемые участки или флуоресцентно-меченых клеток. Самое главное, главное преимущество этой microdissectioТехника п является то, что изолированные клетки живут и могут культивироваться для дальнейших экспериментов, который в настоящее время не представляется возможным с другими описанными методами.
Introduction
Мозжечок состоит из нескольких слоев клеток, каждый из которых различных типов клеток. Во время разработки, EGL содержит пролиферирующих гранул нейронов прекурсоры (ВНП) в то время как молекулярный слой и Пуркинье слой содержит Bergmann глии и нейронов Пуркинье, соответственно. Глубоко внутри мозжечка лежит белое вещество, которое содержит нервные стволовые клетки (НСК) и олигодендроциты 1.
Еж Соник (Тсс) играет важную роль в регуляции развития мозжечка и, в частности, она способствует распространению ВНП через связывание с его рецептором исправленными (PTC), негативный регулятор Тсс сигнализации 2-4. Ненормальная активация передачи сигналов Shh генерирует медуллобластома (МБ), наиболее распространенной злокачественной опухоли мозга у детей 5,6.
Ptc мутантные MB трансгенные мышиные модели являются мощными инструментами для изучения МБ и развиваться опухоли, напоминающие человеческую МБ 7,8. Используя этимышей, было обнаружено, что ВНП являются клетки происхождения для ежа типа МБ 7. Кроме того, в дополнение к ВНП, недавно мы определили уникальную популяцию нейрональных клеток-предшественников в пределах EGL развивающегося мозжечка, которые также могут повлечь за собой МБ. Эти клетки экспрессируют высокие уровни типа VI промежуточного нитей белка, нестин и называются ПОИ 9. ПОШ находятся в глубоководной части EGL и существуют временно только во время развития неонатальной мозжечка. Они привержены гранула клеточной линии, как ВНП, но различны, поскольку они находятся в состоянии покоя и не выражают Math1, хорошо налаженные маркер для обычных ВНП 10. Кроме того, ПОШ приводят к МБ более эффективно, чем ВНП после активации сигнального пути Тсс 9, что делает их роман происхождения для МБ туморогенеза.
Мы ранее изолированные ПОШ из мозжечка EGL в послеродовой день 4 (P4) по методике микродиссекцииОписанный здесь 9. Микродиссекция через прямого микроскопического визуализации ткани позволяет конкретной рассечения мозжечка EGL. Это необходимо, поскольку Нестин также выражается НСК в белого вещества мозжечка и Bergmann глии в молекулярном слое 1,7,11,12 и это было важно, что эти клетки не могут быть включены, так как они бы посрамить анализ. Клетки, выделенные из ткани микродиссекции можно использовать немедленно для молекулярного анализа или они могут быть выращены в течение дальнейших применений.
Для помощи в специально microdissecting на EGL и для дальнейшей очистки ПОШ, Math1-GFP (зеленый флуоресцентный белок) мышей скрестили с нестин-CFP (голубой флуоресцентный белок) мышей. Транскрипционный фактор Math1 специфически экспрессируется ВНП и выражения GFP отчетливо видна в EGL 9,13. Мышей Нестин-CFP выразить ядерную форму CFP и могут быть легко визуализированы в молекулярном слое 9,14. Вместе, GFP и выражение CFP создать границы для микродиссекции на EGL (рисунок 1). CFP-положительные ПОШ были затем выделяли FACS, после ферментативной диссоциации расчлененных EGLs.
В настоящее время наиболее хорошо использовать метод выделения клеток из EGL является Перколла центрифугирования в градиенте всей мозжечка ткани 15,16. Этот метод, однако, не может полностью исключить клеточных популяций Нестин + от молекулярного слоя и белого вещества, и поэтому не может быть использован для изучения ПОИ. Лазерный микродиссекции захвата, который использует передачу энергии лазера для удаления клеток, представляющих интерес, является еще одним методом, используемым для изоляции специфические клетки в гетерогенной ткани 17,18, но захваченные клетки могут быть использованы только для восстановления ДНК, РНК и белка и не состоянии культивировать.
Этот протокол предоставляет возможность специально изолировать живую, чистую популяцию ПОШ от EGL.Этот способ также может быть применен к различным типам тканей, которые либо узнаваемый анатомической архитектуры или флуоресцентно меченых клеток / регионах. Таким образом, основное преимущество включающий этот новый метод микродиссекции в протоколы изолятор является то, что клетки могут быть выделены из конкретных областей ткани, чтобы исключить загрязнение соседней ткани и клетки могут быть собраны непосредственно для анализа или культивированного для других приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Использование животных в этом протоколе была выполнена в соответствии с процедурами, утвержденными Комитетом по Fox Chase Cancer Center уходу и использованию животных на.
1 Подготовка инструменты, решения и покровные
- Чистые два комплекта # 5 тонких щипцов, один набор # 7 тонкие изогнутые щипцы, одна большая хирургическая ножницами, один microdissecting ножницами, один шпатель и один перфорированная ложка. Поместите инструменты в самоуплотняющейся сумке стерилизации и автоклава. Хранить инструменты в сумке, пока готов к использованию.
- Подготовьте 3% низкой температурой решение температура агарозном.
- Добавить 1,5 г агарозы в 50 мл стерильной Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), затем поместить в микроволновой печи и тепла, пока не появятся пузырьки. Вихревой колбу и нагрева до всех агарозы растворится. Смешайте раствор с мешалкой до нагрева, если появляются комки.
- Магазин решение в C водяной бане 37 ° до необходимости.
- Для долгосрочного Storagе, хранить в агарозном решение для будущего использования при комнатной температуре или при 4 ° С в течение нескольких месяцев. Разогревать в микроволновой печи для сжижения. Для повторного нагрева раствора агарозы, взвешивают в колбе перед нагреванием, чтобы поддерживать свой первоначальный вес теплой стерильной дистиллированной воды.
- Подготовьте следующие решения для папаина на основе диссоциации клеток, как описано ранее 2:
- Папаин решение с папаином (100 ед / мл), цистеин (0,2 мг / мл) и ДНКазы (250 ед / мл) в стерильном фенолового красного, содержащий DPBS.
- Овомукоид решение с бычьим сывороточным альбумином (BSA; 8 мг / мл), ингибитор трипсина соевых бобов (8 мг / мл)) и ДНКазы (250 Ед / мл) в стерильном фенола красного, содержащих DPBS.
Фильтр стерилизовать оба решения и доведения рН до возвращения первоначальный цвет фенола красного содержащих DPBS.
- Подготовка среды для культивирования клеток (NB / B27): дополнить базальной СМИ с 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина (P / S) и B27 дополнения. Filteг стерилизации и защиты от света. Равновесие СМИ при 37 ° С и 5% СО 2 перед использованием.
- Подготовка FACS буфера: 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в DPBS. Добавить 2,5 мл FBS до 47,5 мл DPBS.
- Подготовка поли-D-лизин (PDL) -покрытие покровные.
- Автоклав новые покровные стекла.
- Шерсть покровные с PDL (100 мкг / мл в стерильной дистиллированной воде), и инкубируют в течение 2 ч при 37 ° С или при комнатной температуре в течение ночи.
- Промывочный покровные стерильной дистиллированной водой. Вымойте один раз NB / B27 СМИ. Пусть покровные полностью высохнуть в капот культуры ткани перед использованием.
2 Вскрытие и подготовка тканей Ломтики
- В день вскрытия, протрите рассечение область с 70% этанола и крышкой с абсорбирующей прокладки.
- Удалить рассечение инструменты из пакета стерилизации. Добавить ледяной, стерильные DPBS / 1% P / S в небольшой чашке Петри и место на льду.
- Обезглавьте P4 Math1-GFP / нестин-CFP щенков мыши с большими хирургическими ножницами, затем, удерживая голову с прекрасными изогнутых щипцов. Снимите кожу и осторожно удаляйте череп с # 5 тонкие щипцы затем выкопайте мозг от черепа с помощью шпателя и перенести его в чашку Петри, содержащую DPBS / 1% P / S.
- Использование # 5 тонких щипцов, тщательно отделить мозжечок от остальной части мозга. Будьте уверены, препарировать один щенок в то время, как можно быстрее.
- Собрать минимум 8 мозжечка, чтобы получить достаточное количество ПОШ для молекулярных и функциональных анализов.
- Заполните вложение формы измерения 2 х 2 х 2 см с 3% с низкой температурой плавления раствора температура агарозном. Убедитесь, что температура агарозы не более 37 ° С.
- Удалите излишки жидкости из мозжечка посредством легкого мягко на лабораторном ткани. Поместите мозжечок в пресс-форму в вертикальном положении. Поместите форму на льду, чтобы позволить ему укрепить быстро. Используйте ~ 4 мозжечка на блок.
- Получить ЛиВинг ткани секции с вибрирующей лезвия vibratome. Обрежьте мозжечка, содержащей агарозный блок с бритвенным лезвием. Клей агарозном блока в vibratome пластины с мозжечка, ориентированных в вертикальном положении.
- Заполните лоток из vibratome с ледяными стерильных DPBS / 1% P / S и место льда внизу.
- Cut 600 мкм секции по всей длине мозжечка. Соберите разделы из лотка льда, используя перфорированную ложку. Место секции в чашку Петри, наполненную DPBS / 1% P / S на льду.
3 микродиссекция и диссоциации клеток
- Поместите чашку Петри, содержащую кусочки ткани под флуоресцентным микроскопом рассекает.
- Осторожно отделить EGL от остальной части мозжечка раздела с использованием тонких щипцов путем рассечения промежуточный CFP + молекулярного слоя и GFP + EGL (см пунктирной линией на фиг.1). Будьте осторожны, чтобы не включать любую часть молекулярного слоя, что приведет кзагрязнение нестин-выражения Bergmann глии.
- Этот шаг как можно быстрее и сохранить ткани на льду, чтобы избежать гибели клеток.
- Удалить агарозы, окружающую ткань, прежде чем перейти к следующему шагу.
- Дайджест в микродиссекции EGL ткани с использованием протокола на основе папаин, как описано ранее 2 для получения суспензии отдельных клеток.
- Повторное приостановить клеток в FACS буфере для сбора CFP-позитивных клеток через FACS.
4 сотовый Сортировка и покрытия
- Сортировка клетки для флуоресценции CFP использованием стерильного, высокую скорость потока цитометрии, содержащий соответствующую CFP фильтр и собрать клетки в FACS буфере на льду. Получить около 100000 ПОШ от каждого P4 мозжечка.
- Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин. Немедленно Используйте клетки для молекулярного анализа или культуры для дальнейших экспериментов.
- Для культуры клеток, повторно приостановить клетки в подогретого NB / B27 мEdia и пластины на покровных PDL покрытием, как описано выше 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как показано на фиг.1А, мозжечковые срезы готовили из Р4 Math1-GFP / Нестин-КФП мышей, в котором мозжечка EGL преобладали GFP-экспрессирующих ВНП и молекулярный слой обогащен КФП-позитивных глиальных клеток. Для выделения ПОШ, которые находятся в глубоководной части EGL, срезы микродиссекции между EGL и молекулярного слоя (вдоль пунктирной линии, рисунок 1А). Расчлененный EGLs (Рисунок 1В) были затем собирают для ферментативной диссоциации с последующим FACS.
Как и ожидалось, большинство (более 85%) клеток в расчлененного EGL были обычные ВНП, которые были положительно для GFP (Рисунок 2A). ПОШ (СФП +) приходится лишь около 5% от популяции клеток EGL. Практически ни одна из клеток не было дважды положительно для GFP и CFP на основе анализа FACS. CFP + клетки, очищенные FACS, культивировали в пробирке для изучения дифференциации Potential. Как показано на рисунке 2B, ПОШ исключительно породило β-тубулина + нейроны после 4 дней в культуре, предлагая ПОШ являются Lineage-ограничено нейронные клетки-предшественники.
По этому протоколу микродиссекции, ПОШ и ВНП также очищают от EGL ПТК недостаточной мозжечка. После внутричерепного трансплантации, ПОИ разработки-MB быстрее по сравнению с ВНП, указывая, что ПОИ особенно восприимчивы к опухолевой трансформации 9.
Рис.1 Определение области для EGL микродиссекции. Флуоресцентные изображения с P4 Math1-GFP / Нестин-КФП животных. () Выражение GFP расположен в EGL, в то время как большинство выражения CFP находится в молекулярном слое. Микродиссекция было сделано по тОн желтого пунктирной линией. (B) EGLs были собраны для ткани диссоциации. Эта цифра была изменена с Li и соавт 9.
Рисунок 2 ПОШ представляют собой небольшую популяцию клеток в EGL и линии передачи с ограниченным нейронные клетки-предшественники. (А) проточной цитометрии анализа КФП + клеток, выделенных из микродиссекции EGL. (B) ПОШ культивировали в условиях дифференцировки в течение 4 дней и окрашивали на β-тубулина (красный) и контрастно с DAPI (синий). Эта цифра была изменена с Li и соавт. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод микродиссекции описано здесь первая процедура в состоянии изолировать чистую популяцию живых клеток для использования в молекулярной и функционального анализа. Как показали Li др. 9, ПОИ, полученные с помощью этого метода можно культивировать и включены в различных экспериментах и в силу их высокой чистоты, также могут быть использованы для анализа микрочипов.
Очень важно, чтобы занять время, чтобы стать специалистами в этой технике микродиссекции. ПОШ находятся в глубокой области EGL в непосредственной близости от молекулярного слоя, в котором Нестин-выражения Bergmann глии может загрязнить изоляцию НЭП клеток и скомпрометировать чистоту. Поэтому микродиссекция должно быть сделано консервативно, чтобы убедиться, загрязняющих клетки в соседнюю ткань не включены. Основное преимущество метода, описанного здесь, микродиссекции является возможность получить живые клетки, которые могут быть выращены в течение furtheг экспериментирование. В связи с этим, крайне важно, чтобы все этапы во время этой процедуры можно сделать быстро и, что ткань будет выдерживали на льду в максимально возможной степени. Кроме того, все приборы и реагенты должны быть стерильными. После этих шагов позволит снизить гибель клеток и загрязнения клеточной культуры. Кроме того, монтаж нескольких мозжечка в агарозном блока будет способствовать сокращению времени процедуры.
Эта методика не ограничивается изоляции ПОИ и может быть использован для сбора клеток из других областей мозжечка, таких как глиальные клетки из молекулярного слоя и нейронных стволовых клеток от белого вещества. Кроме мозжечка, микродиссекции может быть использован с другими тканями, которые содержат узнаваемые регионах, таких как гиппокамп, например. Использование флуоресцентных трансгенов, как используется здесь, может помочь в создании границ или идентифицировать области для вскрытия, которые могут быть особенно полезными в тканях, которые испытывают недостаток легко идентифицируемые области и в противном случае не сможет быть мicrodissected. Таким образом, эта методика может помочь в клеточных очисток в широком диапазоне областей исследований и приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Джеймса Oesterling для проточной цитометрии помощи. Это исследование было поддержано грантом Национального института рака США (R01-CA178380, ZY) и учебного гранта Национального института аспирантов (5T32CA009035-37, Lwy).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| PDL | Millipore | A-003-E | |
| Ultra pure low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| DPBS | Gibco | 14190144 |
References
- Lee, A., et al. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Riobo, N. A., Manning, D. R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem J. 403, 369-379 (2007).
- Dahmane, N., et al. The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis. Development. 128, 5201-5212 (2001).
- Marino, S. Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control. Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).
- Yang, Z. J., et al. Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells. Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).
- Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants. Science. 277, 1109-1113 (1997).
- Li, P., et al. A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity. Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
- Sutter, R., et al. Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas. Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).
- Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells. J Neurosci. 14, 124-133 (1994).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Espina, V., et al.
