Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Ensaios de placa continuam sendo um dos métodos mais precisos para a quantificação direta de virons infecciosas e substâncias antivirais através da contagem de placas discretas (unidades infecciosas e zonas mortas celulares) em cultura de células. Aqui demonstramos como realizar um ensaio básico placa, e como sobreposições e técnicas diferentes podem afetar a formação de placas e de produção. Tipicamente substratos sólidos ou semi-sólidos de sobreposição, tais como agarose ou carboximetil celulose, têm sido utilizados para restringir propagação viral, prevenindo a infecção indiscriminada através do meio de crescimento líquido. Sobreposições imobilizadas restringir a infecção celular para a monocamada imediatamente circundante, permitindo a formação de focos contáveis discreta e subsequente formação de placa. Para superar as dificuldades inerentes ao uso de sobreposições tradicionais, uma sobreposição de líquido romance utilizando celulose microcristalina e carboximetilcelulose de sódio tem sido cada vez mais utilizado como um substituto no padrãoensaio de placas. Ensaios de placas de sobreposição líquidos podem ser prontamente realizada em qualquer padrão 6 ou 12 formatos de placas, bem como por técnicas tradicionais e não requerem equipamento especial. Devido ao seu estado líquido e subsequente facilidade de aplicação e remoção, formatos de placas de microcultura podem, alternativamente, ser utilizado como uma alternativa de transferência rápida, precisa e de alta para titulações virais maior escala. O uso de um polímero líquido viscoso aquecido não oferece a oportunidade de agilizar o trabalho, conserva reagentes, espaço incubadora, e aumenta a segurança operacional quando usado em laboratórios de contenção tradicionais ou altos como nenhum aquecimento do reagente ou das suas obras são necessárias. Sobreposições de líquidos podem também revelar-se mais sensível do que as sobreposições tradicionais para determinados calor vírus lábil.
O isolamento precisas e quantificação das amostras virais viáveis tem sido consistentemente um objetivo a investigação em curso em virologia. Não era até o advento do ensaio de placa em 1952 que um meio para calcular quantitativamente e qualitativamente os títulos virais animais foi desenvolvido pela primeira vez 1,2. Esta técnica foi adaptada e modificada a partir de ensaios de fagos, os quais foram anteriormente utilizados para calcular os títulos de banco de bacteriófagos em planta biologia 1,2 primeiro. Enquanto meios alternativos para quantificação viral desde então têm sido desenvolvidos e adaptados, como imunoensaios, fluorescência e microscopia eletrônica de transmissão, ajustável de detecção de pulso resistiva (TRPS), citometria de fluxo, sistemas de repórter recombinantes, e reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase com transcrição (qRT-PCR) , esses métodos não conseguem identificar e quantificar replicação virons competentes 1,3. Embora os avanços nas tecnologias e técnicas de continuar a aperfeiçoar e alterar a paisagem; PLAQUE os ensaios continuam a representar o padrão ouro na determinação das concentrações virais para virons líticas infecciosas 1,4.
Durante um ensaio de placa, uma monocamada confluente de células hospedeiras está infectado com um vírus lítico de uma concentração desconhecida que foi diluída em série para uma gama contáveis, tipicamente entre 5-100 viriões. As monocamadas infectadas são então coberto com um meio de cobertura de imobilização para impedir a infecção viral a partir de indiscriminadamente, quer através de difusão do fluxo de convecção mecânica ou do meio líquido durante a propagação viral. Apesar da sobreposição sólidas ou semi-sólidas, tais como agarose, metilcelulose ou carboximetilcelulose (CMC) têm sido tradicionalmente utilizados, sobreposições de líquidos tornaram-se cada vez mais uma alternativa atraente, com o desenvolvimento de novas folhas de prova de líquidos, tais como Avicel 5- 7. Ensaios de placa utilizando líquido contra sobreposições tradicionais têm várias vantagens como a sobreposição pode ser applied à temperatura ambiente, e a aplicação e remoção é significativamente mais fácil. Como sobreposições líquidos não requerem aquecimento, vírus lábil delicados e de calor também pode revelar-se mais fácil de placa.
Após a infecção inicial e aplicação da sobreposição imobilizante, placas individuais, ou zonas de morte celular, irá começar a desenvolver infecção como a replicação viral e são constrangidas para a monocamada circundante. As células infectadas irão continuar o ciclo de replicação de lise-infecção, mais de propagação da infecção, resultando em placas cada vez mais distintos e separados. Dependendo da cinética de crescimento viral e célula hospedeira utilizada, uma placa visível forma, normalmente, dentro de 2-14 dias. As monocamadas celulares podem então ser contadas com um microscópio de campo brilhante padrão, ou mais tipicamente fixo e contrastadas pelo vermelho ou cristal violenta neutro, a fim de identificar prontamente placas a olho nu. Há uma grande variedade de contra placa manchas disponíveis, cada oferta their vantagens e desvantagens específicas. O violeta de cristal é tipicamente adicionado na altura da recolha e após a fixação / remoção da cobertura, proporcionando um contador de mancha rápida e distinta, que permite a identificação de placas muito pequenas quando morfologia mista está presente. Vermelho neutro tem a vantagem de aplicação antecipada e constante contato com a sobreposição, permitindo o monitoramento ao vivo de desenvolver a formação de placas, o que é particularmente útil quando se trabalha com um desconhecido cinética de vírus ou de replicação. Nós descobrimos que a coloração no entanto não é geralmente tão distinta quando utilizando vermelho neutro. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) oferece diversas vantagens, como as manchas de cor amarelo vivo corantes células placas azuis escuras e virais podem ser contados, sem remoção da sobreposição quanto com vermelho neutro. O alto contraste entre as células vivas e mortas oferecidas pela MTT também permite a detecção de pequenas placas em uma hora mais cedo a infecção ponto pós, Apesar de armazenamento ainda exigiria a remoção da cobertura 8. Como violeta de cristal pode ser feita simplesmente em uma solução de água e álcool, e proporciona um elevado grau de sensibilidade para a morfologia da placa mista, optámos-lo como um contador de manchas preferido e simplificado para o protocolo como demonstrado que estamos utilizando várias famílias de bem vírus caracterizados.
Após fixação e coloração da monocamada celular infectada, as placas são contadas no fim titule banco de amostras virais em termos de unidades formadoras de placas (pfu) por mililitro. Uma gota de registo deve ser observado entre diluições em série e, dependendo do tamanho da placa, entre as placas foram contadas 5-100, com um controlo negativo utilizado como uma referência. Amostras estatisticamente irá variar em 10% para cada 100 placas contados quando se compara amostra replica 3. A vantagem de usar ensaios de placas para determinar os títulos virais reside na sua capacidade para quantificar o número real de partículas virais infecciosas within a amostra. Como múltiplos viriões poderia potencialmente infectar uma célula única, a terminologia de unidades contra virons é utilizado durante as titulações em placa 1,2.
Morfologia da placa pode variar drasticamente sob diferentes condições de crescimento e entre espécies virais. Tamanho da placa, a clareza, a definição das fronteiras, e distribuição devem todos ser notado como eles podem fornecer informações valiosas sobre o crescimento e fatores de virulência de vírus em questão.
Os princípios básicos da placa de ensaio também pode ser adaptado e modificado num número de maneiras diferentes, tais como no uso de ensaios de formação de foco (FFAs). FFAs não dependem de lise celular e de contraste para detectar a formação de placa, mas sim empregar técnicas para detectar diretamente as proteínas virais intracelulares através de anticorpos marcados imunomarcação. O aumento da sensibilidade, diminuição dos tempos de incubação após a infecção, e mais importante a capacidade para quantificar os vírus não-líticos são todos distintosvantagens quando se emprega FFAs. Embora amplamente utilizados, os factores críticos que limitam FFAs em comparação com um ensaio de placa tradicional reside na necessidade de anticorpos apropriados e a capacidade de somente sonda para subunidades de proteínas virais contra viriões infecciosos 4 reais.
Para o propósito deste estudo, vamos limitar nossa discussão para ensaios de placa clássicos e descrever o uso de sobreposições de sólidos e semi-sólidos tradicionais (agarose e CMC), juntamente com novas sobreposições de celulose líquido microcristalinas.
O factor mais crítico para um ensaio de placa de sucesso encontra-se na optimização do protocolo para a cultura viral particular em questão como condições podem variar significativamente. Pontos-chave a ter em conta são: sediar compatibilidade celular com o vírus em questão, as condições de crescimento virais apropriadas, faixas de diluição suficientes, a fim de diferenciar claramente placas e seleção sobreposição correta e coloração para as células e os vírus em questão.
Enquanto VEEV e RVFV tanto crescer sob condições muito semelhantes, utilizando muitos dos mesmos tipos de células hospedeiras, as diferenças na cinética de crescimento e morfologia de placas variar significativamente. Ao usar células Vero para ensaios de placa, que têm sido usados tradicionalmente como uma linha de células de propagação e indicador de vírus da febre hemorrágica e alphaviruses, VEEV tipicamente cresce para títulos mais altos do que RVFV e demonstra um aumento da cinética de replicação, o desenvolvimento de placas uniformes grandes às 48 hpi 4, 10-12. Em contraste com VEEV, RVFV requer 72 hpi e demonstra placas que são tipicamente muito menor e variável em tamanho.
Em oposição a RVFV e VEEV, o vírus da gripe é altamente específico da célula hospedeira e pode ser difícil de propagar através de cultura de tecidos. Para o vírus da gripe, a entrada viral e fusão é normalmente iniciado pela ligação do receptor da superfície celular com a glicoproteína hamagglutinin viral (HA), que medeia a entrada na célula-alvo através da ligação com o receptor da superfície ácido siálico-α da célula hospedeira. HA trimérico é uma glicoproteína que está presente no envelope da membrana de todos os vírus Influenza e requer clivagem para a subunidades HA1 e HA2 por uma protease célula hospedeira específica. Para complicar ainda mais a questão, estes sítios de clivagem muitas vezes pode variar entre 13 cepas virais. À medida que a expressão de proteases capazes de clivar HA é restrita a tecidos específicos, proteases ARe frequentemente adicionadas ao meio de cultura de células, a fim de facilitar a fusão viral e a entrada na célula hospedeira seleccionada 13. TPCK-tripsina é um exemplo de uma protease vulgarmente utilizado que é usado em cultura de células MDCK com ambos e células Vero: facilitar a replicação multi-ciclo (na ausência de qualquer soro de inactivação da tripsina) por meio da activação proteolítica de HA viral 14,15.
Como demonstrado neste estudo e outros, as diferenças no ciclo de vida viral pode influenciar seleções de sobreposição, formatos de placas, e tempos de coleta, com variações significativas entre as diferentes classes e espécies de vírus. Em nosso estudo, camadas de agarose demonstrou placas claras em títulos mais elevados do que qualquer CMC ou sobreposições de líquidos, tanto para RVFV e vírus Influenza B, reforçando sua utilidade entre uma ampla gama de vírus e tipos de células. Usando uma baixa concentração final de agarose muito auxiliado na remoção dos plugues sólidos e coloração simplificada. CMC global mostrou a poorest eficácia como uma cobertura para todos os três vírus testados e muito pequenas e indistintas placas produzidas para o vírus da Influenza B. Embora CMC global mostrou as características menos desejáveis, a sua utilização em rápido crescimento e extremamente virulentas vírus poderia revelar-se vantajoso, como o fez aparecer para reduzir o tamanho da placa com apenas uma redução mínima na titulação. A sobreposição de líquido provou ser o mais versátil na medida em que era extremamente simples de preparar, maior facilidade de utilização, e a agarose foi comparável em todos os vírus seleccionados. Num formato de placa de maior rendimento de 96 poços, aplicação e remoção não foi inibida devido à solidificação como com sobreposições tradicionais, e proporcionaram resultados precisos e consistentes. A consideração ao usar sobreposições de líquidos reside na coloração opaca e incapacidade de controlar a formação de placas como as placas não podem ser movidos até o ponto de coleta, limitando essa adaptação ao vírus com cinética de replicação anteriormente caracterizados.
<pclass = "jove_content"> Pequenas modificações nas condições de ensaio de placa pode alterar significativamente os resultados, bem como a avaliação e desempenho de qualquer novo sistema ou técnica é sempre garantido. Enquanto um protocolo de ensaio de placa otimizada e padronizada não existe para cada situação, o nosso relatório demonstram a versatilidade e facilidade de uso em tradicional, bem como sobreposições de líquidos para novos ensaios de placa, proporcionando um fundo suficiente para mais modificações do usuário.The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |