Abstract
Plak deneyleri, hücre kültüründe ayrı plaklar (bulaşıcı birimleri ve hücresel ölü bölgeler) olarak sayma ile bulaşıcı Virionlar ve antiviral maddelerin doğrudan ölçümü için en doğru yöntemlerden biri olmaya devam etmektedir. Burada biz bir temel plak deneyi gerçekleştirmek için nasıl göstermek, ve ayrılan bindirmeleri ve teknikleri plak oluşumunu ve üretimini etkileyebilir nasıl. Tipik haliyle, örneğin agaroz ya da karboksimetil selüloz gibi bir katı veya yarı-katı katlamalı alt-tabakalar, likit büyüme ortam içinden geçerek gelişigüzel enfeksiyonun önlenmesi, viral yayılmayı sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Hareketsizleştirilmiş kaplamalar ayrık sayılabilir odakları ve daha sonra, plak oluşumunun oluşumuna izin hemen saran tek tabaka hücresel enfeksiyonu kısıtlar. Geleneksel kapaklar kullanıldığında doğasında zorlukların üstesinden gelmek için, mikrokristalin selüloz ve karboksimetil selüloz sodyum kullanan yeni bir sıvı kaplama artan standart bir yedek olarak kullanılmaktadırplak deneyi. Sıvı bindirme plak tahlilleri kolayca geleneksel tekniklerine göre standart 6 veya 12 sıra plaka biçimlerinden birinde yapılan ve hiçbir özel ekipman gerektirmez edilebilir. Nedeniyle sıvı bir halde ve uygulanması ve kaldırılması daha sonra çok kolay olduğu için mikro-plak formatlarını alternatif büyük ölçekli bir viral titrasyon için, doğru, hızlı ve yüksek kapasiteli bir alternatif olarak kullanılabilir. Isıtılmayan viskoz sıvı polimer kullanımı, çalışmalarını düzene fırsatı sunuyor reaktifleri, kuluçka alanı, ve hiçbir reaktif ısıtma veya cam gibi geleneksel ya da yüksek tutma laboratuvarlarında kullanılan operasyonel güvenlik gereklidir artar korur. Sıvı bindirmeleri de belirli ısıya dayanıksız virüsler için geleneksel bindirmeleri daha duyarlı ispat edebilir.
Introduction
Canlı viral örneklerin doğru izolasyon ve miktar tutarlı viroloji devam eden bir araştırma hedefi olmuştur. İlk 1,2 geliştirilen bir araç nicelik ve nitelik hayvan viral titreleri hesaplamak için 1952 yılında plak denemesinin gelişiyle kadar değildi. Bu teknik ilk olarak adapte ve daha önce bitki biyolojisi 1,2 stok bakteriyofajların titreleri hesaplamak için kullanılır olmuştu faj deneyleri, modifiye edildi. Viral tayini için alternatif vasıtalar bu yana bu tür bağışıklık, floresans ve transmisyon elektron mikroskopisi, ayarlanabilir darbe dirençli algılama (TRPS) olarak geliştirilmiş ve adapte edilmiş olmakla beraber, sitometrisi yeniden birleşmiş muhbir sistemleri, akış ve kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) bu yöntemler, kopyelemeye yetkin Virionlar 1,3 tanımlama ve miktarını belirlemede başarısız olur. Teknolojiler ve teknikler gelişmeler rafine ve görünümünü değiştirecek devam ederken; plaque deneyleri bulaşıcı litik Virionlar 1,4 viral konsantrasyonlarını belirlemede altın standardı temsil etmeye devam.
Bir plak deneyi esnasında, konakçı hücrelerinin konfluent tek tabaka seri 5-100 virionlann arasında tipik haliyle, bir sayılabilir dizi seyreltildikten bilinmeyen bir konsantrasyonda bir litik virüs ile enfekte edilir. Enfekte tek tabakalar daha sonra gelişigüzel virüs yayılması sırasında, sıvı ortamın mekanik ya da konveksiyon akımı ya da yayılan viral enfeksiyonunu önlemek için bir hareketsizleştirme katlamalı ortamı ile kaplıdır. Örneğin agaroz, metil selüloz ya da karboksimetil selüloz (CMC) gibi katı veya yarı-katı kaplamalar geleneksel olarak kullanılmış olsa da, sıvı kaplamalar, Avicel 5 ila 7 olarak yararlı olan yeni bir sıvı bindirmeleri gelişmesiyle giderek daha çekici bir alternatif haline gelmiştir. Bindirme olabilir gibi geleneksel bindirmeleri karşı sıvı kullanan plaka tahlilleri appl çeşitli avantajları vardırOda sıcaklığında, ve uygulama ve boşaltılması esnasında ied önemli ölçüde daha kolaydır. Sıvı bindirmeleri ısınma gerekmez gibi, hassas ve ısıya dayanıksız virüsler de plak daha kolay ortaya çıkabilir.
Ilk enfeksiyon ve hareketsizleştirici yerleşimi, tek tek plaklar veya hücre ölümü bölgeleri uygulanmasından sonra, viral enfeksiyon ve replikasyon çevreleyen tek tabaka ile sınırlı olan geliştirmeye başlar. Enfekte hücreler, replikasyon parçalama Enfeksiyondan döngüsü devam ayrıca artan bir ayrı ve farklı plaklar ile sonuçlanan, enfeksiyon ilerleyen olacaktır. Kullanılan viral büyüme kinetikleri ve konakçı hücreye bağlı olarak, görünür bir leke, normal olarak 2-14 gün içinde oluşturacaktır. Hücresel monokatmanlar kolayca çıplak gözle plaklar tanımlamak için daha sonra standart bir aydınlık alan mikroskobu ile sayılabilir, ya da daha tipik nötr kırmızı veya şiddet kristal sabit ve zıt olabilir. Mevcut plak karşı lekeleri çok çeşitli, her sunan inci varEIR özgü avantajları ve dezavantajları. Kristal viyole tipik haliyle karışım yapısındaki mevcut olduğu zaman, çok küçük plaklar belirlenmesine izin veren bir hızlı ve farklı karşı leke sağlayan toplama noktasında ve bindirmenin sabitleme / çıkarılmasından sonra ilave edilir. Nötr kırmızı, bilinmeyen bir virüs ya da çoğaltma kinetiği ile çalışırken yararlıdır plak oluşumu, özellikle gelişmekte olan canlı izlenmesi için izin erken uygulanması ve bir kaplama ile sürekli temas avantajına sahiptir. Biz ancak nötr kırmızı ile lekeleme, tipik bir biçimde farklı olmadığını bulduk. Sarı renkli boya lekeler koyu mavi ve viral plaklar kaplamanın kaldırılması gibi olmadan sayılabilir hücrelerin canlı olarak 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolyum bromürde (MTT), birkaç avantaj sunar nötr kırmızı. MTT ile elde canlı ve ölü hücreleri arasındaki yüksek kontrastlı, daha erken bir zaman noktası, enfeksiyondan sonraki küçük plaklar tespit edilmesine izin verir, Depolama hala bindirme 8 çıkarılmasını gerektirecek olsa da. Kristal mor basit olarak su ve alkol çözeltisi yapılmış ve karışık Plak için yüksek bir hassasiyet derecesi içerir üzere protokol biz de çok sayıda yapı kullanılarak olarak gösterdi sağlamak için, tercih edilen ve basitleştirilmiş karşı leke olarak seçti özelliği virüsleri bulunmaktadır.
Enfekte hücresel mono-katman, sabitleme ve boyama sonrasında, plakalar mililitre başına plak oluşturucu birim (pfu) cinsinden viral stok numuneleri titre etmek için sayılmıştır. 5-100, plaklar bir referans olarak kullanılan bir negatif kontrol grubuna, sayılan arasında bir günlük damla, plaka boyutuna bağlı olarak, seri seyreltileri ile not edilmelidir. İstatistiksel örnekleri örnek karşılaştırarak 3 çoğaltır sayılır, her 100 plaklar için% 10 oranında değişir. Viral titreleri belirlemek için plak tahliller kullanılarak avantajı ağırlık Bulaşıcı viral parçacıkların fiili sayısı miktarını belirlemek için kendi yatmaktadırörnek ithin. Birden çok virionları ve potansiyel olarak tek bir hücre enfekte olabilir zamanda, Virionlar karşı birimleri terminolojisi plak titrasyonu ya da 1,2 sırasında kullanılır.
Plak önemli ölçüde farklı gelişim koşulları altında ve viral türler arasında değişebilir. Onlar söz konusu virüsün büyüme ve virülans faktörleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilir olarak plak boyut, berraklık, sınır tanımı ve dağıtım tüm unutulmamalıdır.
Temel plak deneyi ilkelerin aynı zamanda uyarlanmış ve fokus oluşturucu tahlillerde (SYA) olarak kullanılmasında olduğu gibi, farklı şekillerde, bir dizi modifiye edilebilir. SYA'leri plak oluşumunu tespit etmek için hücre erimesi ve counterstaining güveniyor değil, doğrudan doğruya etiketli antikorlar aracılığıyla hücre içi viral proteinleri tespit teknikleri immünboyama istihdam yok. Artan hassasiyet, en önemlisi litik olmayan virüsleri, her farklı olan miktarını belirlemek için yeteneği, enfeksiyondan sonra bir bekleme süresi azalmış veavantajlar SYAleri kullanıldığında. Yaygın olarak kullanılmakla beraber, geleneksel bir plak deneyi kıyasla FFAs olarak kritik sınırlayıcı faktörler, uygun antikorlar için ihtiyaç ve fiili enfeksiyon Virionlar 4 karşısında virüs protein alt-birimleri, yalnızca sondaya yatmaktadır.
Bu çalışmanın amacı sağlamak için, klasik Plak analizi için kısıtlayacağız ve yeni sıvı mikrokristal selüloz bindirmeleri ile birlikte geleneksel katı ve yan katı bindirmeleri (agaroz CMC) kullanımını tarif etmektedir.
Protocol
Hücreler ve Reaktiflerin hazırlanması 1.
- % 100 konfluansa - bir gün önce, söz konusu virüs için tahlil, levha, uygun konakçı hücrelerde (Tablo 1 ve 2) kullanılarak, 90 için.
- DH 2 O% 10 formaldehit tespit solüsyonu hazırlayın Örnekte, 14.44 ml damıtılmış H2O (DH 2 O) ile% 36 stok formaldehid 5.56 ml karıştırın.
NOT: Uygun güvenli kullanım uygulamaları ve havalandırma formaldehit kullanılarak. - Kristal mor leke hazırlayın:% 1 Crystal Violet (CV)% 20 etanol ve dH 2 O
- 2x plak ortam (2x konsantrasyonda bağımlı hücre tipi, Tablo 2 ye bakınız) hazırlayın. Herhangi reaktifler steril değilse 0.2 mikron filtre kullanarak filtre.
- Hareketsizleştirir bindirmeleri hazırlanması (Tablo 3)
- Sıvı bindirmeleri için, dH 2 O Avicel'e bir steril% 2.4 solüsyonu yapmak Kümeleşmesini önlemek üzere, inci su ihtiva eden bir şişeye tozu ilavehızlı bir karıştırma çubuğuna sahip olan karıştırma ile, yavaş yavaş Avicel dökün ve oda sıcaklığında (RT) hızlı bir şekilde karıştırıldı. Çözelti bir karıştırma çubuğu homojenize etmek için çok viskoz kaldığı zaman bile homojenleştirilme yoğun çalkalama ile> 30 dakika boyunca bir şişeye bir karıştırıcı geçin.
Not: stok çözeltileri daha düşük konsantrasyonlarda yapılabilir, fakat solüsyonlar ayrı olabilir ve homojen hale getirilmesini sağlamak için karıştırılmalıdır gerekecektir. Avicel çalışma solüsyonları 0.6-3% arasında değişen kullanılabilir. - Homojenizasyon sonra, oda sıcaklığında kapalı çözüm ve mağaza otoklav.
- Agaroz ve karboksimetil selüloz (CMC), şablon için, dH 2% 2 CMC ya da% 0.6 agaroz O içinde bir stok çözelti hazırlayın. Çözüm haline getirmek için bir karıştırma çubuğu ve otoklav veya mikrodalga ile karıştırın.
- Sıvı bindirmeleri için, dH 2 O Avicel'e bir steril% 2.4 solüsyonu yapmak Kümeleşmesini önlemek üzere, inci su ihtiva eden bir şişeye tozu ilavehızlı bir karıştırma çubuğuna sahip olan karıştırma ile, yavaş yavaş Avicel dökün ve oda sıcaklığında (RT) hızlı bir şekilde karıştırıldı. Çözelti bir karıştırma çubuğu homojenize etmek için çok viskoz kaldığı zaman bile homojenleştirilme yoğun çalkalama ile> 30 dakika boyunca bir şişeye bir karıştırıcı geçin.
2. Seyreltmeler ve Enfeksiyonlar
- Günlük kuluçkadan sonra görsel olarak Deneye başlamadan önce, hücrelerin birleşik duruma ve yaşayabilirliğini de kontrol edin. Standart hücresel morfoloji a sağlamaknd ~% 90 sık tek tabaka mevcuttur.
- Bulaşıcı örneklerin on kat seri seyreltme gerçekleştirin. Seyreltici (Tablo 2) gibi viral çoğalma için bir hücresel büyüme ortamı kullanın. Söz konusu virüsün beklenen titresi dayalı gerekli seyreltilerin sayısını Vary, ve her zaman bağımsız plak kimlik hücresel canlılığı ve yardım sağlamak için bir bulaşmamış kontrol örneği kullanın.
- Seri seyreltiler kaynaktan, 1 saat karıştırıldı (Tablo 1) 45 dakika boyunca hücreleri enfekte etmektedir. Mümkün olduğu kadar düşük bir hacmini tutan tek tabaka (Tablo 4), viral temasını maksimize etmek için ise, hücreleri kapsayacak şekilde aşı yeterli bir hacmi kullanın. Yavaşça kaya plakaları her 20 dk kapsama hatta sağlamak ve kuruma hücresel tek tabaka önlemek için.
- 2x plak medya ve Hareketsizleştirme 1 karışımını: Enfeksiyondan sonra, 1 kullanılarak (Tablo 2) 'de mikroorganizma doğrudan ortam hareketsiz uygun bir hacim kaplamasıseçim kaplamasını ing (CMC, agaroz ya da Avicel®). Hafifçe karıştırın sallayın.
- 0,6-1,2% Avicel bindirme orta çalışan bir çözüm elde etmek için% 2.4 RT stok Avicel'e - ısındı 2x plak medya ve 1.2 ile 1: Sıvı paylaşımları, 1 karıştırın.
- 0.3 nihai bir agaroz / katlamalı konsantrasyonu elde sıcaklığına dengelenmeye 30 dakika için 56 ° C su banyosu içinde ısıtıldı 2x plak ortam 1 karışımını ısıtıldı% 0.6 agaroz içinde bir stok çözeltisi, yeri: bir agaroz bindirme için, 1 kullanın %.
- CMC için, bir% 2 stok solüsyonu hazırlanır ve agaroz bindirme için tarif edildiği gibi muamele.
- Tabakasına bindirme uygularken, her zaman tek tabaka zarar görmesini önlemek için 56 ° C su sıcak agarozun veya CMC dengelenmesi. Solüsyon sıcak olduğundan emin olun, ancak hücre ölümü ve düşük viral titreleri önlemek için dokunulmayacak kadar sıcak değil. En agaroz bindirmeleri, 42 ° C'nin altında katılaşmaya başlar hızlı çalışır ve / veya taşıma sırasında katılaşma önlemek için küçük gruplar halinde hazırlayacaktır.
- Kaplamanın ilave edildikten sonra, açıkça sayılabilir olan ayrı plaklar üretmek üzere inkübe edin. Plak oluşumu, virüse bağlı olarak 2-14 gün analiz ediliyor Tablo 1 alabilir.
NOT: Sıvı Kaplanmış plakalar inkübatör konduğunda, onları hareket yok. Kuluçka süresi boyunca sıvı bindirmeleri hareket smear istilanın neden olur. Agaroz ve CMC bindirmeleri yarı katı ve taşınır veya plak gelişimini izlemek için bir ışık mikroskobu altında periyodik olarak kontrol edilebilir.
3. Tespit ve Boyama Hücreler
- , Hücrelerin tespit edilmeleri dökülür ya da Avicel bindirme havalandırın, ve (6 delikli plaka için <1 mi, her bir kuyucuk) bir karışımı, 30 dakika boyunca% 10 formaldehid çözeltisi kullanılarak hücreleri düzeltmek için.
- Agaroz veya CMC için, doğrudan 1 saat gecede için bindirme için formaldehit çözüm ekleyin.
NOT: Örnekler sabitleştirici uzun süre muhafaza edilebilir yapar sağlananbuharlaşması ve bu tek tabaka bozabilir gibi kurumaz.
- Agaroz veya CMC için, doğrudan 1 saat gecede için bindirme için formaldehit çözüm ekleyin.
- Önceki boyama ve tespit sonrasında, formaldehit atmak ve bir spatula ile manuel akan su ya da biriyle agaroz ve CMC'nin yarı katı fişlerini çıkarın. Boyamadan önce bakiye katlamalı / fiksatif çıkartılması için su ile Avicel® plaklar durulayın.
- Boyama için, ~ 15 dakika boyunca kristal menekşe renkli çözelti bir az miktarda hücreleri kapsar. Rock plates gerekirse bile kapsama sağlamak.
- Yavaşça su ile kristal mor leke yıkayın. Bir kez, sabit, lekeli ve gelecek analizi için süresiz, mağaza plaklar kurutulmuştur.
4. viral titreleri belirlenmesi
- Aynı seyreltme teknik kopya için ortalaması alınarak, herbir göz içindeki plaklar sayın. Büyük levha formatları için, 100 plaklardan çok daha 5 daha az veya daha büyük indirim kuyu. Plak boyutu ve morfolojisi not alın. Negatif kontrol düzgün bir tek tabaka olmalıdır vebir referans kontrol olarak kullanılabilir.
- Bir seyreltme ve toplam seyreltme faktörü ters için plakların ortalama sayısı dikkate alınarak bir stok örneğinden viral titresi belirlenir.
NOT: Bir örnek olarak, 30 ve 32 plaklar, 1 x 10 -7 seyreltme [31 (ortalama) / 10 -7 (dilüsyon) x 0.4 mi (inokulum)] 7,75 arasında bir titreye oluşacaktır 8 x 10 pfu tekrarlar için sayılan / ml olmuştur.
Representative Results
Doğru viral titreleri değerlendirmek için Plak analizi yeteneği, çok sayıda faktöre dayanır: uygun bir konakçı hücre seçimi, uygun bir ortam ve hücre ve virüs canlılığı, büyümesi koşulları, hareketsizleştirilmiş virüs yayılması ve virüs Kuluçka süresinin doğru belirlenmesi farklı için yeterli zaman sağlamak için ve sayılabilir plak oluşumu.
Örnek türleri farklı karşısında kaplama, seçimin, kuluçka dönemleri ve plak morfolojisi: Bu çalışma için, üç temsilci ailelerin virüsler farklılıkları göstermek için seçildi. Venezüella at ensefalit (VEEV) at tür ve insanlarda ciddi hastalığa neden Togaviridae ailesindendir bir (+) ssRNA, viral modeli olarak seçildi. Influenza B Tayvan suşu, bir segmente (-) öncelikle insanlara bulaşmasını ssRNA virüs, Orthomyxoviridae ailesini temsil eder. Ateşli Rift Valley virüsü (RVFV), bir (-) öncelikle eklembacaklıları enfekte ssRNA, artropod doğan virüsü,geviş ve insanlar, Bunyaviridae ailesinin temsilcisi olarak seçildi.
RVFV (Şekil 1) için, titreleri 72 saat sonra enfeksiyonu için yan-yana kuluçkalanmıştır CMC, agaroz ya da Avicel bindirmeleri kullanan bir 12 kuyucuklu bir plaka biçiminde RVFV bir rekombinant canlı zayıflatılmış MP12 soyunun bir stok çözeltiden belirlendi (HPI). 10 -4 10 -7 arasında değişen dilüsyonlarını gösteren bir temsili plaka CMC kullanarak Panel A. Plaketlerinin görülen ve agaroz bindirmeleri iyi tanımlanmış bir dairesel sınırında, küçük, açık ve belirgin plaklar gösterdi edilebilir. Bir sıvı kalıbı ile plaklar biraz daha bol ve CMC plaklar agarosa ve kıyasla daha büyük olduğunu, ve daha az belirgin bir sınır sağladı. Viral titreleri bindirmeleri tüm karşılaştırılabilir performans ile Panel B karşılaştırıldı.
Yeniden Üretim belirlemek için daha büyük bir örnek büyüklüğü ile MP12 için bindirme arasında net bir görsel bir karşılaştırma elde etmek içinnün, bir 6 yuvalı plaka da aynı şekilde üçlü (Şekil 2) trialed edildi. 6 yuvalı plaka biçiminde, CMC bindirmenin birbirinin boyut olarak karşılaştırılabilir agaroz ya da sıvı, şablon, 'den daha küçük plaklar gösterdi. Viral titreleri her üç bindirmeleri (Panel D) arasında benzer iken, agaroz ve sıvı bindirmeleri oluşan plaklar nedeniyle artan boyutu saymak daha kolay olmuştur.
Belirgin değişmiştir (Şekil 3A), farklı şablonlar arasında RVFV, VEEV titreleri ve Plak aksine. Plak boyutu ve hassasiyet (Panel B) pahasına, 12 de plaka biçimi kullanarak CMC bindirmeleri oluşan plaklar, açık ve net morfolojisi gösterdi. CMC aksine, agaroz ve sıvı şablonlar kullanımı VEEV çoğaltma daha düşük viral önleme ve artan duyarlılık gösteren, önemli ölçüde daha büyük bir plaklar elde edildi. Sadece ap CMC'nin karşı agarozun karşılaştırırken Bu önceden doğrulandıaper Juarez ve ark. 4 tarafından yayınlandı. Agaroz ve sıvı bindirmeleri CMC daha büyük plaklar üretirken, plaklar kötü sınırları tanımlanmış ve büyük sınır yaygınlaşmasını sağlayan sıvı bindirmeleri ile, bir 12 iyi biçimde saymak zordu vardı. Plakalar 6 yuvalı plakalar (Şekil 4) 'de trialed edildiğinde, büyük 6 göz formatındaki açısından CMC bindirmelere üstün kanıtlayan agaroz ile, 12 gözlü bir formatta ayırt etmek zor açıkça birikimdir ve sıvı bindirmeleri konusunu etkisiz plak tanımı ve hassas (Şekil 4D).
Karşılaştırma RVFV ya da harici bir proteaz gereği olarak, plaquing zaman VEEV, grip birkaç benzersiz zorluklarla sağlar. Agaroz markalar farklı olarak küçük değişiklikler olması varken önemli değişiklikler belirtildiği gibi farklı bindirme seçimleri için grip virüsünün duyarlılığı da iyi geçmişte belgelenmiştirtr 9 kullanılır.
İlginç İnfluenza B Tayvan suşu için bir kaplama olarak CMC'nin kullanımı saymak zor ve (Şekil 5A) güvenilir puanı zor kanıtladı belirgin küçük plaklar sonuçlandı. Bir agaroz kaplamanın kullanılması iyi plaklar (Panel C) sağlanır ve (artan tek tabakalı canlılığı olasılığı nedeniyle) daha koyu bir arka plan leke sonuçlandı ve sıvı bindirme kullanımı (Panel B doğrudan karşılaştırıldığında daha net ve keskin plaklar gösterdi ).
Böyle agaroz ve CMC gibi katı ve yarı katı bindirmeleri üzerinde sıvı polimerler, bir avantajı, kaldırma ve uygulama kolaylığı yatıyor. Yarı Katı bindirmeleri ısıtma gerektiren, ve taşıma ve kaldırma sırasında katılaşma problemli olabilir. Bu avantajlardan yararlanmak ve RVFV için yüksek verimli bir şekilde Avicel kullanan pratiklik belirlemek için, 96 kuyucuklu plak format değişik katlamalı konsantrasyon derecesinden en trialed edildions (Şekil 6). RVFV MP-12 için, seyreltme Avicel hem de 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlarda dört kat olarak gerçekleştirilmiştir. Bini ve kaldırma tekrarlanabilirlik yüksek derecede gösteren, kopya arasından veya belirtilen konsantrasyonları arasında belirgin farklar, basit olduğu kanıtlanmamıştır. Puanlama yaparken, plaklar RVFV için yüksek verimli bir şekilde sıvı bindirmeleri kullanan fizibilitesini gösteren, çıplak gözle belirgin ve sayılabilir idi.
Şekil 1:. 12 gözenekli plakalar kullanılarak RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plakalanmış ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Enfeksiyon% 0.3 agaroz 1.5 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC (son c sonraPanel A. plaklardaki gösterdi sayıldı ve Panel B'de titre gibi oncentrations) doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı.
Şekil 2:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması RVFV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak plakalanır ve MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak 400 ul ile enfekte edilmiştir. Paneller AC için tarif edildiği gibi Panel A'da gösterildiği gibi% 0.3 agaroz üç mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı, B ve C Ayrı deneyler ile aynı şekilde gerçekleştirilmiştir plakalar sayılmıştır ve Panel D'ye (n = 3) olarak titre.
Şekil 3: <12 gözenekli plakalar kullanılarak strong> VEEV plak katlamalı karşılaştırmaları. Veros 12 yuvalı plakalar içinde, 2.5 x 10 5 hücre plaka haline getirilmiş ve VEEV, TC-83 aşı soyunun aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak 200 ul ile enfekte edilmiştir. Panel A. plaklardaki gösterildiği gibi virüsle enfekte edildikten sonra% 0.3 agaroz 1.5 mi, şablon,% 0.6 Avicel®, ya da% 1 CMC, Pand B'de sayıldı ve titre edildi doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandı
Şekil 4:. 6 kuyucuklu levhaların kullanılması V EEV leke kalıbı karşılaştırmalar Veros 6 yuvalı plakalar içinde 5 x 10 5 hücre olarak kaplandı ve 400 ul VEEV TC-83 ile aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak ile enfekte edilmiştir. Gösterildiği gibi enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 mi bindirmeleri,% 0.6 Avicel®, ya da bir% 1 CMC doğrudan bindirmeleri karşılaştırma amacıyla uygulandıC sayılır ve Panel D titre plaklarla göre, (N = 3) - Panel A için tarif edildiği gibi paneller A, B ve C, ayrı deneyler aynı yapılmıştır.
Şekil 5: İnfluenza plak katlamalı karşılaştırmalar MDCK hücreleri, 6 oyuklu plakalar içerisinde 5 x 10 5 hücre plakalanmış ve Influenza Tayvan aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak aşı 400 ul ile enfekte edilmiştir.. FBS, viral füzyon için gerekli olan belirli proteazlann inhibisyonu yoluyla grip yayılmasını inhibe gibi fetal sığır serumu (FBS), büyüme ortamı veya üst kullanılmıştır. TPCK-tripsin konakçı hücrelerde viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için uygulamadan önce bindirmeleri tümüne eklenmiştir. Enfeksiyondan sonra,% 0.3 agaroz 3 ml bindirmeleri,% 0.6 Avicel, ya da% 1 CMC doğrudan karşılaştırmak amacıyla uygulananCı, Panel D sayıldı ve titre plaklarla (n = 3) - Panel A tarif edildiği gibi Panel A, B ve C ile ayrı deneylerde gösterildiği gibi kaplamalar aynı yapılmıştır. Ortalama bir CMC plaklar için alınan iken diffüz sınırları ve çok küçük plak boyutları gösterdiği gibi onlar güvenilir saymak zor oldu.
Şekil 6:. Yüksek üretim leke düzenleri Veros bir 96 yuvalı plaka dörtlü olarak, 1 saat boyunca RVFV MP12 aynı seri olarak seyreltilmiş başlangıç numunesi kullanılarak aşı 50 ul ile enfekte edilmiştir, oyuk başına 3 x 10 4 hücre kaplama. Bindirmeleri için Avicel 0.6 ve% 1.2 son konsantrasyonlara eklenmiştir bir yüksek verimli bir şekilde, paneller A ve B sıvı bindirmeleri kullanılmasının fizibilitesi ve tekrarlanabilirliğini belirlemek amacıyla trialed edilmiştir.
| RVFV | VEEV | Influenza B | |
| Hücre tipi | Vero | Vero | MDCK |
| Enfeksiyon dönemi | 1 saat | 1 saat | 45 dakika |
| İnkübasyon süresi | 3 gün | 2 gün | 3 gün |
Tablo 1: Plak Testi Aşılama Koşulları ve Hücre Tipleri
| RVFV | VEEV | Influenza B | |
| Hücre Tipi | Vero | Vero | MDCK |
| Büyüme Tipi | DMEM 1 | DMEM 1 | DMEM 2 |
| Plak Medya | 2xEMEM A | 2xEMEM A | 2xEMEM B |
1. Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal bovin serumu,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / streptomisin ile takviye edilmiştir.
2. Dulbecco Modifiye Eagle ortamı,% 1 L-glutamin,% 1 Penicllin / Streptomisin,% 0.2 öküz serum albumini,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran 50 ug / ml ile takviye edilmiştir.
% 5 FBS (25 mi),% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi),% 1 sodyum piruvat (5 mi),% 1 L-glutamin (5 ml) ile takviye edilmiş A 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi), % 2 / Strep (10 mi).
% 0.2 öküz serum albumini,% 1 Minimum Esansiyel amino asitler (5 mi), 50 ug / ml,% 0.025 HEPES, DEAE-Dekstran, Tripsin-TPCK ile takviye edilmiş B 2x Minimal Esansiyel Ortam (500 mi) *
* Hazırlık hemen önce, 25 başına 1 ul eklemekalikotuna 2 ug TPCK-tripsin / ml stok ml Eğer plaklar için agaroz ile karıştırmak için kullanıyor olacak.
Tablo 2: Plak ve Viral / Hücresel Büyüme Medias
| RVFV | VEEV | Influenza B | |
| Hücre tipi | Vero | Vero | MDCK |
| Enfeksiyon dönemi | 1 saat | 1 saat | 45 dakika |
| İnkübasyon süresi | 3 gün | 2 gün | 3 gün |
Çok uzun kısırlık muhafaza olarak yapıldığı zaman Yerleşimi çözümler dolacak değil.
Tablo 3: Kaplamalar Stok
| 6 yuvalı | 12 gözlü | 96 gözlü | |
| Hücreler içinde / oyuk | 5 x 10 5 | 2.5 x 10 5 | 3 x 10 4 |
| Inokulum hacmi (ul) | 400 | 200 | 50 |
| paylaşımının hacmi (ml) | 3 | 1.5 | 0.100 |
Tablo 4: Plaka Biçimleri
Discussion
Koşulları önemli ölçüde değişebilir gibi başarılı bir plak tahlili için en kritik faktör söz belirli viral kültür için protokol optimizasyon yatıyor. Dikkate almak temel noktalar şunlardır: açıkça plaklar farklılaştırmak için söz konusu virüs, uygun viral büyüme koşulları, yeterli seyreltme aralıkları ile hücresel uyumluluk ev sahipliği, ve söz konusu hücreler ve virüs için doğru bindirme seçimi ve boyama.
VEEV ve RVFV hem aynı konak hücre tiplerinin çok kullanan çok benzer koşullar altında büyürken, plak morfolojisi ve büyüme kinetiği farklılıklar büyük ölçüde değişmektedir. Geleneksel hemorajik ateş virüsleri ve alfavirüsler bir yayılım ve endikatör hücre hattı olarak kullanılmıştır Plak analizi için, Vero hücreleri kullanıldığında, tipik haliyle VEEV RVFV daha yüksek titrelere kadar büyür ve 48 HPI 4 de büyük düzgün plaklar, geliştirme, çoğaltma kinetik artış ortaya koyduğunu, 10-12. VEEV aksine, RVFV 72 HPI gerektirir ve tipik olarak boyut olarak daha küçük ve değişken olan plaklar gösterir.
RVFV karşı ve VEEV olarak, influenza virüsü yüksek konakçı hücre spesifiktir ve doku kültürü yoluyla yaymak için zor olabilir. Grip virüsü için viral giriş ve füzyon normal olarak ev sahibi hücrenin α-sialik asit yüzey reseptörüne bağlanma yoluyla hedef hücreye girişini aracılık viral glikoprotein hamagglutinin (HA) ile hücre yüzey reseptörünün bağlanması ile başlatılır. HA tüm influenza virüsleri membran zarfı içinde mevcut olan ve spesifik bir konakçı hücre proteazı ile alt birimi HA1 ve HA2 bölünme gerektirir trimerik glikoproteinidir. Ayrıca sorunu karmaşık hale getirmektedir, bu bölünme siteleri genellikle viral suşlar 13 arasında değişebilir. Belirli bir doku ile sınırlı olduğunu HA bölebilen proteazların ekspresyonu gibi, ar proteazlarE, genellikle, seçilen konakçı hücrede 13 viral füzyonu ve girişi kolaylaştırmak için, hücre kültür ortamına ilave edildi. Viral HA 14,15 proteolitik aktivasyonu ile (herhangi bir tripsin inaktive serum yokluğunda) çoklu-döngü replikasyonu kolaylaştıran: deneme için TPCK-tripsin MDCK ve Vero hücreleri hem de hücre kültüründe kullanıldığı yaygın olarak kullanılan bir proteazın bir örnektir.
Bu çalışma ve diğerlerinin de gösterildiği gibi, virüs yaşam döngüsünün farklılıklar farklı sınıfları ve virüsleri türler arasında büyük farklılıklar göstermek üzere katlamalı seçimleri, levha biçimleri ve toplama süreleri etkileyebilir. Bizim çalışmamızda, agaroz kaplamaları virüs ve hücre tiplerinin geniş bir yelpazede arasında yararını takviye edici, CMC ya da RVFV ve grip B virüsü, hem sıvı, şablon ya da daha yüksek titrelerde açık plaklar gösterdi. Büyük ölçüde katı fişleri ve basitleştirilmiş lekelenmeye giderilmesinde destekli agaroz düşük bir nihai konsantrasyon kullanma. CMC Genel p gösterdiİnfluenza B virüsü için her üç test virüsler ve üretilen çok küçük ve belirsiz plaklar için bir kaplama olarak oorest etkinlik. Genel CMC, en az arzu edilen özellikleri göstermesine rağmen, hızla büyüyen ve titresi sadece minimal bir azalma ile plak boyutunu azaltmak için görünür olduğu gibi son derece öldürücü virüsler, avantajlı olabilecek kullanımı. Sıvı kaplama bunun kullanım kolaylığı artan hazırlamak son derece basit olduğunu en çok yönlü olduğunu kanıtladı, ve seçilen virüslerin tamamında agarosa karşılaştırılabilir. Daha yüksek geçirimli bir 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde, uygulama ve çıkarmaya geleneksel bindirmeleri ile olduğu gibi, katılaşma nedeniyle engellenmiştir, doğru ve tutarlı sonuçlar verilmemiştir. Plakalar daha önce karakterize çoğaltma kinetik olan virüslere bu uyarlamayı sınırlayıcı, toplama noktasına kadar hareket olamaz gibi sıvı bindirmeleri kullanan bir göz opak renk ve plak oluşumunu izlemek için yetersizlik yatıyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
