Abstract
تبقى المقايسات البلاك إحدى الطرق الأكثر دقة لتقدير المباشر لvirons المعدية والمواد المضادة للفيروسات من خلال عد لويحات منفصلة (الوحدات المعدية والمناطق الميتة الخلوية) في زراعة الخلايا. نحن هنا لشرح كيفية إجراء فحص اللوحة الأساسية، وكيفية تراكب وأساليب متباينة يمكن أن تؤثر على تكوين البلاك والإنتاج. عادة ركائز صلبة أو نصف صلبة تراكب، مثل الاغاروز أو كاربوكسيميثيل السليلوز، وقد استخدمت لتقييد انتشار الفيروس ومنع العدوى من خلال العشوائي وسط النمو السائل. تراكب يجمد تقيد العدوى الخلوي لأحادي الطبقة المحيطة بها فورا، والسماح للتشكيل بؤر معدود منفصل وتشكيل لوحة لاحق. للتغلب على الصعوبات الكامنة في استخدام تراكب التقليدية، تراكب السائل رواية باستخدام السليلوز الجريزوفولفين والسليلوز carboxymethyl الصوديوم قد استخدمت على نحو متزايد كبديل في مستوىفحص اللوحة. السائلة المقايسات لوحة تراكب يمكن أن يؤديها بسهولة في أي معيار 6 أو 12 صيغ لوحة كذلك في الأساليب التقليدية، ويتطلب أي معدات خاصة. نظرا إلى حالته السائلة وسهولة اللاحقة من تطبيق وإزالتها، يمكن بدلا من ذلك أن تستخدم صيغ لوحة ثقافة صغرى كبديل الإنتاجية سريع ودقيق ورفيع إلى المعايرة الفيروسية نطاق أوسع. استخدام السائل اللزج ساخنة البوليمر عدم توفر الفرصة لتبسيط العمل، وتحافظ على الكواشف، الفضاء الحاضنة، وزيادة السلامة التشغيلية عند استخدامها في مختبرات الاحتواء التقليدية أو عالية كما لا التدفئة كاشف أو الأواني الزجاجية مطلوبة. تراكب السائلة قد تكون أيضا أكثر حساسية من تراكب التقليدية للحرارة بعض الفيروسات عطوب.
Introduction
وقد تم عزل دقيقة والكمي للعينات فيروسية قابلة للحياة على الدوام هدفا البحوث الجارية في علم الفيروسات. لم يكن حتى مجيء فحص اللوحة في عام 1952 أن وسيلة للكميا ونوعيا حساب التتر الفيروسية الحيوانية وقد تم تطوير أول 1،2. وقد تم تكييف هذه التقنية لأول مرة وتعديلها من المقايسات فج، والتي سبق استخدامها لحساب التتر من البكتيريا الأسهم في بيولوجيا النبات 1،2. في حين أن وسائل بديلة للالكمي الفيروسي ومنذ ذلك الحين تم تطويرها وتكييفها، مثل المناعية، ومضان المجهر الإلكتروني انتقال، الانضباطي استشعار مقاوم النبض (الحزب الراديكالي عبر الوطني)، التدفق الخلوي، وأنظمة مراسل المؤتلف، والعكس الكمي سلسلة البوليميراز رد فعل النسخ (QRT-PCR) ، تفشل هذه الأساليب لتحديد وquantitate تكرار virons المختصة 1،3. بينما تستمر التقدم في التكنولوجيات والتقنيات لتحسين وتغيير المناظر الطبيعية؛ plaquتستمر المقايسات البريد لتمثيل معيار الذهب في تحديد تركيزات الفيروسية المعدية للvirons التحللي 1،4.
خلال فحص اللوحة، مصاب أحادي الطبقة متموجة من الخلايا المضيفة مع فيروس التحللي من تركيز معروف الذي تم تخفيفه بشكل متسلسل لمجموعة معدود، وعادة ما بين 5-100 virions. ثم يتم تغطية الطبقات الوحيدة المصابة مع وسيلة تراكب مستوقف لمنع العدوى من الانتشار الفيروسي بشكل عشوائي إما من خلال تدفق الميكانيكية أو التضاريسية للوسط السائل خلال انتشار الفيروس. في حين تراكب صلبة أو نصف صلبة مثل الاغاروز، السليلوز الميثيل أو كاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) وقد جرت العادة على استخدامها، أصبحت تراكب السائل بديلا جذابا بشكل متزايد مع تطور تراكب سائل جديدة مثل Avicel 5- 7. المقايسات البلاك باستخدام السائل مقابل تراكب التقليدية تتمتع بالعديد من المزايا مثل تراكب يمكن أن يكون تطبيق ورقةالعبوات الناسفة في درجة حرارة الغرفة، وتطبيق وإزالة أسهل بكثير. كما تراكب السائلة لا تحتاج الاحترار، قد الفيروسات عطوب الحرارة حساسة ويثبت أيضا أسهل لوحة.
بعد الإصابة الأولية وتطبيق تراكب مستوقف، لويحات الفردية، أو مناطق من موت الخلايا، سوف تبدأ في تطوير مقيدة عدوى فيروسية كما والتكرار إلى أحادي الطبقة المحيطة بها. سوف تستمر الخلايا المصابة دورة النسخ المتماثل تحلل العدوى، مما يضخم العدوى، مما أدى لويحات متزايد متميزة ومنفصلة. اعتمادا على حركية النمو والخلايا الفيروسية المضيف المستخدمة، وتشكل لوحة مرئية عادة في غضون 2-14 أيام. يمكن بعد ذلك عد الطبقات الوحيدة الخلوية مع المجهر حقل مشرق القياسية، أو أكثر عادة ثابتة و counterstained بواسطة محايدة أحمر أو الكريستال العنيف من أجل تحديد بسهولة لويحات بالعين المجردة. هناك طائفة واسعة من البقع مكافحة البلاك المتاحة، كل تقدم والعشرينمجلة إكزكتف إنتلجنس ريفيو مزايا وعيوب محددة. وعادة ما يضاف الكريستال البنفسجي عند نقطة جمع وبعد تثبيت / إزالة تراكب، وتوفير وصمة عار المضادة السريعة والمتميزة التي تسمح بتحديد لويحات صغيرة جدا عندما التشكل المختلط الحالي. محايد الأحمر في الاستفادة من التطبيق المبكر واتصال دائم مع تراكب، والسماح للرصد المباشر لوضع تشكيل اللوحة، والتي هي مفيدة بشكل خاص عند التعامل مع الفيروس أو النسخ غير معروفة حركية. ومع ذلك فقد وجدنا أن تلطيخ عادة لا متميز كما عند استخدام أحمر محايد. 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) نتروبلو بروميد -2،5-ثنائي الفينيل (الإنتقالي العسكري) ويقدم العديد من المزايا، مثل البقع الصفراء الصبغة الملونة خلايا يمكن الاعتماد ويحات زرقاء داكنة والفيروسية دون إزالة التراكب مثلما يعيش مع أحمر محايد. التباين الكبير بين الخلايا الحية والميتة التي يوفرها الإنتقالي العسكري أيضا يسمح للكشف عن لويحات صغيرة في وقت سابق إصابة آخر نقطة، على الرغم من أن التخزين لا تزال تتطلب إزالة تراكب 8. كما وضوح الشمس فوق البنفسجية يمكن أن يتم ببساطة في محلول من الماء والكحول، ويوفر درجة عالية من الحساسية لوحة التشكل مختلطة، اخترنا أنها مضادة المفضلة ومبسطة وصمة عار لبروتوكول تظاهر لأننا باستخدام عدة عائلات جيدا ومن أهم خصائص فيروسات.
بعد تحديد وتلطيخ أحادي الطبقة الخلوية المصابة، يتم عدها لويحات من أجل عيار العينات الفيروسية الأسهم من حيث تشكيل وحدات لوحة (PFU) في الملليمتر الواحد. وتجدر الإشارة إلى انخفاض سجل بين التخفيفات التسلسلية و، اعتمادا على حجم لوحة، بين 5-100 لويحات عدها، مع سيطرة سلبية استخدامها كمرجع. وتختلف عينات إحصائية بنسبة 10٪ لكل 100 ويحات تحسب عند مقارنة عينة يعيد 3. ميزة استخدام المقايسات لوحة لتحديد التتر الفيروسية تكمن في قدرتها ل quantitate العدد الفعلي من الجسيمات الفيروسية المعدية ثithin العينة. كما virions متعددة يحتمل أن تصيب خلية واحدة، يتم استخدام المصطلحات الوحدات مقابل virons خلال المعايرة البلاك 1،2.
مورفولوجيا الترسبات يمكن أن تختلف بشكل كبير في ظل اختلاف ظروف النمو وبين الأنواع الفيروسية. وتجدر الإشارة إلى حجم كل لوحة، الوضوح، تعريف الحدود، والتوزيع لأنها يمكن أن توفر معلومات قيمة عن النمو وعوامل الفوعة للفيروس في السؤال.
ويمكن أيضا المبادئ الأساسية فحص اللوحة تكييفها وتعديلها في عدد من الطرق المختلفة، مثل استخدام التركيز تشكيل المقايسات (FFAs). FFAs لا تعتمد على تحلل الخلايا وcounterstaining للكشف عن تشكيل لوحة، وإنما توظف تقنيات للكشف عن البروتينات الفيروسية داخل الخلايا مباشرة من خلال الأجسام المضادة المناعية ذات الكلمات الدلالية. زيادة الحساسية، وانخفضت مرة الحضانة بعد الإصابة، والأهم من ذلك القدرة ل quantitate الفيروسات غير التحللي كلها متميزةمزايا عندما توظف FFAs. في حين تستخدم على نطاق واسع، فإن العوامل التي تحد حاسمة في FFAs مقابل فحص اللوحة التقليدية تكمن في الحاجة إلى الأجسام المضادة المناسبة والقدرة على تحقيق الوحيد للمفارز البروتين الفيروسية المعدية الفعلية مقابل virons 4.
لغرض هذه الدراسة، فإننا سوف تحد من مناقشتنا لفحوصات وحة الكلاسيكية ووصف استخدام أغطية صلبة ونصف صلبة التقليدية (الاغاروز وCMC)، جنبا إلى جنب مع رواية الجريزوفولفين السائل تراكب السليلوز.
Protocol
1. إعداد الخلايا والكواشف
- في اليوم قبل الفحص، لوحة الخلايا المضيفة المناسبة للفيروس في السؤال (الجدول 1 و 2) بنسبة 90 - 100٪ confluency.
- تحضير محلول التثبيت الفورمالين 10٪ في DH 2 O. في المثال، مزيج 5.56 مل من 36٪ مع الأسهم الفورمالديهايد 14.44 مل المقطر H 2 O (DH 2 O).
ملاحظة: استخدام ممارسات التعامل الآمن المناسبة والتهوية عند استخدام الفورمالدهايد. - إعداد الكريستال البنفسجي وصمة عار: 1٪ كريستال فيوليت (CV) في 20٪ من الإيثانول ودرهم 2 O.
- إعداد وسائل الاعلام وحة 2X (نوع من الخلايا تعتمد على تركيز 2X؛ انظر الجدول 2). تصفية باستخدام فلتر 0.2 ميكرون إن وجدت الكواشف ليست عقيمة.
- إعداد تراكب شل حركة (الجدول 3)
- لتراكب السائلة، وجعل العقيمة حل 2.4٪ من Avicel في DH 2 O. لمنع تراكمها، إضافة إلى مسحوق قارورة تحتوي على الماء والعشرينفي الاختلاط بسرعة مع شريط ضجة، صب في Avicel ببطء ويقلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT). عندما يثبت الحل لزج جدا بالنسبة بقضيب إلى التجانس، والتحول إلى شاكر قارورة ل> 30 دقيقة مع الإثارة الثقيل لضمان حتى التجانس.
ويمكن إجراء الحلول المالية بتركيزات أقل، ولكن الحلول يمكن أن تنفصل، وسوف تحتاج إلى ريمكس لضمان التجانس: ملاحظة. حلول العمل من Avicel يمكن استخدامها تتراوح 0،6-3٪. - بعد التجانس، الأوتوكلاف الحل وتخزين مختومة في RT.
- للالاغاروز وكاربوكسيميثيل السليلوز (CMC) تراكب، وإعداد محلول المخزون في DH 2 O 2٪ CMC أو 0.6٪ الاغاروز. خلط مع بقضيب والأوتوكلاف أو الميكروويف لجلب إلى حل.
- لتراكب السائلة، وجعل العقيمة حل 2.4٪ من Avicel في DH 2 O. لمنع تراكمها، إضافة إلى مسحوق قارورة تحتوي على الماء والعشرينفي الاختلاط بسرعة مع شريط ضجة، صب في Avicel ببطء ويقلب بسرعة في درجة حرارة الغرفة (RT). عندما يثبت الحل لزج جدا بالنسبة بقضيب إلى التجانس، والتحول إلى شاكر قارورة ل> 30 دقيقة مع الإثارة الثقيل لضمان حتى التجانس.
2. التخفيفات والعدوى
- بعد يوم من الطلاء، والتحقق بصريا confluency وقابلية الخلايا قبل بدء الفحص. ضمان قياسي الخلوي التشكل والثانية و~ 90٪ متموجة أحادي الطبقة موجودة.
- إجراء التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف من العينات المعدية. استخدام وسائط النمو الخلوي لانتشار فيروسي مثل مخفف (الجدول 2). تختلف عدد التخفيفات المطلوبة على أساس عيار المتوقع للفيروس المذكور، ودائما استخدام العينة الضابطة غير المصابة بشكل مستقل لضمان استمرارية الخلوية والمساعدة في تحديد هوية اللوحة.
- من التخفيفات التسلسلية، تصيب الخلايا لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة (الجدول 1). استخدام كمية كافية من اللقاح لتغطية الخلايا، مع الحفاظ على وحدة التخزين عند أدنى مستوى ممكن لتحقيق أقصى قدر من الاتصال الفيروسي مع أحادي الطبقة (الجدول 4). لوحات الروك بلطف كل 20 دقيقة حتى لضمان التغطية ومنع أحادي الطبقة الخلوية من التجفيف.
- بعد الإصابة، تراكب حجم مناسب من شل حركة المتوسطة مباشرة إلى اللقاح في البئر (الجدول 2) باستخدام 1: 1 مزيج من وسائل الاعلام وحة 2X وimmobilizتراكب الاختيار جي (CMC، الاغاروز أو Avicel). صخرة بلطف لمزج.
- لتراكب السائلة، خلط 1: 1 مع درجة حرارة سائل الإعلام وحة 2X و1،2-2،4٪ الأسهم RT Avicel للحصول على حل العاملة من 0.6-1.2٪ Avicel تراكب المتوسطة.
- لتراكب الاغاروز، واستخدام 1: 1 خليط من وسائل الاعلام وحة 2X تحسنت وحل الأسهم ساخنة من 0.6٪ الاغاروز، مكان في 56 ° C حمام الماء لمدة 30 دقيقة لكي تتوازن درجة الحرارة الحصول النهائي تركيز الاغاروز / تراكب 0.3 ٪.
- لCMC، إعداد محلول المخزون 2٪ وعلاج كما هو موضح في تراكب الاغاروز.
- عند تطبيق تراكب لأحادي الطبقة، تتوازن دائما الاغاروز ساخنة أو CMC في 56 ° C المياه لمنع الأضرار التي لحقت أحادي الطبقة. ضمان الحل هو دافئ، ولكن ليس الساخن لمسة لمنع موت الخلايا وتقليل التتر الفيروسية. وسوف تبدأ معظم تراكب الاغاروز لترسيخ دون 42 درجة مئوية، ويعمل بسرعة و / أو إعداد دفعات صغيرة لمنع تصلب أثناء التعامل.
- بعد إضافة تراكب، واحتضان لوحات لانتاج اللوحات المتميزة التي هي بوضوح معدودة. تشكيل لوحة يمكن أن يستغرق 2-14 أيام تبعا للفيروس التي يجري تحليلها، الجدول 1.
ملاحظة: عندما يتم وضع لوحات مضافين السائلة في الحاضنة، لا تتحرك لهم. وحركة تراكب السائلة خلال فترة الحضانة يؤدي إلى ويحات طخت. الاغاروز وتراكب CMC هي نصف صلبة ويمكن نقلها أو فحص دوري تحت المجهر الضوئي لمراقبة وضع اللوحة.
3. إصلاح الخلايا وتلطيخ
- لإصلاح الخلايا، صب قبالة أو نضح تراكب Avicel، وإصلاح الخلايا باستخدام محلول الفورمالديهايد بنسبة 10٪ لمدة 30 دقيقة ليلة وضحاها (<1 مل لكل بئر لمدة 6 لوحة جيدا).
- لالاغاروز أو CMC، إضافة محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى تراكب لمدة 1 ساعة ليلة وضحاها.
ملاحظة: يمكن أن تظل عينات لفترات طويلة من الزمن في تثبيتي، بشرط أن تفعللا تتبخر وتجف وهذا يمكن أن تشوه أحادي الطبقة.
- لالاغاروز أو CMC، إضافة محلول الفورمالديهايد مباشرة إلى تراكب لمدة 1 ساعة ليلة وضحاها.
- قبل تلطيخ وبعد التثبيت، تجاهل الفورمالديهايد وإزالة شمعات نصف صلبة للالاغاروز وCMC مع أي مياه جارية أو يدويا مع ملعقة. شطف ويحات Avicel بالماء لإزالة بقايا تراكب / تثبيتي قبل تلطيخ.
- لتلطيخ، وتغطي الخلايا مع الحد الأدنى من الكريستال البنفسجي حل ل~ 15 دقيقة. لوحات صخرية إذا لزم الأمر لضمان حتى التغطية.
- غسل بلطف وصمة عار الكريستال البنفسجي بالماء. مرة واحدة ثابتة، والملون، وتجفيفها وتخزينها لويحات إلى أجل غير مسمى لتحليل المستقبل.
4. تحديد التتر الفيروسية
- عد لويحات في كل بئر، مع متوسط مكررات أي تقنية من نفس التخفيف. لتنسيقات لوحة كبيرة والآبار خصم مع أقل من 5 أو أكثر من 100 لوحات. يحيط علما حجم اللوحة والتشكل. يجب أن يكون الشاهد السلبي أحادي الطبقة موحدة ويمكن استخدامه كجهاز تحكم المرجعية.
- تحديد عيار الفيروسية من العينة الأسهم عن طريق أخذ متوسط عدد لويحات لتخفيف ومعكوس عامل التخفيف الكلي.
ملاحظة: وعلى سبيل المثال، 30 و 32 لويحات أحصت لمكررات من 1 × 10 -7 التخفيف [31 (المتوسط) / 10 -7 (التخفيف) × 0.4 مل (اللقاح)] أن تسفر عن عيار 7.75 × 10 8 PFU / مل.
Representative Results
قدرة المقايسات البلاك إجراء تقييم دقيق التتر الفيروسية تعتمد على العديد من العوامل: اختيار الخلية المضيفة مناسبة، وسائل الإعلام المناسبة وظروف النمو للبقاء الخلوية والفيروسية، انتشار فيروسي يجمد، وتحديد دقيق للفترة حضانة الفيروس لإتاحة الوقت الكافي للمتميزين وتشكيل لوحة معدود.
لهذه الدراسة، تم اختيار ثلاث عائلات من الفيروسات التمثيلية لإظهار الاختلافات في: اختيار تراكب، وفترات الحضانة، والتشكل عبر البلاك اختلاف أنواع العينة. وقد تم اختيار الفنزويلي التهاب الدماغ الخيلي (VEEV) كنموذج الفيروسي (+) ssRNA، الذي يمكن أن يسبب مرض كبير في أنواع الخيول والبشر ويمثل عائلة الفيروسات الطخائية. الإنفلونزا ب تايوان سلالة، وهي مجزأة (-) فيروس ssRNA إصابة البشر في المقام الأول، يمثل عائلة فيروسات مخاطية قويمة. فيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)، وهي (-) المفصلية ssRNA ولد فيروس يصيب في المقام الأول المفصليات،الحيوانات المجترة والبشر اختير، بصفته ممثلا لعائلة الفيروسات البنياوية.
لRVFV (الشكل 1)، تم تحديد التتر من محلول المخزون من سلالة الحي الموهن MP12 المؤتلف من RVFV في شكل 12 لوحة جيدا باستخدام CMC، الاغاروز، أو تراكب Avicel التي حضنت جنبا إلى جنب للعدوى بعد 72 ساعة (HPI). وهناك لوحة تمثيلية تظهر التخفيفات تتراوح بين 10 إلى 10 -4 -7 يمكن رؤيتها في لوحة A. اللوحات باستخدام CMC وأظهر تراكب الاغاروز ويحات صغيرة، واضحة، ومميزة مع الحدود دائرية واضحة المعالم. كانت لويحات مع تراكب السائل قليلا أكثر وفرة وأكبر بالمقارنة مع الاغاروز وويحات CMC، وفرت الحدود أقل متميز. وتمت مقارنة التتر الفيروسية في لوحة ب مع كل من تراكب أداء نسبيا.
من أجل الحصول على المقارنة البصرية أكثر وضوحا بين تراكب لMP12 جنبا إلى جنب مع أكبر حجم العينة لتحديد reproducibility، تم محاكمتهم لوحة 6 جيدا أيضا في ثلاث نسخ (الشكل 2). في شكل لوحة 6 جيدا، وأظهر استخدام تراكب CMC ويحات أصغر من أي تراكب الاغاروز أو السائلة، والتي كانت مماثلة في الحجم لبعضها البعض. في حين أن التتر الفيروسية مماثلة بين جميع تراكب ثلاثة (لوحة D)، لويحات تشكلت في تراكب الاغاروز والسائلة أثبتت أسهل على الاعتماد بسبب زيادة حجمها.
في تناقض مع RVFV، التتر VEEV ومورفولوجيا الترسبات بين تراكب مختلفة تفاوتت بشكل ملحوظ (الشكل 3A). وأظهرت اللوحات التي تشكلت في تراكب CMC مورفولوجيا واضح ومتميز عند استخدام شكل لوحة الآبار 12، على حساب حجم اللوحة وحساسية (لوحة باء). وعلى النقيض من CMC، أدى استخدام الاغاروز والسائلة تراكب في لويحات أكبر بكثير، مشيرا إلى انخفاض تثبيط الفيروس وزيادة الحساسية للVEEV النسخ المتماثل. وقد تأكد هذا في السابق عند مقارنة فقط الاغاروز مقابل CMC في APأبر نشرتها خواريز وآخرون. 4. بينما أنتجت الاغاروز والسائلة تراكب ويحات أكبر من CMC، كان لويحات تعريف سيئة الحدود وكان من الصعب الاعتماد في شكل جيد 12، مع تراكب السائلة توفير أكبر انتشار الحدود. عندما تم محاكمتهم لويحات في 6 لوحات جيدا (الشكل 4)، نفي أكبر شكل جيد 6 القضية لويحات كبيرة بشكل علني التي كان من الصعب التفريق في شكل 12 أيضا، مع الاغاروز وتراكب السائلة تثبت متفوقة على تراكب CMC من حيث تعريف البلاك وبحساسية (الشكل 4D).
بالمقارنة مع RVFV أو VEEV، يوفر أنفلونزا عدة تحديات فريدة من نوعها عندما plaquing، مثل شرط وجود الأنزيم البروتيني الخارجي. حساسية فيروس الأنفلونزا لاختلاف الاختيارات تراكب كما تم توثيقه جيدا في الماضي وقد لوحظت تغييرات كبيرة عندما تعديلات طفيفة مثل الماركات المختلفة من الاغاروز لها أن تكونأون تستخدم 9.
ومن المثير للاهتمام للسلالة الأنفلونزا ب تايوان، أدى استخدام CMC كما تراكب في لويحات صغيرة بشكل ملحوظ التي كان من الصعب الاعتماد وثبت صعوبة ليسجل موثوق (الشكل 5A). وفر استخدام تراكب الاغاروز أفضل لويحات (لوحة C)، ونتج عن ذلك وصمة عار قتامة الخلفية (بسبب الأرجح إلى زيادة قابلية أحادي الطبقة)، وأظهرت اللوحات أكثر وضوحا وأكثر وضوحا في مقارنة مباشرة لاستخدام تراكب السائل (لوحة ب ).
وهناك ميزة واضحة من البوليمرات السائلة على مدى تراكب صلبة ونصف صلبة، مثل الاغاروز وCMC، يكمن في سهولة إزالة والتطبيق. تراكب شبه الصلبة تتطلب التدفئة، والتصلب يمكن أن يثبت عند التعامل مع إشكالية وإزالة. من أجل الاستفادة من هذه المزايا وتحديد العملية لاستخدام Avicel بطريقة عالية الإنتاجية للRVFV، تم محاكمتهم شكل لوحة الآبار 96 في متفاوتة concentrati تراكبإضافات (الشكل 6). لRVFV MP-12، وأجريت التخفيفات في quadruplicate في كلا 0.6 و 1.2٪ تركيزات النهائية Avicel. ثبت تطبيق تراكب وإزالة بسيط، مع عدم وجود اختلافات واضحة بين مكررات أو بين تجمعات لوحظ، مما يدل على درجة عالية من التكاثر. عندما التهديف، كانت لوحات متميزة والمعدودة للعين المجردة، مما يدل على جدوى استخدام تراكب السائل بطريقة إنتاجية عالية للRVFV.
الرقم 1: RVFV وحة مقارنات تراكب استخدام 12 لوحات جيدة تم مطلي Veros عند 2.5 × 10 5 خلايا في 12 لوحات جيدة والمصابين 200 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من MP12. بعد الإصابة 1.5 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC (ج النهائيةoncentrations)، تم تطبيقها من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A. اللوحات احصي وtitered في لوحة ب.
الشكل 2: RVFV وحة مقارنات تراكب باستخدام 6 لوحات جيدا تم مطلي Veros في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من MP12. تراكب ثلاثة مل من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A، أجريت B، و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح لوحات AC، مع ويحات أحصت وtitered في لوحة D (N = 3).
الرقم 3: <قوية> VEEV وحة مقارنات تراكب استخدام 12 لوحات جيدة. تم مطلي Veros عند 2.5 × 10 5 خلايا في 12 لوحات جيدة والمصابين 200 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من سلالة اللقاح VEEV TC-83. بعد الإصابة 1.5 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضح في لوحة A. اللوحات احصي وtitered في لوحة ب.
الرقم 4: V EEV مقارنات تراكب اللوحة باستخدام 6 لوحات جيدا تم مطلي Veros في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من VEEV TC-83. بعد الإصابة، 3 مل تراكب من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو CMC 1٪، طبقت من أجل مقارنة مباشرة تراكب كما هو موضحفي لوحات A، أجريت B و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح لوحات A - C، مع وعدها لويحات titered في لوحة D (N = 3).
الرقم 5: الأنفلونزا وحة مقارنات تراكب كانت مطلية خلايا MDCK في 5 × 10 5 خلايا في 6 لوحات جيدا ومصابة 400 ميكرولتر من اللقاح باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من الأنفلونزا ب تايوان. تم استخدام أي مصل بقري جنيني (FBS) في وسائل الإعلام أو تراكب النمو، كما FBS يمكن أن تمنع انتشار الأنفلونزا من خلال تثبيط بعض البروتياز التي مطلوبة من أجل الانصهار الفيروسي. تمت إضافة TPCK-التربسين لجميع تراكب قبل التطبيق من أجل تسهيل اندماج فيروسي والدخول مع الخلايا المضيفة. بعد الإصابة، تم تطبيق تراكب 3 مل من 0.3٪ الاغاروز، 0.6٪ Avicel، أو 1٪ CMC من أجل مقارنة مباشرةنفذت تراكب كما هو موضح في لوحة A، B و C. تجارب فصل مماثل كما هو موضح في لوحات A - C، مع وعدها لويحات titered في لوحة D (N = 3). بينما اتخذ في المتوسط لويحات CMC ثبت من الصعب الاعتماد بشكل موثوق لأنها أثبتت الحدود منتشر والأحجام وحة صغيرة جدا.
الرقم 6: تراكب اللوحة عالية الإنتاجية و96 لوحة جيدا من Veros مطلي في 3 × 10 4 خلايا لكل بئر، كانت مصابة 50 ميكرولتر من اللقاح باستخدام نفس العينة المخففة متسلسل بدءا من RVFV MP12 لمدة 1 ساعة، في quadruplicate. لتراكب، تم محاكمتهم 0.6 و 1.2٪ تركيزات النهائية Avicel من أجل تحديد الجدوى واستنساخ باستخدام تراكب السائلة بطريقة عالية الإنتاجية، لوحات A و B.
| RVFV | VEEV | الإنفلونزا ب | |
| نوع من الخلايا | فيرو | فيرو | MDCK |
| فترة العدوى | 1 ساعة | 1 ساعة | 45 دقيقة |
| فترة حضانة | 3 أيام | 2 أيام | 3 أيام |
الجدول 1: البلاك الفحص التلقيح شروط والخلية أنواع
| RVFV | VEEV | الإنفلونزا ب | |
| نوع من الخلايا | فيرو | فيرو | MDCK |
| نوع النمو | DMEM 1 | DMEM 1 | DMEM 2 |
| اللوحة الإعلام | 2xEMEM و | 2xEMEM و | 2xEMEM ب |
1. Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ Penicllin / الستربتوميسين.
2. Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة تستكمل مع 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ Penicllin / الستربتوميسين، 0.2٪ الأبقار مصل الزلال، 0.025٪ HEPES، DEAE-دكستران 50ug / مل.
A. 2X الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (500 مل) تستكمل مع 5٪ FBS (25 مل)، 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (5 مل)، و 1٪ البيروفات الصوديوم (5 مل)، 1٪ L-الجلوتامين (5 مل)، 2٪ القلم / بكتيريا (10 مل).
B. 2X الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية (500 مل) تستكمل مع 0.2٪ الأبقار مصل الزلال، 1٪ الحد الأدنى من الأحماض الأمينية الأساسية (5 مل)، 50ug / مل، 0.025٪ HEPES، DEAE-ديكستران، التربسين-TPCK *
* فقط قبل التحضير، إضافة 1 ميكرولتر لكل 25مل من 2 ميكروغرام / مل من الأسهم TPCK-التربسين إلى قسامة سوف تستخدم لخلط مع الاغاروز لويحات.
الجدول 2: اللوحة والفيروسية / الخليوي الأوساط النمو
| RVFV | VEEV | الإنفلونزا ب | |
| نوع من الخلايا | فيرو | فيرو | MDCK |
| فترة العدوى | 1 ساعة | 1 ساعة | 45 دقيقة |
| فترة حضانة | 3 أيام | 2 أيام | 3 أيام |
سوف حلول تراكب لا تنتهي عندما قام طالما يتم الحفاظ على العقم.
الجدول 3: تراكب المالية
| 6 جيدا | 12 جيدا | 96 جيدا | |
| # الخلايا / جيد | 5 × 10 5 | 2.5 × 10 5 | 3 × 10 4 |
| حجم innoculum (ميكرولتر) | 400 | 200 | 50 |
| حجم تراكب (مل) | 3 | 1.5 | 0.100 |
الجدول 4: تنسيقات بلايت
Discussion
العامل الأكثر أهمية لفحص اللوحة الناجح يكمن في تعظيم الاستفادة من بروتوكول للثقافة فيروسية معينة في السؤال عن الظروف يمكن أن تختلف بشكل كبير. النقاط الرئيسية لتأخذ في الاعتبار هي: استضافة التوافق الخلوي مع الفيروس في السؤال، وظروف النمو المناسبة الفيروسية، نطاقات تخفيف كافية من أجل التفريق بوضوح لويحات، واختيار تراكب الصحيحة وتلطيخ للخلايا وفيروس المعنية.
بينما VEEV وRVFV كلا تنمو في ظل ظروف مشابهة جدا استخدام العديد من نفس أنواع الخلايا المضيفة، والاختلافات في البلاك التشكل والنمو حركية تختلف بشكل كبير. عند استخدام خلايا فيرو لفحوصات لوحة، والتي جرت العادة على استخدامها كخط خلية نشر ومؤشر للحمى النزفية الفيروسات وalphaviruses، VEEV ينمو عادة إلى التتر أعلى من RVFV ويوضح زيادة حركية تكرار وتطوير لويحات كبيرة موحدة في 48 HPI 4، 10-12. وعلى النقيض من VEEV، يتطلب RVFV 72 HPI ويبين اللوحات التي عادة ما تكون أصغر بكثير في الحجم ومتغير.
في المعارضة لRVFV وVEEV، فيروس الانفلونزا هو غاية الخلية المضيفة محددة، ويمكن أن يكون من الصعب نشر من خلال زراعة الأنسجة. لفيروس الإنفلونزا، وبدأ دخول الفيروس والانصهار عادة عن طريق ربط مستقبلات سطح الخلية التي تحتوي على بروتين سكري hamagglutinin الفيروسية (HA)، التي تتوسط الدخول إلى الخلية المستهدفة من خلال الربط مع α اللعابي مستقبلات حمض سطح الخلية المضيفة. ها هو بروتين سكري مثلوثي التي هي موجودة في الغشاء المغلف للجميع فيروسات الأنفلونزا ويتطلب الانقسام في HA1 مفارز وHA2 من قبل البروتيني الخلية المضيفة محددة. لمزيد من تعقيد المسألة، يمكن لهذه المواقع انشقاق في كثير من الأحيان تختلف بين سلالات فيروسية 13. كتعبير عن البروتياز القادرة على الشق HA يقتصر على أنسجة معينة، البروتياز عه غالبا ما تضاف إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية من أجل تسهيل اندماج فيروسي ودخول الخلية المضيفة اختيار 13. TPCK-التربسين هو مثال واحد من البروتيني المستخدمة عادة يستخدم في زراعة الخلايا مع كل MDCK وخلايا فيرو: تسهيل النسخ المتعددة دورة (في غياب أي التربسين تعطيل المصل) من خلال تنشيط بروتين من فيروس HA 14،15.
كما هو موضح في هذه الدراسة وغيرها، يمكن أن الاختلافات في دورات الحياة الفيروسية تؤثر اختيارات تراكب، صيغ لوحة، وأوقات جمع، مع الفروق الكبيرة بين الطبقات المختلفة وأنواع من الفيروسات. في دراستنا، أظهرت تراكب الاغاروز ويحات أكثر وضوحا في التتر أعلى من أي CMC أو تراكب السائلة لكلا RVFV وفيروس الأنفلونزا B، يعزز فائدتها من بين مجموعة واسعة من الفيروسات وأنواع الخلايا. باستخدام تركيز النهائي انخفاض الاغاروز ساعد الى حد كبير في إزالة شمعات الصلبة وتلطيخ مبسط. أظهرت CMC عموما عoorest فعالية كإضافة لجميع الفيروسات الثلاثة اختبارها وإنتاجها لويحات صغيرة جدا وغير واضحة لفيروس الأنفلونزا (ب). على الرغم من أن مجمل CMC أثبت أقل الخصائص المرغوبة، واستخدامه في النمو السريع للغاية وفيروسات خبيثة قد تثبت فائدة، كما فعلت يبدو لتقليل حجم الترسبات مع وجود انخفاض في الحد الأدنى من عيار. أثبت تراكب السائل أن تكون أكثر تنوعا من حيث أنها كانت بسيطة للغاية لإعداد، وزيادة سهولة الاستخدام، وكان تعادل الاغاروز عبر كافة الفيروسات المحدد. في شكل لوحة إنتاجية أعلى 96 بئرا، وتطبيق وإزالتها لم يكن مستعمل بسبب التصلب كما هو الحال مع تراكب التقليدية، وتقدم نتائج دقيقة ومتسقة. وهناك اعتبار عند استخدام تراكب السائلة يكمن في التلوين مبهمة وعدم القدرة على مراقبة تشكيل لوحة لا يمكن أن يتم نقل الصفائح حتى نقطة جمع، مما يحد هذا التكيف للفيروسات مع حركية تكرار تتميز سابقا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
