Abstract
プラークアッセイは、細胞培養における離散プラーク（感染単位と携帯デッドゾーン）の計数を通じて感染ビリオンおよび抗ウイルス物質の直接的な定量化のための最も正確な方法の一つ残っている。ここでは、基本的なプラークアッセイを実行する方法を実証し、そして異なるオーバーレイや技術がプラーク形成および生産にどのような影響を与えるか。典型的には、例えば、アガロース、またはカルボキシメチルセルロースなどの固体または半固体オーバーレイ基板は、液体増殖培地を通して無差別感染の予防、ウイルスの拡散を制限するために使用されている。固定化されたオーバーレイは、離散可算病巣とその後のプラーク形成の形成を可能にする、すぐに周囲の単層にセルラー感染を制限する。従来のオーバーレイを使用することに固有の困難を克服するために、微結晶セルロース及びカルボキシメチルセルロースナトリウムを用いた新規な液体オーバーレイはますます標準で代替として使用されているプラークアッセイ。液体オーバーレイプラークアッセイは、容易に伝統的な技術に従って、標準的な6または12ウェルプレートフォーマットのどちらかで行われ、特別な機器を必要とすることはできません。 、その液体状態およびアプリケーションおよび除去のその後の容易さ、ミクロプレートフォーマットは、代替的に大規模なウイルスの滴定に、迅速、正確かつ高スループットの代替として利用することができる。非加熱粘性液体ポリマーの使用は、作業を合理化する機会を提供する試薬、インキュベータースペース、無試薬加熱やガラス製品などの伝統的な、または高封じ込めラボで使用される操作上の安全性が必要とされる増加を節約します。液体オーバーレイは、特定の熱不安定ウイルスの伝統的なオーバーレイよりも高感度を証明することができる。
Introduction
実行可能なウイルスサンプルの正確な分離および定量は、一貫してウイルス学における進行中の研究の目標であった。これは、定量的かつ定性的に動物ウイルス力価を計算するための手段は、第1 1,2を開発したことを1952年にプラークアッセイの出現までではなかった。この技術は、まず、以前に植物生物学1,2の株式バクテリオファージの力価を計算するために使用されたファージアッセイから適合および改変した。ウイルスの定量化のための別の手段は、例えば、イムノアッセイ、蛍光および透過型電子顕微鏡、調整可能な抵抗パルス検出（TRPS）として開発され、適応されているので、一方で、フローサイトメトリー、組換えレポーターシステム、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）これらの方法は、複製コンピテントウイルス粒子1,3を同定および定量することができない。技術および技法の進歩は、景観を洗練して変更していきながら、 plaquEアッセイは、感染溶菌ビリオン1,4のためのウイルスの濃度を決定する際に金本位制を表現し続けています。
プラークアッセイの間、宿主細胞のコンフルエントな単層を連続5-100ビリオンの間、典型的には、カウント可能な範囲まで希釈された未知の濃度の溶解性ウイルスに感染している。感染した単層は、その後無差別にウイルス増殖中に液体媒体の機械的または対流の流れのいずれかを介して広がるウイルス感染を防止するために、固定化重層培地で覆われている。アガロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース（CMC）などの固体または半固体オーバーレイは、伝統的に使用されてきたが、液体オーバーレイは、アビセル5~7新規な液体オーバーレイの発展にますます魅力的な代替となっている。オーバーレイすることができるように、従来のオーバーレイに対する液利用プラークアッセイは、APPLいくつかの利点を有する室温でIED、およびアプリケーションと除去が非常に容易である。液体オーバーレイが温暖化を必要としないように、繊細で熱に不安定なウイルスもプラークに簡単に証明することがあります。
固定化オーバーレイ、個々のプラーク、または細胞死のゾーンの最初の感染やアプリケーションの後、ウイルス感染および複製が周囲の単層に拘束されるように開発するために開始されます。感染した細胞はさらに、ますますはっきりと離散斑で、その結果、感染を伝播する、複製溶菌感染サイクルを継続していきます。使用されるウイルスの増殖動態および宿主細胞に応じて、目に見えるプラークは通常2-14日以内に形成される。細胞の単層を、容易に肉眼でプラークを同定するために、標準的な明視野顕微鏡を用いて計数すること、またはより典型的には、ニュートラルレッドまたは暴力的な結晶によって固定され、対比できる。利用可能なプラークカウンターステイン多種多様な各オファリング番目があるEIR特定の長所と短所。クリスタルバイオレットは、典型的には、混合形態が存在する場合に、非常に小さいプラークの同定を可能にする迅速かつ明確な対比染色を提供し、収集の時点で、オーバーレイの固定/除去後に添加される。ニュートラルレッドは、未知のウイルスまたは複製動態を操作するときに特に有用であるプラーク形成を発症するライブ監視を可能にする、早期適用オーバーレイと常に接触するという利点を有する。我々は、しかし、染色は一般的にニュートラルレッドを使用する場合と区別できないことを見出した。黄色の染料汚れが細胞濃い青とウイルスプラークとしてオーバーレイを除去せずにカウントすることができる生きているように、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）は、いくつかの利点を提供ニュートラルレッドで。 MTTによって与えられる生細胞と死細胞との間の高いコントラストも早い時点感染後の小さなプラークの検出を可能にする、ストレージは依然としてオーバーレイ8の除去を必要とするだろうが。クリスタルバイオレットは、単に水とアルコールの溶液中で行われ、混合プラーク形態のための高感度を提供することができるようなプロトコルは、我々は、ウェルのいくつかのファミリーを利用していることが実証のために、我々は、好適な単純化対比染色としてそれを選択したウイルスを特徴とする。
感染した細胞の単層を固定し、染色した後、プラークをミリリットル当たりのプラーク形成単位（pfu）の点でウイルスストック試料を滴定するためにカウントされる。ログ降下が基準として用い、陰性対照と、カウント5-100プラーク間で連続希釈して、プレートのサイズに応じて、間に留意すべきである。統計的にサンプルは、比較サンプルが3を複製する際にカウントごとに100のプラークを10％によって異なります。ウイルス力価を決定するために、プラークアッセイを使用することの利点は、wが感染性ウイルス粒子の実際の数を定量する能力であるサンプルをithin。複数のビリオンは、潜在的に単一の細胞に感染することができるように、ビリオンに対するユニットの用語は、プラーク滴定1,2の間に使用される。
プラーク形態は、異なる成長条件下およびウイルス種間で劇的に変化することができる。彼らは問題のウイルスの増殖と病原性因子に関する貴重な情報を提供することができますように、プラークサイズ、透明度、枠線の定義、および配布はすべて、注意すべきである。
基本的なプラークアッセイの原理は、適応され、フォーカス形成アッセイ（FFAは）の使用などの異なる多くの方法で修飾することができる。 FFAは、プラーク形成を検出するために細胞溶解および対比染色に頼るのではなく、直接的にタグ付けされた抗体を介して細胞内のウイルスタンパク質を検出するための技術を免疫染色を使用しない。感度を増加させ、感染後のインキュベーション時間を減少させ、そして最も重要な非溶解性ウイルスを定量する能力は、すべて異なっている利点のFFAを採用。広く使用されている一方で、伝統的なプラークアッセイに対するFFAの中で重要な制限要因は、適切な抗体の必要性と実際の感染ビリオン4対ウイルスタンパク質サブユニットのための唯一のプローブ能力にある。
本研究の目的のために、我々は古典的なプラークアッセイに議論を限定し、新規の液体の微結晶性セルロースオーバーレイと共に、伝統的な固体および半固体オーバーレイ（アガロースおよびCMC）の使用を記載している。
Protocol
細胞および試薬の調製
- 100％コンフルエント-前日に、当該ウイルスのアッセイプレートの適切な宿主細胞（ 表1および2）90である。
- のdH 2 O中10％ホルムアルデヒドの定着液を調製しこの例では、14.44ミリリットルの蒸留H 2 O（のdH 2 O）を用いて36％のストックホルムアルデヒド5.56 mlと混合する。
注：適切な安全な取り扱い慣行や換気ホルムアルデヒドを使用して。 - 20％エタノールとのdH 2 O中の1％クリスタルバイオレット（CV）：クリスタルバイオレット染色を準備
- 2回のプラーク培地（2×濃度の依存性細胞型を、 表2を参照）を準備。どんな試薬は無菌ではない場合、0.2μmのフィルターを用いてろ過する。
- 固定オーバーレイの調製（ 表3）
- 液体オーバーレイの場合は、のdH 2 O中アビセルの無菌の2.4％溶液を作成凝集を防止するために、目の水を含有するフラスコに粉末を加えるで急速にゆっくりアビセルを注ぎ、室温（RT）で急速に撹拌し、撹拌棒で混合される。液が撹拌棒が均質化するためには粘度が高すぎることを証明した場合であっても均質化を確実にするために重い攪拌しながら> 30分間フラスコシェーカーに切り替える。
注：ストック溶液は、低濃度で行うことができますが、ソリューションが分離してもよいし、均質化を確実にするためにリミックスする必要があります。アビセルの作業溶液は、0.6から3パーセントまでの範囲を使用することができる。 - 均質化した後、室温で密封し、溶液とストアオートクレーブ。
- アガロースおよびカルボキシメチルセルロース（CMC）オーバーレイは、のdH 2％CMC 0.6％アガロースのOストック溶液を調製。溶液中にもたらすための撹拌棒およびオートクレーブやマイクロ波で混ぜる。
- 液体オーバーレイの場合は、のdH 2 O中アビセルの無菌の2.4％溶液を作成凝集を防止するために、目の水を含有するフラスコに粉末を加えるで急速にゆっくりアビセルを注ぎ、室温（RT）で急速に撹拌し、撹拌棒で混合される。液が撹拌棒が均質化するためには粘度が高すぎることを証明した場合であっても均質化を確実にするために重い攪拌しながら> 30分間フラスコシェーカーに切り替える。
2.希釈液と感染症
- 当日は、めっき後に、視覚的にアッセイを開始する前に、細胞のコンフルエンシーおよび生存性をご確認ください。標準の細胞形態aを確保するND〜90％のコンフルエントな単層が存在する。
- 感染サンプルの倍段階希釈を行います。希釈剤（ 表2）のようなウイルス増殖のための細胞増殖培地を使用してください。問題のウイルスの予想力価に基づいて、必要な希釈液の数を変更し、常に独立してプラーク同定における細胞生存及び援助を確保するために、感染していない対照サンプルを使用しています。
- 連続希釈から、1時間（ 表1）に45分間、細胞を感染させる。単分子層（ 表4）を有するウイルスの接触を最大にするために、できるだけ少量を維持しながら、セルをカバーするために接種物の十分な量を使用する。穏やかに均一な被覆を確実にし、乾燥から細胞の単層を防止するために、プレートを20分毎に揺する。
- 2倍のプラークメディアの1ミックスimmobiliz：感染後、1を使用してウェル（ 表2）で接種に直接メディアを固定する適切な容量をオーバーレイ選択肢（CMC、アガロースまたはアビセル）のオーバーレイをる。穏やかに混合すること揺する。
- 0.6から1.2パーセントアビセルオーバーレイ媒体のワーキング溶液を得るために、2.4％のRTストックアビセル - 温め2Xプラークメディアおよび1.2で1：液体オーバーレイの場合は、1を混ぜる。
- 0.3の最終アガロース/オーバーレイ濃度を求める温度を平衡化し、30分間56℃の水浴中で加温し、2回プラーク培地の1：1混合物及び加熱された0.6％アガロースのストック溶液、場所：アガロースオーバーレイは、1を使用％。
- CMCについては、2％の原液を調製し、アガロースオーバーレイについて記載したように扱う。
- 単層にオーバーレイを適用する場合、必ずしも単層の損傷を防止するために56℃の水に熱いアガロースまたはCMCを平衡化する。ソリューションは暖かいが、細胞死と減少したウイルス力価を防ぐために、触って熱くないことを確認してください。ほとんどのアガロースオーバーレイは、42℃未満に固化し始める迅速に作業および/または処理中に凝固を防ぐための小さなバッチを準備します。
- オーバーレイを添加した後、明らかに可算である明瞭なプラークを生成するために、プレートをインキュベート。プラーク形成は、 表1を分析されているウイルスに応じて2-14日かかることができます。
注：液体オーバーレイプレートをインキュベーター内に配置されると、それらを移動しないでください。インキュベーション期間中、液体オーバーレイの移動は、塗抹斑を生じる。アガロース及びCMCオーバーレイは半固体であり、移動またはプラークの発達を監視するために光学顕微鏡下で定期的にチェックすることができる。
3.固定し、染色細胞
- 、細胞を固定アビセルオーバーレイを捨てるか、吸引、および一晩（6ウェルプレートのウェルあたり<1 ml）で30分間、10％ホルムアルデヒド溶液を用いて細胞を固定する。
- アガロースまたはCMCの場合は、直接、1時間から一晩のためにオーバーレイにホルムアルデヒド溶液を加える。
注：サンプルを固定液中に長時間保持することができるが、それが何提供これは単分子層を歪めることができますように蒸発して乾燥しない。
- アガロースまたはCMCの場合は、直接、1時間から一晩のためにオーバーレイにホルムアルデヒド溶液を加える。
- 染色および固定後、ホルムアルデヒドを破棄し、へらで流水または手動のいずれかで、アガロースおよびCMCのための半固体プラグを取り外しする前に。染色前に残留オーバーレイ/固定液を除去するために水でアビセルプラークをすすぐ。
- 染色のために、〜15分間、クリスタルバイオレット溶液の最小量で細胞を覆う。ロックプレートを必要に応じて、さらにカバレッジを確保する。
- 静かに水とクリスタルバイオレット染色を洗い流してください。一度、固定染色し、将来の分析のため無期限、店舗斑を乾燥させた。
4.ウイルス力価の決定
- 同じ希釈のいずれかの技術的反復の平均を取って、各ウェルのプラークを数える。 100プラークより少ないより5以上を持つ大規模なプレートフォーマットのため、割引井戸。プラークサイズおよび形態をメモしておいてください。ネガティブコントロールは、均一な単層を有するべきであり、基準対照として使用することができる。
- 希釈及び総希釈係数の逆数のためにプラークの平均数を取ることによって、株式サンプルのウイルス力価を決定します。
注：例として、1×10 -7希釈[31（平均）/ 10 -7（希釈）が0.4ミリリットル（接種材料）をX]の反復実験のために数え30および32プラークが7.75×10 8 PFUの力価をもたらすであろう/ mlである。
Representative Results
正確にウイルス力価を評価するためのプラークアッセイの能力は、多くの因子に依存する：細胞およびウイルスの生存に適切な宿主細胞の選択、適切な培地および増殖条件、固定化されたウイルスの伝播および別個のための十分な時間を可能にするウイルスの潜伏期間を正確に決定するそして可算プラーク形成。
サンプルタイプが異なる横切っオーバーレイ選択、インキュベーション期間、およびプラーク形態：この研究では、3つの代表的なファミリーからのウイルスは、違いを示すために選択した。ベネズエラウマ脳炎（VEEV）は馬の種およびヒトにおける重大な疾患を引き起こし、トガウイルスファミリーを表しことができ、（+）のssRNAウイルスのモデルとして選ばれました。インフルエンザB台湾株、セグメント化された（ - ）主に人間に感染するのssRNAウイルスは、オルトミクソウイルス科を表します。リフトバレー熱ウイルス（RVFV）、（ - ）主に節足動物に感染するのssRNA節足動物生まれウイルス、反芻動物と人間は、ブニヤウイルス科の代表として選ばれました。
RVFV（ 図1）のために、力価は、72時間後の感染のために並んでインキュベートしたCMC、アガロース、またはアビセルオーバーレイを利用して12ウェルプレートフォーマットにおけるRVFVの組換え生弱毒MP12株のストック溶液から決定した（HPI）。 10 -4から10 -7までの範囲の希釈物CMC及びアガロースオーバーレイを使用して、パネルA.プラークで見られる示す代表的なプレートを、明確に定義された円形の境界線と、小さな明確かつ明瞭なプラークを示した。液体オーバーレイプラークはもう少し豊富アガロースおよびCMCプラークに比べて大きかった、あまり明確な境界線を提供する。ウイルス力価は比較的実行オーバーレイの全てをパネルBに比較した。
reproducを決定するために、より大きなサンプルサイズと共にMP12のためのオーバーレイの中で明確に視覚的な比較を得るためにIBILITYは、6ウェルプレートも、三重（ 図2）でトライアルが行われました。 6ウェルプレート形式で、CMCオーバーレイの使用は、互いに大きさが同程度であったアガロースまたは液体のいずれかのオーバーレイよりも小さいプラークを示した。ウイルス力価は、3つのすべてのオーバーレイ（パネルD）との間で類似していたが、アガロースおよび液体オーバーレイに形成されたプラークは、それらのサイズの増加にカウントするように容易に証明した。
著しく変化した（ 図3A）が異なるオーバーレイの中RVFV、VEEV力価およびプラーク形態とは対照的である。プラークサイズおよび感度（パネルB）を犠牲にして、12ウェルプレートフォーマットを使用した場合CMCオーバーレイに形成されたプラークを明確かつ明瞭な形態を示した。 CMCとは対照的に、アガロースおよび液体オーバーレイの使用は、より低いウイルス阻害及びVEEV複製に対する感受性の増加を示し、有意に大きいプラークをもたらした。もっぱらapに、CMCに対するアガロースを比較した場合これは、以前に確認されたフアレスらによって公表APER。4。アガロースおよび液体オーバーレイがCMCよりも大きいプラークを生成しながら、プラークが不十分境界線を定義し、液体オーバーレイが最大の国境拡散を提供するとともに、12ウェルフォーマットでカウントすることは困難でしたていた。プラークを6ウェルプレート（ 図4）にトライアルが行われた場合には、より大きな6ウェルフォーマットの面でCMCオーバーレイに優れた証明アガロースで、12ウェルフォーマットで区別することが困難であった明白大きなプラークと液体オーバーレイの問題をネゲート敏感にプラーク定義と（ 図4D）。
プラーク形成時RVFVまたはVEEVと比較して、インフルエンザは、外部プロテアーゼの要件として、いくつかのユニークな課題を提供します。アガロースのブランドが異なると同じくらいマイナーな修正がなけれ持っているときに有意の変化が注目されているように、異なるオーバーレイ選択にインフルエンザウイルスの感度もよく、過去に報告されているenが9を使用していました。
興味深いことにインフルエンザB台湾株について、オーバーレイとして、CMCの使用はカウントが困難であったと（ 図5A）、確実に得点することが困難であることがわかっ著しく小さいプラークをもたらした。アガロースオーバーレイの使用は最善のプラーク（パネルC）を提供し、そして（おそらく増加により、単層の生存率への）暗い背景汚れが生じ、液体オーバーレイ（パネルBの使用を直接比較して鮮明でシャープなプラークを示した）。
例えば、アガロースおよびCMCなどの固体及び半固体オーバーレイオーバー液体ポリマーの明確な利点は、除去とアプリケーションの容易さにある。半固体オーバーレイは、加熱を必要とし、取り扱いおよび削除するときに凝固が問題に証明することができます。これらの利点を活用し、RVFVのためのハイスループット様式でアビセルを利用する実用性を決定するために、96ウェルプレートフォーマットは、様々なオーバーレイconcentratiでトライアルが行われたアドオン（ 図6）。 RVFV MP-12の場合、希釈は、アビセルの両方0.6と1.2％の最終濃度で4回行った。レプリケート間または濃度の間に明らかな違いは高い再現性を実証し、指摘しないとオーバーレイ適用および除去は、単純な証明した。得点すると、プラークがRVFVのための高スループットな方法で液体オーバーレイを利用の実現可能性を実証し、肉眼ではっきりと可算だった。
図1：RVFVプラークオーバーレイ比較は12ウェルプレートを利用 Verosを12ウェルプレート中に2.5×10 5細胞で播種し、MP12の同じ段階希釈した試料を用いて出発200μlで感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％のCMC（最終Cの1.5ミリリットルオーバーレイoncentrations）、パネルBで計数し、力価測定したパネルA.プラークに示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用した。
図2：6ウェルプレートを利用しRVFVプラークオーバーレイ比較は Verosは6ウェルプレート中に5×10 5細胞で播種し、MP12の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して400μlの感染させた。パネルACについて記載したようにパネルAに示されているように、0.3％アガロース3mlのオーバーレイ、0.6％アビセル、または1％CMCは、直接オーバーレイを比較するために適用された、BおよびC.個別の実験はして、同じように実施したプラークを計数し、パネルD（N = 3）で力価測定。
図3：<12ウェルプレートを用いて強い> VEEVプラークオーバーレイ比較。Verosは、12ウェルプレート中で2.5×10 5細胞で播種し、VEEV TC-83ワクチン株の同じ段階希釈し、出発試料を用いて200μlの感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC 1.5mlのオーバーレイ、パネルA.プラークに示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用されたパネルBにカウントし、力価測定した。
図4：V EEVプラークオーバーレイ比較は6ウェルプレートを利用 Verosは6ウェルプレート中に5×10 5細胞で播種し、VEEV TC-83の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して400μlの感染させた。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC、3mlのオーバーレイが示されているように、直接オーバーレイを比較するために適用されたプラークは、パネルDにおいて計数し、力価測定して、C（N = 3） - パネルAで、BおよびC.個別の実験は、パネルAについて記載した同一のように行った。
図5：インフルエンザプラークオーバーレイ比較 MDCK細胞を6ウェルプレートに5×10 5細胞で播種し、インフルエンザB台湾の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して接種物を400μlに感染させた。 FBSは、ウイルス融合に必要とされる特定のプロテアーゼの阻害を介してインフルエンザの伝播を阻害することができるようになし、ウシ胎児血清（FBS）は、増殖培地またはオーバーレイに使用しなかった。 TPCKトリプシンは、宿主細胞とウイルスの融合および侵入を容易にするために、適用前にオーバーレイのすべてに添加した。感染後、0.3％アガロース、0.6％アビセル、または1％CMC 3mlのオーバーレイを直接比較するために適用されたC、パネルDで計数し、力価測定プラークと（N = 3） - パネルAに記載のようにパネルA、BおよびC.独立した実験で実証されるようにオーバーレイが同一に実施した。平均値は、CMCプラークのために採取されたが、彼らは、拡散境界線と非常に小さいプラークサイズを実証したように、確実にカウントするために困難であることが判明。
図6：。ハイスループットプラークオーバーレイ Verosの96ウェルプレートは、ウェルあたり3×10 4細胞で播種、四重に、1時間RVFV MP12の同じ段階希釈し始めたサンプルを使用して接種物50μlの感染させた。オーバーレイについては、アビセル、0.6および1.2％の最終濃度は、ハイスループット様式、パネルAおよびB内の液体オーバーレイを利用することの実現可能性および再現性を決定するために、トライアルが行われた。。
| RVFV | VEEV | インフルエンザB | |
| 細胞型 | ベロ | ベロ | MDCK |
| 感染期間 | 1時間 | 1時間 | 45分 |
| インキュベーション時間 | 3日間 | 2日 | 3日間 |
表1：プラークアッセイ接種条件および細胞型
| RVFV | VEEV | インフルエンザB | |
| 細胞型 | ベロ | ベロ | MDCK |
| 成長型 | DMEM中1 | DMEM中1 | DMEM中2 |
| プラークメディア | 2xEMEM A | 2xEMEM A | 2xEMEM B |
1.ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、1％L-グルタミン、1％Penicllin /ストレプトマイシンを補充した。
2.ダルベッコ改変イーグル培地、1％L-グルタミン、1％Penicllin /ストレプトマイシン、0.2％ウシ血清アルブミン、0.025％HEPES、DEAEデキストラン50ugの/ mlを補充した。
5％FBS（25ml）に溶解し、1％の最小必須アミノ酸（5ml）中、1％ピルビン酸ナトリウム（5ml）を、1％のL-グルタミン（5 ml）を補充した2×A.最小必須培地（500ml）に、 2％ペニシリン/ストレプトマイシン（10ml）で。
0.2％ウシ血清アルブミンを補充した2×B.最小必須培地（500ml）を、1％の最小必須アミノ酸（5ml）に、50ugの/ mlの0.025％HEPES、DEAEデキストラン、トリプシンTPCK *
*準備の直前には、25あたり1μlを添加するあなたはプラークアガロースと混合するために使用する分量にTPCKトリプシンの2μg/ mlのストック溶液。
表2：プラークおよびウイルス/細胞増殖Medias
| RVFV | VEEV | インフルエンザB | |
| 細胞型 | ベロ | ベロ | MDCK |
| 感染期間 | 1時間 | 1時間 | 45分 |
| インキュベーション時間 | 3日間 | 2日 | 3日間 |
限り無菌性が維持されるように作ったとき、オーバーレイソリューションは期限切れになりません。
表3：オーバーレイ証券
| 6ウェル | 12ウェル | 96ウェル | |
| 細胞の＃/ウェル | 5×10 5 | 2.5×10 5 | 3×10 4 |
| 接種の容量（μL） | 400 | 200 | 50 |
| オーバーレイの容量（ml） | 3 | 1.5 | 0.100 |
表4：プレートフォーマット
Discussion
条件が著しく変化することができますように成功したプラークアッセイのための最も重要な要因は、問題の特定のウイルス培養のためのプロトコルの最適化にある。考慮すべき重要な点は次のとおりです、問題のウイルスによる細胞の互換性、適切なウイルス増殖条件、十分な希釈範囲を明確にプラークを区別するために、問題となっている細胞やウイルスに対する正しいオーバーレイの選択と染色をホストします。
VEEVとRVFVの両方が同一の宿主細胞型の多くを利用して非常に類似の条件下で成長するが、プラークの形態および成長動態の差が大きく変化する。従来、出血熱ウイルス及びアルファウイルスの伝播および指標細胞株として使用されてきたプラークアッセイのためのVero細胞を使用する場合、VEEVは、典型的には、RVFVよりも高い力価まで成長し、増加した複製動態を示し、48 hpiの4において大きな一様なプラークを開発10から12まで 。 VEEVとは対照的に、RVFV 72 HPIを必要とし、典型的にはサイズが非常に小さく、可変であるプラークを示す。
RVFV及びVEEVに対向して、インフルエンザウイルスは、高度に特異的な細胞をホストし、組織培養を介して伝播することは困難である。インフルエンザウイルスは、ウイルスの侵入及び融合は、通常、宿主細胞のα-シアル酸表面受容体との結合を介して標的細胞への侵入を媒介するウイルス糖タンパク質hamagglutinin（HA）と細胞表面受容体の結合によって開始される。 HAは、すべてのインフルエンザウイルスの膜エンベロープ内に存在し、特定の宿主細胞プロテアーゼによるサブユニットHA1及びHA2への切断を必要とする三量体糖タンパク質である。さらに問題を複雑にしているのは、これらの切断部位は、多くの場合、ウイルス株13の間で変化することができる。 HAを切断できるプロテアーゼの発現が、特定の組織に限定されるように、アルをプロテアーゼeは、多くの場合、選択された宿主細胞13に、ウイルス融合および侵入を容易にするために、細胞培養培地に加えた。ウイルスHA 14,15のタンパク質分解活性化を介して（任意トリプシン不活性化血清の非存在下で）マルチサイクルの複製を促進する：TPCKトリプシンをMDCKおよびVero細胞の両方で細胞培養に使用される一般的に使用されるプロテアーゼの一例である。
この研究等に示されるように、ウイルスのライフサイクルの違いは、ウイルスの異なるクラスおよび種間で有意な差異を、オーバーレイの選択、プレートフォーマット、および収集時間に影響を与えることができる。我々の研究では、アガロースオーバーレイは、ウイルスおよび細胞型の広い範囲の中でその有用性を強化し、CMCまたはRVFVおよびインフルエンザBウイルスの両方のための液体オーバーレイのいずれかよりも高い力価で、より明確なプラークを示した。大幅に固体プラグと簡素化染色を除去する際に支援アガロースの低い最終濃度を用いて。 CMCは、全体のPを実証したインフルエンザBウイルスのために非常に小さく、不明瞭なプラークをテストし、作成されたすべての3つのウイルスのためのオーバーレイとしてoorest効能。全体的なCMCは、少なくとも所望の特性を実証したが、それは力価の最小限の減少に伴ってプラークサイズを減らすために行ったように見える、急速に成長し、非常に毒性の強いウイルスでのその使用は、有利なことを証明できた。液体オーバーレイは、使いやすさを増加させ、製造するのが極めて簡単だったという点で、最も汎用性であることが証明され、そして選択されたウイルスのすべてにわたってアガロースと同等であった。より高いスループット、96ウェルプレート形式で、アプリケーションおよび除去は、従来のオーバーレイとしてによる凝固に阻害し、正確で一貫した結果が得られていなかった。プレートは以前に特徴付け複製動態を有するウイルスには、この適応を制限する、コレクションのポイントまで移動することができないような液体オーバーレイを使用した対価は不透明着色およびプラーク形成をモニターすることができないことにある。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
| 12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
| 96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
| 96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
| DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
| 2x EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 °C |
| MEM 100x | Cellgro | 25 025 Cl | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
| HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 °C for 30 min |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
| Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
| Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
| Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
| Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
| Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |
References
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
- Hartley, J. W., Rowe, W. P. Tissue culture cytopathic and plaque assays for mouse hepatitis viruses. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. Soc. Exp. Biol. Med. N. Y. 113, 403-406 (1963).
- Juarez, D., Long, K. C., Aguilar, P., Kochel, T. J., Halsey, E. S. Assessment of plaque assay methods for alphaviruses. J. Virol. Methods. 187, 185-189 (2013).
- Shurtleff, A., Keuhne, A., Biggins, J., Keeney, A. Use of alternative overlays in plaque assays. , USAMRIID. Fort Detrick, MD USA. (2011).
- Shurtleff, A. C., et al. Standardization of the Filovirus Plaque Assay for Use in Preclinical Studies. Viruses. 4, 3511-3530 (2012).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. -D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virol. J. 3, 63 (2006).
- Klebe, R. J., Harriss, J. V. A technically simple ‘non-lethal’ vital staining procedure for viral plaque and cell transformation assays. Arch. Virol. 81, 359-362 (1984).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells. Appl. Microbiol. 16, 588-594 (1968).
- Abiko, C., et al. Outbreak of Human Metapneumovirus Detected by Use of the Vero E6 Cell Line in Isolates Collected in Yamagata, Japan, in 2004 and 2005. J. Clin. Microbiol. 45, 1912-1919 (2004).
- Baer, A., et al. Induction of DNA damage signaling upon Rift Valley fever virus infection results in cell cycle arrest and increased viral replication. J. Biol. Chem. 287, 7399-7410 (2012).
- Austin, D., et al. p53 Activation following Rift Valley Fever Virus Infection Contributes to Cell Death and Viral Production. PLoS ONE. 7, (2012).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Stein, D. A., Klenk, H. -D., Garten, W. Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. J. Virol. 85, 1554-1562 (2011).
- Youil, R., et al. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines. J. Virol. Methods. 120, 23-31 (2004).
- Tobita, K., Sugiura, A., Enomoto, C., Furuyama, M. Plaque assay and primary isolation of influenza a viruses in an established line of canine kidney cells (MDCK) in the presence of trypsin. Med. Microbiol. Immunol. (Berl.). 162, 9-14 (1975).
