Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.
Plakanalyser fortsat en af de mest præcise metoder til direkte kvantificering af smitsomme vironer og antivirale stoffer gennem optællingen af diskrete plaques (infektiøse enheder og cellulære døde zoner) i cellekultur. Her demonstrerer vi, hvordan du udfører en grundlæggende plaque assay, samt hvordan forskellige overlays og teknikker kan påvirke plak dannelse og produktion. Typisk faste eller halvfaste overlay substrater, såsom agarose eller carboxymethylcellulose, er blevet anvendt til at begrænse viral spredning, forebyggelse vilkårlig infektion gennem det flydende vækstmedium. Immobiliserede overlays begrænse cellulær infektion til det umiddelbart omgivende monolag, tillade dannelsen af diskrete countable foci og efterfølgende plaquedannelse. For at overvinde de vanskeligheder, der er forbundet med brug af traditionelle overlejringer, har en ny flydende overlay udnytte mikrokrystallinsk cellulose og natriumcarboxymethylcellulose i stigende grad blevet anvendt som en erstatning i standardplaque assay. Flydende overlay plaque assays let kan udføres i enten standard 6 eller 12 brønde pladeformater pr traditionelle teknikker og kræver ikke særligt udstyr. På grund af dets flydende tilstand og efterfølgende let påføring og fjernelse kan mikrokultur pladeformater alternativt anvendes som en hurtig, præcis og high throughput alternativ til større skala virale titreringer. Anvendelse af en ikke-opvarmet tyktflydende væske polymer giver mulighed for at strømline arbejdet, sparer reagenser, inkubator plads, og øger driftssikkerheden, når de anvendes i traditionelle eller høje inddæmning labs som ingen reagens opvarmning eller glasvarer er nødvendige. Flydende overlejringer kan også vise sig mere følsomme end traditionelle overlays for visse varmefølsomme vira.
Den nøjagtige isolation og kvantificering af levedygtige virale prøver har konsekvent været en igangværende forskning mål i virologi. Det var ikke før fremkomsten af plaqueanalyse i 1952, at et middel til både kvantitativt og kvalitativt beregne dyr virustitere blev først udviklet 1,2. Denne teknik blev først tilpasset og modificeret fra fag-assays, som tidligere var blevet anvendt til at beregne titre af lager bakteriofager i plantebiologi 1,2. Mens alternative midler til viral kvantificering siden er blevet udviklet og tilpasset, såsom immunoassays, fluorescens og transmissionselektronmikroskopi, afstemmelige resistive puls sensing (TRP), flowcytometri, rekombinante reportersystemer, og kvantitativ revers transkription-polymerase-kædereaktion (QRT-PCR) disse metoder mislykkes at identificere og kvantificere replikationskompetente vironer 1,3. Mens fremskridt i teknologier og teknikker fortsætter med at forfine og ændre landskabet; plaque assays udgør fortsat guldstandarden i fastlæggelsen virale koncentrationer for smitsomme lytiske vironer 1,4.
Under en plaque assay et konfluent monolag af værtsceller inficeret med en lytisk virus af en ukendt koncentration, der er seriefortyndet på en tælleligt interval, typisk mellem 5-100 virioner. Inficerede monolag dækkes derefter med en immobiliserende daeksubstratet at forhindre virusinfektion fra flæng spredes gennem enten mekaniske eller convectional strømning af det flydende medium under viral propagering. Mens faste eller halvfaste overlays såsom agarose, methylcellulose eller carboxymethylcellulose (CMC) traditionelt har været anvendt, har flydende overlays blevet et stadig mere attraktivt alternativ med udvikling af nye flydende overlays såsom Avicel 5- 7. Plakanalyser anvender flydende versus traditionelle overlays har flere fordele som overlejring kan være applIED ved stuetemperatur, og anvendelse og fjernelse er betydeligt lettere. Som likvide overlays ikke kræver opvarmning, kan sarte og varmefølsomme virus også være enklere at plak.
Efter den første infektion og anvendelsen af immobiliserende overlay, individuelle plaques, eller zoner af celledød, vil begynde at udvikle sig som viral infektion og replikation er begrænset til det omgivende monolag. Inficerede celler vil fortsætte replikation-lysis-infektion cyklus, yderligere at smitten breder sig, hvilket resulterer i stadig mere adskilte og diskrete plaques. Afhængigt af den virale vækst kinetik og anvendte værtscelle, vil en synlig plak normalt dannes inden 2-14 dage. Cellulære monolag kan derefter tælles med en standard lysfelt mikroskop, eller mere typisk fast og modfarvet med neutral rød eller krystal voldelig med henblik på let identificere plaques med det blotte øje. Der er en bred vifte af plak counter pletter, som hver især tilbyder thEIR særlige fordele og ulemper. Crystal violet tilsættes typisk ved punktet for indsamling og efter fiksering / fjernelse af overlay, hvilket giver en hurtig og tydelig counter plet, som muliggør identifikation af meget små plaques når blandet morfologi er til stede. Neutral rød har den fordel, tidlig anvendelse og konstant kontakt med overlay, der giver mulighed for direkte overvågning af udviklingen af plaque dannelse, hvilket er særligt nyttigt, når der arbejdes med en ukendt virus eller replikation kinetik. Vi har dog fundet, at farvningen er typisk ikke så tydelig, når du bruger neutral rød. 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) giver adskillige fordele, da det gule farvestof pletter levende celler mørkeblå og virale plaques kan tælles uden fjernelse af overlay som med neutral rød. Høj kontrast mellem levende og døde celler, der ligger i MTT tillader også påvisning af små plaques på et tidligere tidspunkt efter infektion, Skønt opbevaring stadig ville kræve fjernelse af overlay 8. Som krystalviolet blot kan foretages i en opløsning af vand og alkohol, og tilvejebringer en høj grad af følsomhed for blandet plakmorfologi, har vi valgt det som en foretrukken og forenklet counter pletten for den protokol vist, vi udnytter flere familier af godt karakteriserede vira.
Efter fiksering og farvning af inficerede cellulære monolag er plaques tælles med henblik på at titrere virale stock prøver i form af plaque-dannende enheder (pfu) per milliliter. En log drop skal bemærkes mellem serielle fortyndinger, og afhængig af pladestørrelse mellem 5-100 plaques talt, med en negativ kontrol anvendes som reference. Statistisk prøver vil variere med 10% for hver 100 plaques tælles, når man sammenligner prøve replikater 3. Fordelen ved anvendelse af plaque-assays til at bestemme virustitere ligger i deres evne til at kvantificere det faktiske antal af infektiøse viruspartikler wnden for prøven. Som flere virioner potentielt kan inficere en enkelt celle, er terminologien enheder versus vironer anvendes under plak titreringer 1,2.
Plakmorfologi kan variere voldsomt under forskellige vækstbetingelser og mellem virale arter. Plaquestørrelse, klarhed, definition af grænserne og distribution bør alle være bemærkes, da de kan give værdifulde oplysninger om vækst- og virulensfaktorer af den pågældende virus.
Grundlæggende plaque assay principper kan også tilpasses og modificeres på en række forskellige måder, såsom ved anvendelse af fokusdannende assays (FFA'ere). FFAs ikke stole på cellelyse og kontrastfarvning at opdage plak dannelse, men snarere ansætte immunfarvning teknikker til direkte at detektere intracellulære virale proteiner via mærkede antistoffer. Øget følsomhed, nedsat inkubationstider efter infektion, og vigtigst evnen til at kvantificere ikke-lytiske virus er alle adskiltfordele, når ansætte FFAs. Mens udbredte, de kritiske begrænsende faktorer i FFA versus en traditionel plaque assay ligger i behovet for egnede antistoffer og evnen til kun at probe for virale proteinunderenheder versus faktiske infektiøse vironer 4.
Med henblik på denne undersøgelse vil vi begrænse vores diskussion til klassiske plakanalyser og beskrive brugen af traditionelle faste og halvfaste overlays (agarose og CMC), sammen med nye flydende mikrokrystallinsk cellulose overlejringer.
Den mest afgørende faktor for en vellykket plakassay ligger i optimering af protokollen for den særlige viral kultur pågældende som betingelser kan variere betydeligt. Vigtige punkter at tage i betragtning: vært cellulær forenelighed med den pågældende virus, passende virale vækstbetingelser, tilstrækkelig fortynding intervaller for klart at skelne plaques, og korrekt overlay udvælgelse og farvning for celler og virus pågældende.
Mens VEEV og RVFV både vokse under meget lignende betingelser anvender mange af de samme vært celletyper varierer forskelle i plakmorfologi og vækstkinetik betydeligt. Ved anvendelse af Vero-celler for plaque assays, som traditionelt er blevet anvendt som en formering og indikator cellelinie til hæmoragisk feber virus og alphavira, VEEV typisk vokser til højere titre end RVFV og demonstrerer øget replikation kinetik, udvikling af store ensartede plaques på 48 hpi 4, 10-12. I modsætning til VEEV, RVFV kræver 72 hpi og viser plaques, som typisk er meget mindre og variabel i størrelse.
I modsætning til RVFV og VEEV, influenzavirus er meget værtscelle specifik og kan være vanskeligt at udbrede sig gennem vævskultur. For influenza virus, viral indgang og fusion normalt indledt af binding af celleoverfladereceptor med det virale glycoprotein hamagglutinin (HA), der medierer optagelse i målcellen ved binding med værtscellens α-sialinsyre overflade receptor. HA er en trimer glycoprotein der er til stede i kuvert membranen af alle Influenzavirus og kræver spaltning i subunits HA1 og HA2 af en særlig værtscelle protease. For yderligere at komplicere sagen, kan disse spaltningssteder ofte varierer mellem virusstammer 13. Som udtryk for proteaser stand til at spalte HA er begrænset til specifikke væv, proteaser are ofte tilsat cellekulturmediet for at lette viral fusion og indgang i den valgte værtscelle 13. TPCK-trypsin er et eksempel på et almindeligt anvendt protease, der anvendes i cellekultur med både MDCK og Vero-celler: lette multi-cyklus-replikation (i mangel af trypsin inaktiverer serum) gennem den proteolytiske aktivering af viral HA 14,15.
Som påvist i denne undersøgelse, og andre, kan forskelle i virale livscyklus påvirke overlay markeringer, pladeformater og indsamling gange, med betydelige afvigelser mellem forskellige klasser og arter af virus. I vores undersøgelse, agarose overlays vist tydeligere plaques ved højere titre end enten CMC eller flydende overlays for både RVFV og Influenza B virus, styrke dens anvendelighed blandt en bred vifte af vira og celletyper. Ved hjælp af en lav endelig koncentration af agarose i høj grad hjulpet med at fjerne de faste stik og forenklet farvning. CMC generelt vist poorest effektivitet som et overlay for alle tre testede vira og produceres meget små og utydelige plaques for influenza B virus. Selv om den samlede CMC vist de mindst ønskelige egenskaber, dets anvendelse i hurtigt voksende og ekstremt virulente vira kan vise sig fordelagtig, da det synes at reducere plak størrelse med kun en minimal reduktion i titer. Den flydende overlay viste sig at være den mest alsidige, at det var meget let at fremstille, øget brugervenlighed og var sammenlignelig med agarose tværs af alle de udvalgte vira. I en højere throughput 96-brønds plade-format, påføring og fjernelse blev ikke hæmmet på grund af størkning, som med traditionelle overlays, og forudsat nøjagtige og konsekvente resultater. En overvejelse, når anvendelse af flydende overlæg ligger i den uigennemsigtige farve og manglende evne til at overvåge plakdannelse da pladerne ikke kan flyttes, før det punkt, indsamling, begrænse denne tilpasning til vira med tidligere karakteriserede replikation kinetik.
<pclass = "jove_content"> Mindre ændringer i plaqueanalyse forhold kan i væsentlig grad ændre resultater, og vurderingen og udførelsen af et nyt system eller teknik er altid berettiget. Mens en optimeret og standardiseret plakanalyse protokol ikke findes for enhver situation, vores rapport demonstrere den alsidighed og brugervenlighed i traditionelle såvel som nye flydende overlays til plakanalyser, men samtidig give en tilstrækkelig baggrund for yderligere brugerbehov modifikationer.The authors have nothing to disclose.
We would like to thank FMC BioPolymer USA for product samples of Avicel. This work was supported through the Defense Threat Reduction Agency grant HDTRA1-13-1-0005 to KK and the NIH research grant 1R15AI100001-01A1to KK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
6-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 658 160 | |
12-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 665 180 | |
96-well CellStar plate for tissue culture | Greiner Bio-One | 655 180 | |
96-2ml deep well plate | USA Scientific | C15046314 | For serial dilutions |
DMEM | Quality Biologicals | 112 013 101 | Cell Media/Diluent |
2X EMEM for plaques | Quality Biologicals | 115 073 101 | Warm to 37 oC |
MEM 100X | Cellgro | 25 025 Cl | |
Sodium Pyruvate | Cellgro | 25 000 Cl | |
Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140 122 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030 081 | |
HyClone FBS | Thermo Scientific | SH30910.03 | Heat inactivate before use at 62 oC for 30 min |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldritch | A7030-50G | |
Trypsin TPCK | Sigma Aldritch | T1426-50mg | Make aliquots/Avoid freeze thawing |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
DEAE-Dextran | Sigma Aldritch | D9885-10G | |
Crystal Violet | Sigma Aldritch | C3886-25G | |
Formaldehyde Solution | Sigma Aldritch | F8775-500ml | |
Ethanol denatured Reagent Grade | Sigma Aldritch | 362808-1L | |
Avicel RC-591 NF | FMC BioPolymer USA | RC-591 NF | Shake vigorously when reconsitiuting for >30 min to homogenize |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
Carboxymethyl cellulose, Sodium Salt Medium Viscosity | Sigma Aldrich | C4888 |