Introduction
人間の腸内ウイルスは、消化管内で複製し、糞口経路を通じて広がっている。これらのウイルスは、多くの場合、高濃度1-3に下水に記載されています。彼らは、下水の排水4,5に固執し、表面6,7、地面8-10で、かつ11水を飲んで治療することができます。存在する場合、米国の環境水中のウイルスの濃度は、典型的には直接測定12,13には低すぎる。これはウイルスが大量の水から濃縮されている必要があります。情報収集ルール（ICR）は、米国環境保護庁（USEPA）14が行ったモニタリング中に、感染単位の19.7最確数に全国の0.009の範囲であった大型のユーティリティのソース水中での陽性検体のウイルス濃度（MPN）/ L.陽性サンプルの中央値と平均濃度は、流れストリームからのソース水用0.01 0.03 0.17 MPN / Lであった湖沼や貯水池からのそれらのための0.07 MPN / L、及び地下11（2000年4月25日付けのICR AUX1 18月のAccessデータベースからデータ）を用いてそれらのための0.04から0.74 MPN / Lである。国の地下水のUSEPA研究から陽性サンプルのウイルス濃度は中央値0.13と0.29感染単位/ L 8の平均濃度で0.009から2.12感染単位/ Lの範囲であった。正の地下水試料中のウイルスの濃度は、流動流中のものよりも高かった。これらの研究における地下水を使用して施設の大半は、カルスト領域に位置する帯水層から水を得た。これらには、石灰石と結晶に所在する（破断岩盤）とともに設定が他の設定8,15,16よりも高いウイルス濃度を有する可能性がある。 USEPAウイルス法は、地表水の200 L 300 Lへ（ICR）（1615年法）と地下水17,18の千L 1500 Lへ（ICR）（1615年法）のサンプリングボリュームを指定。しかし、用いて大量の試料は、ほとんどの表面と地下水試料は、ウイルス8,11,19,20について陰性である。
地表水に存在するウイルスは、飲料水の消費者への潜在的な健康リスクをもたらす。表面水処理ルールは、少なくとも4対数によりウイルス濃度を減少させるために、表面の水を使用して、すべての処理プラントを必要とする。でも、4-logの減少で、0.0044 MPN / Lと小さい源水で感染性ウイルス濃度は、平均曝露と治療条件やロタウイルス11,21の用量応答パラメータを仮定して一日あたり1感染につながる可能性があります。未治療の地下水でウイルスからのリスクとは、治療及びウイルスの発生がないためにさらに大きくなる可能性があります。 Borchardtらは、成人における急性胃腸炎の22％および63％までの小児では5年未満が未処理地下水19を使用して、コミュニティで飲料水中のウイルスが原因である可能性がありと推定している。
USEPA Method 1615はBorchardtの調査結果や同僚19,23にフォローアップの国家として未規制汚染物モニタリング規制の第三の監視サイクル（UCMR3）22時のエンテロウイルスとノロウイルスを検出するために開発されました。 USEPA法は、主に、未処理の地下水を使用して、システム内のウイルスを測定するために設計されたが、他の水の行列タイプが含まれるように、より一般的に書かれた。新しい方法は19,23。ICR 17、Borchardt らの方法に基づいて、分子の手順の追加時に使用される前のウイルス法から多くの成分を保存するハイブリッドで、ノロウイルス24のための追加のプライマーセット。本稿の目的は、サンプリング手順及び収集と出荷中にサンプルの完全性を維持するために必要な手順を記述することである。方法全体の評価はCashdollar ら 25に記載されている。このプロトコルは、単純なフィールドをカバーコレクション5ポンプとプレフィルタが不要であり、調整はpHまたは水中の消毒の存在を必要としない場合の表面と接地水のnがサンプリングされる。より複雑なサンプリング要件はFoutがら、17,18に記載されている。
Protocol
1.予備手続き
- 補足資料に記載されているように、吸気モジュール、カートリッジハウジングモジュールと、放出モジュールからなる、図1に示すように、標準的なフィルター装置を組み立てる。
- 最初の使用の前にサンプリングに使用流量での流量計/積算を校正。最初の使用後にキャリブレーションをチェックし、その後、使用の1ヶ月後。流量校正がどちら最初の使用後、または使用の最初の月の後に変更された場合は補足資料に記載されているように、キャリブレーションチェックの頻度を決定する。
- 吸気モジュールに放電モジュールを接続し、タップに吸気モジュールを接続します。流量を読み取るための流量計/積算を設定する。完全にタップをオンにして、その後ブロンズグローブバルブを使用して、10リットル/分の流量を調整。流量は10L /分で安定したら、総体積を読み取るために流量計/積算をリセットする。
- 外を配置4 Lに放電モジュールのみましょうか、大きなメスシリンダーと同時にゼロに積算をリセットします。 4-Lマークにおける積算読み取り及びシリンダーに4 Lマークに到達するのに必要な時間を測定する。率を流れるように戻って設定流量計/積算を変更します。
注：流量が9.95以下にLに低下したか、ステップ1.2.2を完了した後に、複数10.05 Lまで増加した場合には、流量が安定しており、繰り返しステップ1.2.2になるまで待ちます。正しく調整メーターは4.0±0.04 Lの積算読書で24±1秒でメスシリンダーに4 Lマークに到達します - 積算読み取り値が3.96未満または以上4.04 Lである場合に、観察された差を調整するために必要な補正係数を算出する。流量計/積算がメスシリンダー上の4 Lの時点で3.9 Lを読み取る場合、補正係数は1.026（3.9÷4）である。フィールドサンプルの所望の体積が300 Lであった場合にこのように、ボリュームは、rに従って収集流量計/積算上のeadingはあるべき300÷1.026 = 292.4 L.
- 標準のフィルター装置を殺菌し、サンプル収集の準備をします。
- いずれかの完全に溶液中にモジュールを浸漬することにより、またはモジュールは、ポンプを使用しても次亜塩素酸ナトリウムを循環させることにより、各使用前に少なくとも30分間、0.525パーセントの次亜塩素酸ナトリウム摂取量とカートリッジハウジングモジュールを滅菌する。無菌のdH 2 Oでモジュールをすすぎ、次いで5分間滅菌試薬グレード水1リットル当たり1 Mチオ硫酸ナトリウムを50 mlを含む溶液中で脱塩素。装置モジュールが無菌アルミ箔で終わるフィルタのサンプリングをカバーする。
- カートリッジハウジングモジュール無菌的に電気陽性カートリッジフィルターを追加します。
注：カートリッジフィルターが正しくハウジングに装着されていることを確実にするために注意してください。正しく固定フィルタは漏れないと振とう時フィルタは、ハウジング内に移動しません。 APのガスケットroperly座っフィルタはどこにフィルタの連絡先にそれらを示して見えるくぼみを持つことになります。ガスケットは常にフィルターをハウジングから削除された直後にくぼみをチェックする必要があります。 - サンプルデータシート上のユニークなサンプル数を記録（例えば補足資料を参照）、次に取るか、またはサンプルに関し必要な指示と一緒に、フィルターサンプリング装置とフィールド試料を採取される個々のサンプルデータシートを出荷コレクション（ 例えば 、サンプル量、サンプル位置など ）。
サンプリングサイトで試料の収集2.準備
- コレクションサイトで到着時に手を洗うとサンプル汚染の可能性を最小限に抑えるために手術用手袋を着用。腸や呼吸器症状を経験した場合のサンプルを収集することはありません。頻繁に手袋を変更し、特に水タップと続き可能性のある他のアイテムに触れた後、アミノ化。
- サンプルデータシートに追跡情報を記録し、関連するサンプル。関連情報は、サイトやサンプル識別、サンプラーの名、および機器のモデルとシリアル番号が含まれています。
- 行に定住したすべての破片をクリアするために2〜3分間蛇口をオンにします。必要であれば、このステップの間に、ドレインに到達するために庭のホースまたは管を使用。
- サンプリング装置モジュールが接続されている場合は、それらを切断し、滅菌ホイルでカートリッジハウジングモジュールの開放端を保護する。吸気モジュールに放電モジュールを接続し、水道の蛇口の両方に接続します。放電モジュールの端に庭のホースを接続し、1Lのポリプロピレン製容器に自由端を置く。
- タップの電源をオンにし、装置を介してサンプリングされる水の少なくとも75のLを渡す。
- ポリプロピレン容器 - 塩素残油に流れ込む水の上にフラッシュ期間中の水質パラメータを測定し、記録するUAL、pH、温度、濁度。
- 水道の水を切った後は、吸気モジュールから放出モジュールを外してから、カートリッジハウジングモジュールの出口に吸気モジュールの出口と排出モジュールにカートリッジハウジングモジュールを接続する。ゼロに読んで積算をリセットします。
3.フィールドのサンプル採取
- 日時とともに初期積算読書を記録した後、ゆっくりと水栓を開きます。
- カートリッジハウジングが直立位置にあることを、それが完全に水で満たされていることを確認。いくつかのハウジングは、充填プロセス中にハウジングから空気を排出するために押すことができるベントボタンを持っている。
- 完全にタップを開きます。ブロンズグローブバルブを用いて10リットル/分の流量を調整した後、初期流量を記録する。
- 使用して装置を通って地下水の1800 Lの表面水または1500の300 Lを渡す積算測定値（調整後、必要に応じて）。必要なボリューム前フィルタの目詰まりに到達し、半分以上のボリュームが収集された場合には、利用可能な場合、残りのサンプルを収集するための第二フィルターハウジングモジュールを使用する。
- サンプル量がサンプリング期間の終わりに近づくにつれて流量を観察して、サンプルタップの水の流れをオフ。最終流量が、日付、時刻、最終積算読み取り、総サンプル体積を記録する。
- タップからフィルタサンプリング装置を外します。他のモジュールからのカートリッジハウジングモジュールを外します。
- 逆さフィルタハウジング（s）をオンにし、過剰な水の両方の入口および出口ポートから排出されますそれ以上の水まで流出することを可能にする。
- 直立ハウジングを回して、無菌アルミ箔で各端にクイックコネクトをカバーしています。一つ以上の密封可能なビニール袋にハウジングを置きます。
- 摂取量とdから水を抜くischargeモジュール。一つ以上の密封可能なビニール袋にモジュールを配置します。
フィールドサンプルの4出荷
- 絶縁された貯蔵および輸送クーラーにフィルタサンプリング装置モジュールを置きます。
- サンプルが輸送中に1-10℃の間に残ることを保証するために貯蔵及び輸送クーラーに凍結したアイスパックまたは二重袋詰め氷を追加します。二つの大きなまたは6-8小さな氷のパックは十分なはずです。
- アイスパックや氷の袋に接触することなく、場所に絶縁された貯蔵および輸送胸に、温度記録装置を配置します。
注：分析実験室ですぐに到着時にカートリッジハウジングと容器の開口部の温度を測定する視覚的な赤外線温度計を使用する場合は、温度記録装置はオプションである。 - 梱包材にボイドスペースを記入し、その後T ON、密封可能なビニール袋に入れて保護されたサンプルのデータシートを配置オペアンプ。それは水の漏れを防止するための絶縁貯蔵および輸送の胸やテープを閉じる。
- トランスポートまたは分析実験室にサンプルを出荷する。サンプルは、フィールドサンプル収集（ すなわち 、ステップ3.1で記録された時間）の開始後遅くとも24時間よりも分析実験室に到着しないことを確認してください。
Representative Results
フィルタの目詰まりが詰まり、フィルタを通る水の流量を減少させる方法1615で発生することができる主要な潜在的な問題である。場合によっては、これは、より大きな流れを可能にするグローブバルブを開くことによって克服することができる。必要な体積が通過した前に、他の例では、フィルタが完全に目詰まりします。 表1は、フィルタの種類、水の種類、及び濁度の関数として減少する容積を有するサンプルの割合を示す。詰まりが逆地表水試料の場合とながら地下水試料について、第四級アミンベースのフィルタを上回る酸化アルミニウムナノ繊維ベースのフィルタと、地下水及び表面の両方水試料で発生した。酸化アルミニウムナノ繊維ベースのフィルタに収集されたサンプルの10％が目詰まりするのに必要な最小限の指定されたボリュームを満たすことができなかった一方、全体的な、第四級アミンベースのフィルタを使用して収集されたサンプルの6％は、体積が欠損していた。属で詰まりlは、濁度を増加したが、異なる構成要素の数が濁度に寄与し、これらのいくつかは、目詰まりを生じない。例えば、ICRの試験中に発生するすべての詰まり事象の43％が（データは示していない）は、2つの河川系に限られていた。 ICRの間に地表水の最小ターゲット·ボリュームは研究中に収集された平均体積は208 L（2000年4月25日付けのICR AUX1 18月のAccessデータベースからのデータ）の中央値の体積とL 217±32だった200 L.だった。したがって、完全なボリュームは、高濁度と多くの水から採取することができる。
濁度が75 NTUを超えていたときICRは、プレフィルターを使用するためにサンプラーを必要としたが、さらにプレフィルターで、75以上の濁りと海域で採取したサンプルの34％がNTU詰まっ。方法1615は50 NTU以上の海域とのプレフィルターの使用をお勧めします。しかし、この方法1615の出版以来、方法に記載されていることに加えて、いくつかの異なるプレフィルタオプションはされているテストした。これらはいずれも、試料容量（データは示さず）において有意な改善をもたらしていない。
図1.標準的なフィルタ装置。標準フィルタ装置は、吸気、フィルターハウジング、及び排出モジュール（各モジュールの説明については、補足資料を参照）で構成されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| 総サンプル A | 欠損サンプル B の数 | パーセント欠損サンプル | 濁度（NTU） |
| NanoCeramを使用した地下水フィルタC | |||
| 113 | 1 | 1 | <20 |
| 地表水NanoCeramフィルターCを使用して | |||
| 83 | 12 | 14 | <20 D |
| 8 | 4 | 50 | 20 - <50 |
| 6 | 5 | 83 | ≥50 D |
| 総NanoCeram C | |||
| 210 | 22 | 10 | ≥0 |
| 1MDSフィルタc を用いて地下水 | |||
| 374 | 75 | 20 | <20 |
| 2693 | 27 | 1 E | <20 E |
| 505 | 36 | 7 F | 20 - <50 F |
| 122 | 19 | 16 E | 50 - <75 グラム |
| 175 | 60 | 34 E、F | ≥75 E、F、G |
| 総1MDS C | |||
| 3869 | 217 | 6 | ≥0 |
表1.フィルタの容量サンプルは、使用可能なボリュームと濁度データから以下の研究から、次のとおりです。1）USEPAのICRスタディ（4/2付けのICR AUX1 18月のAccessデータベースからのデータ2000分の5）、2）USEPA地下水調査8、3）USEPAローレンスとローウェル、マサチューセッツ州の研究（未発表データ）、4）USEPAミシシッピ川の研究（未発表データ）、5）USEPA飲用水処理プラントの研究（未発表データ）、 6）USEPAメソッド1615評価調査25、および7）は、各研究のために指定された水の最小容量の前に目詰まりしたフィルターが収集されたUCMR3監視の最初の3ヶ月（未発表データ）。Bサンプル。これは地表水と地下水のために1500 L、200 Lだったが、USEPA ICRとUSEPAの地下水研究のための1893 Lの下に地下たソース水200 Lであった。完全な最低限指定されたボリュームを収集する機能が有意に異なるされているCサンプルは、マン·ホイットニー順位和検定を使用してNanoCeramと1MDSフィルタ（P = 0.002）を使用し、地表水と地下水の両方全体的な（P <0.001）との間で、各フィルタタイプ（P <0.001）のために収集。D＆＃8211、同じ上付き値を持つGグループ（P <0.05）順位検定で分散のクラスカル·ワリスOneウェイ分析とダンのペアワイズ多重比較手順に従って著しく異なっている。全ての統計的検定のために、従属変数はなく、1.0の最大値、最小値、指定されたボリュームの割合としてフィルタを通過体積である。
Discussion
環境水からウイルスを濃縮するための異なるフィルタタイプは、年26にわたって使用されてきた。現在の方法は、限外濾過膜27、電気陰性フィルタ13,28,29、ガラスウールフィルター23、及び電気陽性フィルタ30を使用する。電気陰性フィルタは長年広く使用されたが、塩の添加前又はサンプリング中にフィールド内の水のpHを調整するための要件は、その有用性を制限する13。フィールドサンプリングのための最も実用的なフィルタの選択は電気陽性フィルターです。これらのフィルタは、高流量で、水の任意の調節なしに大量の水のサンプリングを可能にする。グラスウールフィルタは最も安価であるが、陽性のフィルタよりも遅い流速を有しており、市販されていない。限外濾過は、水質の広い範囲にわたって最高のウイルス回収率を提供するが、装置はsampliために必要ngは、容易に携帯用フィールドれず、サンプルを収集するのに必要な時間は、27ずっと長い。方法は、最近使用現場での調整の必要性を回避するために、電気陰性のフィルタを予め調整することを開発されてきたが、これらは大量の試料28,29を収集するため適用できないかもしれない。
EPAメソッド1615は、酸化アルミニウムナノ繊維または第四級アミンのいずれかからの正電荷を得る陽性カートリッジフィルターを使用する。後者は前者の上の利点は、安価で効率的に自然なpH値30,31の広い範囲の海域からウイルスを収集することである。しかし、各カートリッジのほか、Borchardtらによって使用されるグラスウールフィルターは水23,31,32（Cashdollar、未発表データ）からのエンテロウイルスとノロウイルスの類似の回復を与える。カートリッジフィルターは、サンプルの収集を簡単にするために設計された単純なサンプリング装置内に配置されるとサンプリング中に汚染を減少させる。
大規模研究が複数の分析ラボを使用して実施された場合の標準的な方法は非常に貴重である。 EPAメソッド1615はサンプル収集中または不十分な消毒装置の構成部品からの汚染に起因するこれらの研究 - 偽陽性の結果、およびコンポーネントによってフィルター孔の目詰まりの間に収集されたデータに影響を与えることができる2つの主要なサンプル収集の問題を最小限に抑えるために、標準的な手順とガイダンスを提供しています水がサンプリングされる。
腸内ウイルスが不十分な衛生状態に人から人への普及することができるのと同様に、ウイルスは、汚染された手袋33で不十分洗浄し、手や手からのサンプルに導入することができる。これは、サンプラーは、汚染の可能性のある経路を理解し、サンプリング中に無菌技術を使用することが不可欠である。サンプラーは、手袋は、主にページへの暴露からサンプラーを保護するために使用されていないことを理解すべきである汚染からの装置をrotect。サンプリングと介護の開始が汚染を手袋に手を防ぐために、手袋の着用時に注意が必要前には手を洗浄する必要があります。彼らは、高いレベルでのエンテロウイルスまたはノロウイルスを流してできたように胃腸炎や呼吸器症状とのサンプラーは、サンプルを収集してはならない。
第二に、注意が前回のサンプリングイベントからウイルスのキャリーオーバーを防ぐために注意する必要があります。汚染のこの潜在的な源を最小にするために、方法1615でのサンプリング装置は、入口とカートリッジハウジングモジュールとの間の圧力調整器及び圧力計を含まないことによってICRのものから変更された。イベントをサンプリング中に観察された圧力は常に最大の住宅評価（5インチカートリッジハウジング用など 、125 PSI）を下回っていたので、彼らは消毒が困難であったため、これらのコンポーネントは削除されました。後者の問題は、STで機器ブランク対照を使用することにより実証されたICR 6,20に続くudies。それはICRデータに影響を与えた程度は不明であるが、可能性が小さかった。つだけ偽陽性陰性の性能評価サンプルが研究中に存在した（データは示さず）。さらに、キャリーオーバー汚染の可能性を低減するために、それはまた、入口モジュールチューブが各サンプリング事象後に交換することが推奨される。これは、装置は、ウイルスを接種した品質または性能制御のために使用された場合、適切な消毒を確実にするために特に重要である。殺菌を実行する前に、遊離塩素の濃度は、貯蔵中の任意の損失を測定すべきである。上述の装置の構成の変化に加えて、定期的な装置のブランクは消毒が有効であることを実証するために実行されることが不可欠である。方法1615機器ブランクウイルスシードの制御に使用された後に消毒された装置を用いて行うことが義務付け、それによって簡素前消毒に装置を通ってウイルスシードソリューションをパスする必要がなくなるので、手続き。この濃度は、機器上の任意の実行可能なウイルスを不活性化し、核酸を分解することの両方を必要とされる消毒剤の濃度は、方法1615のための0.525パーセントの次亜塩素酸に増加した。そのため、機器のブランクは、細胞培養および定量PCRアッセイの両方を使用して分析する必要があります。
電気陽性のフィルタのどちらのタイプは、 表1に報告された研究の間に、目詰まりの対象となった。減少したボリュームの試料の未知の数はそのような積算の誤読または別のを満たすために、サンプリングの意図的な早期の停止として、サンプリングによるエラーのためにあったかもしれない特に20 NTU未満の濁度測定値との水域の締め切り、。目詰まりの度合いは、両方のフィルタタイプ及び水質パラメータに依存している。プレフィルタは、改善のいくつかの尺度を提供するが、使用される場合、処理され、分析されるべきである別途電気陽性フィルタから。 UCMR3ための現在の推奨は、試料は、少なくとも半分のボリュームが最初のフィルターを用いて収集することができる場合、2つの酸化アルミニウムナノ繊維ベースのフィルタを使用して、プレフィルターすることなく収集することができるということである。
Acknowledgments
著者らは、その貢献ICRとの間に実施モニタリングを行った数々のEPAの担当者に感謝可能UCMR3、報告されている他のEPA研究の次のリード研究者：ダニエルDahling、アルフレッドデュフール、アンドレイエゴーロフ、スーザンGlassmeyer、ASJA Korajkic、リチャード·リーバーマン、ロバートSafferman、とティム·ウェイド。批判的にこの原稿をレビューするとシャノングリフィンとマイケル·ウェア。著者は、サンプル収集を実証するため、それらのポンプの家の1つの使用のためにインドのヒル水道に感謝。この作品は、USEPAによって審査と出版が承認されましたが、それは必ずしも公式代理店の方針を反映していない場合があります。商標名や商用製品に関する記述は、使用のために承認または推奨するものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-L polypropylene bottle | Nalgene | 2104-0032 | |
| Aluminum foil squares | Cole-Parmer | 06275-40 | |
| Autoclave | Steris | Amsco Lab Series | |
| Bubble wrap | U.S. Plastics | 50776 | |
| Closable bag | Uline | S-12283 | |
| Closable bag | Fisher Scientific | S31798C | |
| Commercial ice packs | Cole-Parmer | 06345-20 | |
| Cool safe box | Diversified Biotech | CSF-BOX | |
| Gauze sponge | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Graduated cylinder | Cole-Parmer | 06135-90 | 4-L or larger |
| Hype Wipe | Fisher Scientific | 14-412-56 | |
| iButtons temperature data logger | Maxim | DS1921G | |
| Insulated storage and transport chest | Fisher Scientific | 11-676-12 | |
| Packing tape | U.S. Plastics | 50083 | |
| Portable chlorine colorimeter II test kit | Hach | 5870062 | |
| Portable pH and temperature probe | Omega | PHH-830 | |
| Portable turbidity meter | Omega | TRB-2020-E | |
| PTFE thread tape | Cole-Parmer | 08270-34 | Use on all threaded connections |
| Pump, Centrifugal Magnetic Drive | Cole-Parmer | 72010-20 | |
| Reduction nipple | Cole-Parmer | 06349-87 | |
| Sodium hypochlorite (NaClO) | Use locally available household bleach | ||
| Sodium thiosulfate (Na2S2O3) | Sigma Aldrich | 217247 | |
| Surgical gloves | Fisher Scientific | 19-058-800 | |
| Waterproof marker | Fisher Scientific | 22-290546 | |
| Media | Composition | ||
| 0.525% sodium hypochlorite (NaClO) | Prepare a 0.525% NaClO solution by diluting household bleach 1:10 in dH2O. Store 0.525% NaClO solutions for up to 1 week at room temperature. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M sodium thiosulfate (Na2S2O3) pentahydrate | Prepare a 1 M solution by dissolving 248.2 g of Na2S2O3 in 1 L of dH2O. Store sodium thiosulfate for up to 6 months at room temperature. |
References
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