Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.
Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.
Levende celler bank metabolisk energi i form af fedt og kulhydrater og anvende denne energi til biosyntese, transport membran og bevægelse. Noget energi opnås i cytosolen ved konvertering af kosten sukker direkte i ATP under glykolyse. Men den vigtigste kilde til ATP-produktion i en celle udnyttes i mitokondrierne via mitokondrie respiratoriske kæde 1. Arkitekturen af mitokondrier giver den nødvendige rumlige orientering for effektiv og ATP-produktion. Mitokondrier har en dobbelt membran adskilt af et intermembrane rum og sammen med matrixen, den inderste mitokondrie rum, hus komponenterne og koordinere de kemiske reaktioner der er involveret i ATP generation. Den indre membran indeholder en række membranbundne proteinkomplekser, der omfatter den respiratoriske kæde samt ATP syntase, proteinkomplekset, der bringer ADP og Pi sammen for dannelse af ATP. KroenER-membranen er foldet ind cristae og elektroner ledes langs de respiratoriske kæde-komplekser via cytochrom c, et opløseligt elektron bærer, som bevæger sig mellem komplekser i intermembrane rum. Som elektroner bevæger oxidation af reducerende ækvivalenter forekommer og hydrogenioner pumpes fra matrixen til intermembrane rum. Som følge af den høje ionkoncentration i intermembrane rum, en elektrokemisk gradient bygger resulterer i en membran potentiale over den indre mitokondrielle membran (Δψ) 2. Oxygen er den endelige elektronacceptor af elektron transportkæden og hydrogenioner flyde gennem ATP syntaser fra intermembrane rum tilbage til matrixen, og dermed direkte forårsage ATP formation. Denne fremgangsmåde, som beskrevet i sin helhed er kendt som oxidativ phosphorylering. Folderne i cristae forøge overfladearealet af den indre membran, der giver mulighed for maksimal elektrontransport og ATP-produktion ihvert mitokondrie. De proteiner, enzymer og andre molekyler, der er involveret i den oxidative phosphorylering er afledt fra både nukleare og mitokondrie-gener. Mitokondrier indeholder deres egen cirkulært DNA, der koder for 13 proteiner samt tRNA'er og mRNA'er er nødvendige for ATP-produktion 3. Men mange flere proteiner kræves, og derfor er det nukleare kodet. De fleste af disse nukleare kodede proteiner er målrettet til det mitokondrielle matrix ved anvendelse af præsekvenser ved N-terminalen af precursorproteinet og deres import drives delvist af Δψ 4,5.
Ud over at bidrage til bioenergetik af en celle, mitokondrier indflydelse også store metaboliske processer, såsom TCA og beta-oxidation, cellulær signalering gennem regulering calcium, samt en central rolle i apoptose 6. Specifikt i perioder af cellulær stress, BCL-2-familien proteiner, der er placeret på eller interagere på den mitokondriske ydre membran kan forårsage mitochondrialydre membranpermeabilitet (MOMP) 7,8. Under MOMP er cytochrom c og andre proteiner frigives i cytosolen, og sammen med flere cytosoliske proteiner danner et kompleks kaldet apoptosome 9,10. Den apoptosome aktiverer caspaser, der går på at spalte cellulære proteiner og DNA under udførelsesfasen af apoptose. Så snart MOMP sker, er ΔΨ kollapsede og ATP produktion standset. Således som apoptose initieres mitokondriefunktion er kompromitteret og ændringer i ΔΨ kan korreleres til mitokondrie og celle sundhed 12. Mens apoptose er et endepunkt i mange sygdomsmodeller, mitokondriefunktion og ændringer ΔΨ kan også give værdifuld information om sygdommen access og / eller progression. For eksempel har mitokondriske strukturelle og funktionelle ændringer er dokumenteret i løbet af neurodegenerative sygdomme 13,14.
I den første del af protokollen, isoning af intakte mitochondrier, der bevarer deres ΔΨ beskrives. HEK-293T-celler blev udsat for forskellige koncentrationer og kombinationer af rekombinant TNF-α, IL1-β og IFN-γ til at inducere apoptose. Disse cytokiner er valgt, fordi de ofte er rapporteret at være høj i primære septisk prøver human 15 og extrinsicsti apoptose kan udløses ved interaktion af TNF-α-binding til dets receptor 6. Da der er subtile variationer er nødvendige for at isolere funktionel mitokondrier fra primære væv sammenlignet med dyrkede celler, og fordi megen forskning udnytter dyr, protokollen beskriver også, hvordan at isolere mitokondrier fra leveren og rygmarv af anterior lateral sklerose (ALS) musemodel.
Den anden del af protokollen blev udviklet til at overvåge perturbationer til mitokondriemembranpotentiale anvendelse af en potentiel fluorescensfarvestof med en fluorescerende pladelæser. Forskels mellem cellulær status (dvs. sunde vs. usund) er differentierede ved kvantificering af styrken af ΔΨ af isolerede mitokondrier i forbindelse med frakobling midler, respiratoriske kæde inhibitorer, komplekse inhibitorer og ionoforer, som alle forårsager spredning af det mitokondrielle membranpotentiale. Den sundere mitokondrier, den større ændring i ΔΨ ved behandling med mitochondriale inhibitorer, derfor reaktion mitokondrier kan anvendes som en indikator for mitochondrial (dys) funktion.
Anvendelse af isolerede mitokondrier snarere end in situ vurdering af funktion giver endelige bevis for, at en patologi eller behandling modulerer ændringer organel 16-18 direkte. Mens der er metoder i litteraturen til at isolere mitokondrier fra dyrkede celler, er de vage 17 og / eller udnytte specialudstyr 16. Denne protokol beskriver detaljeret isolation fremgangsmåde og erlet tilpasses til andre cellelinier, herunder primært væv og kulturer 13,14,19,20. Mange isolerede mitokondrier undersøgelser udnytte de samme mitokondrie uncouplers og inhibitorer, der anvendes i denne protokol, men med en Clark-elektrode (21 er et repræsentativt eksempel på mange papirer i litteraturen), som igen er en meget specifik og specialiseret udstyr. Desuden er denne traditionelle metode har begrænsninger, såsom lav produktivitet og høj kompleksitet 22,23 og kræver en betydelig mængde af mitokondrier (~ 500 pg / reaktion). I denne protokol, er den fluorescerende membran-sensing potentiel sonde TMRE anvendes i forbindelse med en fluorescerende plade læser, som er en standard maskine i mange laboratorier. TMRE er bredt anerkendt, da den træder hurtigt celler og isolerede mitokondrier og kan bruges ved lave koncentrationer 24. Flere reaktioner kan hurtigt sættes op i tandem og batch analyseres ved hjælp af denne protokol. Endvidere reaktionens kræver en meget lille mængde af isolerede mitokondrier (~ 10 pg / reaktion). Ved at kræve mindre materiale, kan mindre væv eller cellekultur prøver anvendes som et udgangspunkt for mitokondrier isolation, kan flere replikater eller reaktioner oprettes, og potentielt nok materiale til andre isolerede mitokondrier eksperimenter som ATP produktion, iltforbrug, eller import assays er mulige.
Behandling af HEK-293T-celler med rekombinante cytokiner forårsager moderate mængder af celledød i løbet af 48 timer (figur 1). Mængden af celledød induceret af TNF-alfa behandling ligner tidligere rapporterede undersøgelser 30 og celleviabilitet falder efter samtidig administration af flere cytokiner, der er større end summative beløb med enhver cytokin alene er også i overensstemmelse med litteraturen 31,32. Evnen til at tilpasse de beløb og typer af cytokin behandling…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Trisma base | Sigma | T6066 | |
MOPS | Sigma | M3183 | |
CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C. |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C. |
sucrose | Fisher | S5-500 | |
KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
ADP | Sigma | A2754 | |
TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100uM stock with EB immediatley before use. |
DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20C |
FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
DMSO | SIgma | D2650 | |
Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2mg/mL stock in water for protein assay. |
MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week. |
Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20C |
Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |