בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר
Summary
Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.
Abstract
Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.
Introduction
תאי חיים אנרגית בנק חילוף חומרים בצורה של שומנים ופחמימות ולהשתמש באנרגיה זו לביוסינתזה, תחבורת קרום ותנועה. אנרגיה מסוימת מתקבלת בcytosol באמצעות ההמרה של סוכרים תזונתיים ישירות לתוך ATP בגליקוליזה. עם זאת, המקור העיקרי לייצור ATP בתא הוא רתם בתוך המיטוכונדריה באמצעות שרשרת הנשימה במיטוכונדריה 1. הארכיטקטורה של המיטוכונדריה מספקת התמצאות במרחב הדרושה לייצור ATP אפקטיבי ויעיל. המיטוכונדריה יש קרום כפול מופרד על ידי שטח intermembrane ויחד עם המטריצה, תא המיטוכונדריה הפנימי ביותר, בית הרכיבים ולתאם את התגובות כימיות מעורבות בדור ATP. הקרום הפנימי מכיל סדרה של קומפלקסי חלבוני קרום נכנסים המרכיבים את שרשרת הנשימה, כמו גם את synthase ATP, החלבון מורכב שמביא ADP וPi יחד ליצירת ATP. הפונדקקרום אה מקופל לתוך cristae ואלקטרונים מועברים לאורך מתחמי שרשרת הנשימה דרך ציטוכרום C, מוביל אלקטרון מסיס הנע בין מתחמים במרחב intermembrane. כאלקטרונים לנוע, חמצון שווה הפחתה מתרחש ויוני המימן נשאבים מהמטריצה למרחב intermembrane. כתוצאה מריכוז היון הגבוה בתוך החלל intermembrane, שיפוע אלקטרוכימיים בונה וכתוצאה מכך פוטנציאל קרום על פני הקרום הפנימי של המיטוכונדריה (Δψ) 2. החמצן הוא מקבל אלקטרונים הסופיים של שרשרת הובלת אלקטרונים, ויונים מימן לזרום דרך synthases ATP ממרחב intermembrane חזרה למטריצה, ובכך לגרום להיווצרות ATP ישירות. תהליך זה כפי שתואר בשלמותו ידוע כזרחון חמצוני. קפלי cristae להגדיל את שטח הפנים של הקרום הפנימי, המאפשרים לתחבורה מקסימלי אלקטרון וייצור ATP בכל mitochondrion. החלבונים, האנזימים ומולקולות אחרות שהיו מעורבות בזרחון חמצוני נגזרים משני הגנים גרעיניים והמיטוכונדריה. המיטוכונדריה מכילה DNA המעגלי, הקידוד שלהם במשך 13 חלבונים כמו גם tRNAs וmRNAs ההכרחי לייצור ATP 3. עם זאת, רבים יותר חלבונים נדרשים ולכן הם מקודדים גרעיניים. רוב החלבונים המקודדים גרעיניים אלה ממוקדים למטריצת המיטוכונדריה על ידי השימוש בpresequences בN-הסופי של החלבון המבשר, והיבוא שלהם הוא מונע בחלקו על ידי Δψ 4,5.
מעבר לתרומה ליו-האנרגיה של תא, מיטוכונדריה גם להשפיע על תהליכי חילוף חומרים גדולים כמו TCA ובטא-חמצון, איתות תאית באמצעות סידן ויסות, כמו גם תפקיד מרכזי באפופטוזיס 6. באופן ספציפי, בזמנים של לחץ סלולארי, חלבוני Bcl-2 משפחה שמתגוררים באו אינטראקציה בקרום החיצוני של המיטוכונדריה יכול לגרום המיטוכונדריה7,8 חדירות קרום חיצוניות (MOMP). במהלך MOMP, ג ציטוכרום וחלבונים אחרים משתחררים לcytosol, ויחד עם כמה חלבוני cytosolic צורה מורכבת הנקרא apoptosome 9,10. Apoptosome מפעיל caspases שילך על לדבוק חלבונים ו- DNA של תאים בשלב הביצוע של אפופטוזיס. ברגע שMOMP מתרחש, ΔΨ הוא התמוטט וייצור ATP נעצר. פונקציה של המיטוכונדריה כך, כאפופטוזיס הוא יזם נפגעת ושינויים בΔΨ יכולים להיות מתואמים להמיטוכונדריה ותא בריאות 12. בעוד אפופטוזיס הוא נקודת סיום במודלים של מחלות רבות, מיטוכונדריה והשינויים ΔΨ גם יכול להניב מידע רב ערך על מקור מחלה ו / או התקדמות. לדוגמא, שינויים מבניים ותפקודיים של המיטוכונדריה תועדו במהלך מחלות ניווניות 13,14.
בחלקו הראשון של הפרוטוקול, isolation של המיטוכונדריה שלמה ששומרת ΔΨ מתואר. תאי HEK-293T נחשפו לריכוזים ושילובים של TNF-α רקומביננטי, IL1-β וIFN-γ שונים כדי לגרום לאפופטוזיס. ציטוקינים אלה נבחרו כי הם דיווחו להיות גבוהים בדגימות אנושיות עיקריות ספיגה 15 ומסלול החיצוני של אפופטוזיס יכול להיות מופעל על ידי אינטראקציה של TNF-α מחייב לקולטן שלו 6 בתדירות גבוהה. מאחר שיש וריאציות עדינות צורך לבודד המיטוכונדריה תפקודית מרקמות עיקריות בהשוואה לתאים בתרבית, וכי מחקרים רבים מנצל בעלי חיים, הפרוטוקול גם מתאר כיצד לבודד המיטוכונדריה מכבד וחוט שדרה של קדמי טרשת לרוחב מודל עכבר (ALS).
החלק השני של הפרוטוקול פותח כדי לפקח הפרעות לפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה באמצעות צבע ניאון פוטנציאל רגיש עם קורא צלחת ניאון. הבדלים בין מעמד הסלולרי (כלומר, בריא לעומת בריא) נבדל בquantitating הכוח של ΔΨ של מיטוכונדריה המבודדת בשיתוף עם סוכני תרה, מעכבי שרשרת נשימה, מעכבים ויונופורים מורכבים, אשר כולם לגרום לפיזור של פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה. המיטוכונדריה בריאה, גדול יותר את השינוי בΔΨ על טיפול במעכבי המיטוכונדריה, ולכן התגובה של המיטוכונדריה יכולה לשמש כמדד לתפקוד המיטוכונדריה (פרע).
שימוש במיטוכונדריה המבודדת ולא בהערכה באתרו של פונקציה מציעה ראיות מוחלטות שפתולוגיה או טיפול ישירות מודולציה שינויים אברון 16-18. אמנם יש שיטות בספרות לבודד את המיטוכונדריה מהתאים בתרבית, הם מעורפלים 17 ו / או להשתמש בציוד מיוחד 16. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את שיטת הבידוד ובקלות להתאמה לשורות תאים אחרות, כוללים ברקמה ותרבויות 13,14,19,20 עיקריות. מחקרי מיטוכונדריה מבודדים רבים לנצל את אותו uncouplers המיטוכונדריה ומעכבי שימוש בפרוטוקול זה, אבל עם אלקטרודה קלארק (21 היא דוגמא מייצגת של מאמרים רבים בספרות), ששוב היא פיסת הציוד מאוד ספציפית ומיוחדת. יתר על כן, לשיטה מסורתית זו יש מגבלות כגון תפוקה נמוכה וגבוהות מורכבות 22,23 ודורשת כמות משמעותית של המיטוכונדריה (~ 500 מיקרוגרם / תגובה). בפרוטוקול זה, TMRE הבדיקה ניאון חישת הקרום הפוטנציאלי להשתמש בשילוב עם קורא צלחת ניאון, שהוא מכונה סטנדרטי במעבדות רבות. TMRE נחשב מאז שהוא נכנס במהירות תאים ומיטוכונדריה מבודדת וניתן להשתמש בם בריכוזים נמוכים 24. יכולות להיות מוגדרות במהירות תגובות מרובות במקביל ויצוו נותחו באמצעות פרוטוקול זה. יתר על כן, התגובהs דורשת הרבה כמות קטנה של מיטוכונדריה המבודדת (~ 10 מיקרוגרם / תגובה). על ידי הדורשים פחות חומר, יכולות להיות מנוצלת דגימות רקמה או תרבית תאים קטנות יותר כנקודה מוצא לבידוד המיטוכונדריה, ניתן להגדיר יותר חזרות או תגובות למעלה, ובאופן פוטנציאלי מספיק חומר לניסויי מיטוכונדריה מבודדים אחרים, כגון ייצור ATP, צריכת חמצן, או יבוא מבחני אפשריים.
Protocol
Representative Results
Discussion
טיפול בתאי HEK-293T עם ציטוקינים רקומביננטי גורם כמויות מתונות של מוות של תאים מעל 48 שעות (איור 1). כמות המוות של תאים הנגרם על ידי טיפול TNF-alpha דומה למחקרים שדווחו בעבר 30 וכדאיויות תא פוחתות לאחר שיתוף ממשל של ציטוקינים מרובים כי הם יותר מ כמויות מסכמות עם כל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | Can use the potassium salt instead. |
| malic acid | Sigma | M8304 | Can use the potassium salt instead. |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| CCCP | Sigma | C2920 | Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C. |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C. |
| sucrose | Fisher | S5-500 | |
| KCN | Mallinckrodt | 6379 | Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water |
| rotenone | Sigma | R8875 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| oligomycin | Sigma | O4876 | Highly toxic. Made in ethanol. |
| ADP | Sigma | A2754 | |
| TMRE | Sigma | 8717-25mg | Dilute 100uM stock with EB immediatley before use. |
| DMEM | Gibco | 11965-084 | 1x regular (high glucose). |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-155 | |
| L-glutamine | Fisher | SH3002101 | Store aliquots at -20C |
| FBS | Lonza | 14-501F | US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
| DMSO | SIgma | D2650 | |
| Protien Assay Dye (5x) | Bio-Rad | 500-0006 | Any protein assay can substitute. |
| BSA | Fisher | BP1600-100 | Make 2mg/mL stock in water for protein assay. |
| MTT powder | Sigma | M2128 | Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week. |
| Tergitol solution (NP-40) | Sigma | NP40S | |
| Recombinant Human IL-1B | Gibco | PCH08014 | Once opened store aliquots at -20C |
| Recombinant Human TNF-alpha | Gibco | PHC3015L | |
| Recombinant Human IFN-gamma | Gibco | PHC4031 | |
| Dulbeccos PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions. |
| Cytochrom c ELISA kit | R&D systems | DTC0 | Human for HEK-293T cells. |
References
- Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
- Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
- Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
- Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
- Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
- Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
- Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
- Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
- Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. , (2011).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
- Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
- Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
- Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
- Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
- Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
- Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
- Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
- Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
- Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
- Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
- Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
- Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
- Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
- Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
- Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).
