Isolamento e Análise Funcional de mitocôndrias de células cultivadas e mouse Tissue

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

As células vivas depositar energia metabólica sob a forma de gorduras e hidratos de carbono e utilizar esta energia para a biossíntese, transporte de membrana e movimento. Alguma energia é obtida no citossol através da conversão dos açúcares alimentares directamente em ATP durante a glicólise. No entanto, a principal fonte de produção de ATP numa célula é aproveitada dentro das mitocôndrias através da cadeia respiratória mitocondrial ^1. A arquitectura de mitocôndrias proporciona a orientação espacial necessária para a produção de ATP efectiva e eficiente. As mitocôndrias possuem uma membrana dupla separados por um espaço intermembranar e em conjunto com a matriz, o compartimento mitocondrial mais interna, a casa dos componentes e coordenar as reacções químicas envolvidas na geração de ATP. A membrana interna contém uma série de complexos de proteínas ligadas a membranas que compreendem a cadeia respiratória, assim como o ATP sintase, o complexo de proteína que traz ADP e Pi juntos para a formação de ATP. A pousadamembrana er é dobrada em cristas e os elétrons são passados ​​ao longo dos complexos da cadeia respiratória através do citocromo c, uma transportadora de electrões solúvel que se move entre os complexos dentro do espaço intermembranar. Como electrões mover, a oxidação de equivalentes redutores ocorre e os iões de hidrogénio são bombeados da matriz para o espaço intermembranar. Como consequência da elevada concentração de iões no interior do espaço intermembranar, um gradiente electroquímico constrói resultando em um potencial de membrana, através da membrana mitocondrial interna (Δψ) ^2. O oxigênio é o receptor de elétrons final da cadeia de transporte de elétrons e íons de hidrogênio fluir através das sintases ATP do espaço intermembranar de volta para a matriz, e ao fazê-lo diretamente causar a formação de ATP. Este processo tal como descrito na sua totalidade, é conhecida como a fosforilação oxidativa. As dobras do cristas aumentar a área de superfície da membrana interior, permitindo o transporte de electrões máxima e a produção de ATP dentrocada mitocôndria. As proteínas, enzimas e outras moléculas envolvidas na fosforilação oxidativa são derivadas de ambos os genes nucleares e mitocondriais. A mitocôndria contém seu próprio DNA circular, de codificação para 13 proteínas, bem como tRNAs e mRNAs necessárias para a produção de ATP ^3. No entanto, muitas mais proteínas são necessárias e, portanto, são nuclear codificado. A maior parte destas proteínas nucleares codificados são direccionadas para a matriz mitocondrial pelo uso de pré-sequências na extremidade N-terminal da proteína precursora, e a sua importação é impulsionado em parte por Δψ ^4,5.

Além de contribuir para a bioenergética da célula, as mitocôndrias também influenciar principais processos metabólicos, tais como o TCA e beta-oxidação, a sinalização celular através da regulação de cálcio, bem como um papel-chave na apoptose ^6. Especificamente, durante períodos de estresse celular, proteínas BCL-2 familiares que residem em ou interagir na membrana externa mitocondrial pode causar mitocondriala permeabilidade da membrana externa (MOMP) ^7,8. Durante MOMP, citocromo c e outras proteínas são libertadas no citosol, e, juntamente com várias proteínas citosólicas formar um complexo denominado apoptossomo ^9,10. O apoptossomo ativa caspases que transitam para a decompor as proteínas celulares e DNA durante a fase de execução da apoptose. Assim como ocorre MOMP, ΔΨ é recolhido e produção de ATP interrompida. Assim, a função mitocondrial, tal como apoptose é iniciada é comprometida e mudanças na ΔΨ pode ser correlacionada com mitocondrial e célula de saúde ^12. Enquanto a apoptose é um ponto final em muitos modelos de doenças, a função mitocondrial e mudanças para ΔΨ também pode fornecer informações valiosas sobre a origem e / ou progressão da doença. Por exemplo, as alterações estruturais e funcionais mitocondriais foram documentadas durante o decurso de doenças neurodegenerativas ^13,14.

Na primeira parte do protocolo, isolação de mitocôndrias intactas que conservam a sua ΔΨ é descrito. As células HEK-293T foram expostas a diferentes concentrações e combinações de recombinante de TNF-α, IL1-β e IFN-γ para induzir apoptose. Estas citocinas foram escolhidos porque eles são frequentemente relatada como sendo elevada em amostras sépticas humanos primários ¹⁵ e a via extrínseca da apoptose pode ser desencadeada pela interacção de ligação ao seu receptor de TNF-α ^6. Uma vez que existem variações subtis necessárias para isolar mitocôndrias funcionais de tecidos primários, em comparação com células cultivadas, e porque muita pesquisa utiliza animais, o protocolo também descreve como isolar mitocôndrias de fígado e de medula espinal de anterior esclerose lateral (ALS) modelo de ratinho.

A segunda parte do protocolo foi desenvolvido para controlar as perturbações do potencial de membrana mitocondrial utilizando um corante fluorescente sensível ao potencial com um leitor de placa fluorescente. Diferenças entre o estado celular (isto é, saudáveis ​​vs insalubre) são diferenciados por quantificação da força de ΔΨ de mitocôndrias isoladas em conjunto com agentes de desacoplamento, inibidores da cadeia respiratória, inibidores do complexo e ionóforos, os quais causam a dissipação do potencial da membrana mitocondrial. Quanto mais saudável as mitocôndrias, quanto maior for a alteração na ΔΨ aquando do tratamento com inibidores mitocondriais, por conseguinte, a resposta das mitocôndrias podem ser utilizadas como um indicador da função mitocondrial (dis).

Uso de mitocôndrias isoladas em vez de na avaliação in situ da função oferece uma evidência definitiva de que o tratamento de uma patologia ou modula alterações directamente para o organelo ^16-18. Embora existam métodos na literatura para isolar mitocôndrias de células cultivadas, eles são vagos ¹⁷ e / ou utilizar equipamentos especializados ^16. Este protocolo descreve em pormenor o método de isolamento e éfacilmente adaptável a outras linhas celulares, incluindo o tecido primário e culturas ^13,14,19,20. Muitos estudos mitocôndrias isoladas utilizar as mesmas desacopladores mitocondriais e inibidores utilizados neste protocolo, mas com um eletrodo de Clark ⁽²¹ é um exemplo representativo de muitos trabalhos na literatura), que por sua vez é uma peça muito específica e especializada de equipamentos. Além disso, este método tradicional tem limitações tais como baixo rendimento e alta complexidade ^22,23 e requer uma quantidade substancial de mitocôndrias (~ 500 ng / reacção). Neste protocolo, o potencial fluorescente TMRE sonda de detecção de membrana é utilizado em conjunto com um leitor de placas fluorescente, que é uma máquina padrão em muitos laboratórios. TMRE é amplamente considerada, uma vez que rapidamente entra nas células e mitocôndrias isoladas e podem ser usadas em baixas concentrações ^24. Várias reações podem ser rapidamente configurado em conjunto e em lotes analisados ​​usando esse protocolo. Além disso, a reacçãos requer uma pequena quantidade muito de mitocôndrias isoladas (~ 10 ug / reacção). Ao exigir menos material, amostras de tecido ou de cultura de células mais pequenas pode ser utilizada como um ponto de partida para o isolamento de mitocôndrias, mais repetições ou as reacções podem ser configurados, e material potencialmente suficiente para outras experiências mitocôndrias isoladas, tais como a produção de ATP, o consumo de oxigénio, ou importação Os ensaios são possíveis.

Protocol

Todos os experimentos com animais conformados com Institutos Nacionais de Saúde e diretrizes foram aprovadas pela Wake Forest University Animal Care e do Comitê Use. Casais reprodutores para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de rato foram obtidos no Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Do tipo selvagem (WT) fêmeas e machos SOD1G93A não transgênicas [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] foram criados para gerar ratos SOD1G93A e ninhada WT não transgênicas que foram utilizados nos experimentos. <p class="jo…

Representative Results

O tratamento de células HEK-293T com 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml de IL1-β, e 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 h, conduz a quantidades progressivas de morte celular (Figura 1A ). A viabilidade celular foi avaliada utilizando ensaios de MTT e consistentemente demonstra que existe ~ diminuição de 10% na viabilidade celular com o tratamento com 24 ~ hr e diminuição de 20% com o tratamento de 48 horas. As células tratadas com concentrações semelhantes (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml…

Discussion

O tratamento de células HEK-293T com citocinas recombinantes provoca quantidades moderadas de morte de células ao longo de 48 horas (Figura 1). A quantidade de morte celular induzida por tratamento TNF-alfa é semelhante aos estudos previamente relatados ³⁰ e a viabilidade celular diminui após a co-administração de várias citocinas que são maiores do que as quantidades aditivas com qualquer citocina sozinha também é consistente com a literatura ^31,32. A capacidade de ajust…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.