Introduction
وقد اجتذبت الخلايا المشتقة من مصادر فترة ما حول الولادة، مثل المشيمة والأغشية المشيمية، الحبل السري والسائل الذي يحيط بالجنين الاهتمام من الباحثين والأطباء كمصدر محتمل للخلايا الطب التجديدي 1،2. والسبب في هذا الاهتمام هو أن هذه الأنواع من الخلايا كل تمتلك قدرا من المرونة والقدرة المناعية 3، الخصائص التي تعتبر أساسية لتطبيقات العلاجية المحتملة.
hAECs هي السكان الظهارية غير المتجانسة التي يمكن استخلاصها من مصطلح أو قبل الأجل السلى غشاء 4، وتوفير مصدر محتمل وفيرة من المواد الخلوية التجدد. الخصائص التي تجعل hAECs جذابة كعلاج الخلوي تتضمن multipotency بهم، وانخفاض المناعية، وخصائص مضادة للالتهابات. تم العثور على hAECs أن يكون متعدد القدرات العالية على حد سواء في التجارب المختبرية والحية، وقادرة على التفريق في الأنساب أرومية متوسطة (cardiomyocytes، myocytes، osteocytes، الخلايا الشحمية)، الأنساب الأديم الباطن (خلايا البنكرياس وخلايا الكبد وخلايا الرئة) والأنساب الأدمة (الشعر، والجلد، والخلايا العصبية والخلايا النجمية) 5-10.
مطمئن، على الرغم من hAECs multipotency بهم لا تظهر إلى أي شكل أو أورام تعزيز التنمية الورم في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، hAECs هي أيضا في مأمن حظا، معربا عن انخفاض مستويات مستضدات الكريات البيض الدرجة الثانية البشرية (HLAs) 8. هذا العقار على الأرجح راء قدرتهم على التهرب من الرفض المناعي بعد زرع خيفي وxenogenic، كما هو موضح في الدراسات التي تستخدم القرود المناعة المختصة والأرانب وخنازير غينيا والجرذان والخنازير 11-13. عرض hAECs المناعية قوية وخصائص المثبطة للمناعة وبالتالي توفر مزايا عملية كبيرة لالتطبيقات السريرية المحتملة في علاج أمراض المناعة الذاتية. ويعتقد hAECs لممارسة مهام المناعية على كل من أنظمة المناعة الفطرية والتكيفية. في(ه) من الآليات المقترحة، هو من خلال إفراز المناعية عوامل 14.
وتشمل التطبيقات الحالية للhAECs في نماذج الأمراض الحيوانية ما قبل السريرية لعلاج السكتة الدماغية، والتصلب المتعدد، وأمراض الكبد والسكري وأمراض الرئة المزمنة والحادة. وقد أظهرت الباحثون اهتماما باستخدام hAECs لعلاج ما بعد السكتة الدماغية والتهاب الدماغ بسبب خصائصها الفريدة. هناك أدلة على أن hAECs يمكن عبور حاجز الدم في الدماغ حيث يمكنهم تدبر، البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى 60 يوما، وتفرق في الخلايا العصبية، وتقليل الالتهاب وتعزيز تجديد الأنسجة التالفة الجهاز العصبي المركزي في النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية 15.
hAECs توفر القدرة على استهداف وعكس مسارات متعددة المرضية التي تساهم في تطور وتقدم مرض التصلب المتعدد. على سبيل المثال، ينتج من الدراسات على الحيوانات ما قبل السريرية تشير إلى أن hAECs هي مناعة بقوة ويمكن أن يحتمل لحث على التسامح المناعي الطرفية وعكس الاستجابات الالتهابية الجارية. كما تبين hAECs لديها القدرة على التمايز إلى خلايا العصبية في الجسم الحي وتعزيز neuroregeneration الذاتية من خلال إفراز مجموعة واسعة من التغذية العصبية عوامل 16.
وقد أظهرت الخلايا الظهارية الإنسان والقوارض السلى بالفعل فعاليتها العلاجية لعلاج أمراض الكبد في النماذج الحيوانية. في رابع كلوريد الكربون نموذج الضرر تحريض أمراض الكبد، وhAEC زرع تؤدي إلى engraftment من hAECs قابلة للحياة في الكبد، وترافق مع انخفاض الخلايا الكبدية، وانخفاض التهاب الكبدي وتليف 17.
hAECs يمكن حفز لعوامل البنكرياس أعرب بما في ذلك الأنسولين والجلوكوز النقل. حققت العديد من الدراسات إمكانية hAECs لاستعادة مستويات السكر في الدم في الفئران السكري 18. في الفئران تلقيhAECs، انخفضت كل من الوزن والسكر في الدم جسم الحيوان المستويات لمستوياتها الطبيعية بعد حقن الخلايا. هذه الدراسات تمثل حجة قوية لاستخدام hAECs لعلاج داء السكري.
hAECs يكون لها دور ثبت في منع وإصلاح التجريبية الحادة والمزمنة إصابة الرئة في كل من الكبار ونماذج حديثي الولادة 19. وجدت هذه الدراسات أن hAECs التفريق في المختبر في الرئة وظيفية الخلايا الظهارية معربا متعددة البروتينات المرتبطة الرئة، بما في ذلك التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، والقناة الايونية التي تحور في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي 20. بالإضافة إلى ذلك، عندما يتم تسليم hAECs إلى الكبار المصابين والرئة لحديثي الولادة، وأنها تمارس تأثيراتها تعويضية عن طريق تعديل الخلايا المناعية، والحد من التوظيف الكرية البيضاء الرئوي، بما في ذلك العدلات، الضامة والخلايا اللمفية 21-23.
ونظرا فرة بهم،سجل السلامة، والتطبيقات السريرية مؤكدة لأمراض متعددة، والتجارب السريرية باستخدام hAECs أمر لا مفر منه. وذلك بهدف الإسراع في ترجمة العلاجات hAEC في التجارب السريرية، قمنا بتطوير طرق لعزل وcryopreserve وhAECs الثقافة بطريقة مناسبة للتجارب السريرية، وذلك باستخدام الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية وفقا للممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) المبادئ التوجيهية .
نحن مقرها هذا البروتوكول بروتوكول نشرت سابقا التي كنا نستخدمها بنجاح لعزل hAECs باستخدام الكواشف المشتقة من الحيوانات 6. نحن تغيير البروتوكول الأصلي ليحل محل المنتجات المشتقة من الحيوانات مع الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية، وأجريت الأمثل لاحق لتحسين العائد الخلية، وسلامة ونقاء. كان هدفنا لوضع بروتوكول من شأنه أن تمتثل للمعايير التنظيمية لتصنيع الخلايا للتجارب السريرية الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: المشيمة ينبغي جمع من الحمل صحية مفردة، مع تفضيل أقسام المدى القيصرية الاختيارية. مكتوبة، ينبغي إيلاء الموافقة المسبقة لجمع المشيمة عند هؤلاء النساء. ينبغي للجنة أخلاقيات البحث الإنسان الخاص ذات الصلة موافقة جميع عمليات جمع واستخدام الأنسجة البشرية.
1. عزل الخلايا الظهارية السلى
- وضع المشيمة على سطح معقمة داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.
- باستخدام هانكس معقمة محلول ملحي متوازن (HBSS)، وغسل الكثير من الدم ممكن من سطح المشيمة والأغشية.
- مع المشيمة وضعت مع الحبل السري تواجه تصل، فصل ميكانيكيا الحافة الخارجية للالسلى والمشيمه الأغشية.
- مرة واحدة فصل، تجريد يدويا غشاء السلى من غشاء المشيمه من المشيمة، والعمل حول حافة الغشاء، نحو الحبل السري.
ملاحظة: كن carefالمجاهدين لإزالة أي قطعة من تلوث غشاء المشيمه من السلى. - باستخدام مقص العقيمة، وقطع غشاء السلى يقرب من 2 سم من قاعدة الحبل السري ومكان في 500 مل مختومة حاوية تحتوي على 250 مل HBSS.
- يغسل جيدا عن طريق هز زجاجة مغلقة تحتوي على غشاء السلى.
- إزالة غشاء السلى من حاويات خاصة لجمع باستخدام ملقط معقم، والمكان إلى 15 سم طبق بتري.
- قطع غشاء السلى إلى قطع ما يقرب من 5 سم طويلة (عندما عقدت رأسيا مع ملقط)، ونبذ قطع الدموية أو تمزقها.
- مكان في 500 مل مختومة الحاويات ويغسل مع 250 مل HBSS حوالي 3-5 مرات أو حتى يصبح غشاء السلى شفافة مع عدم وجود الدم الملوثة.
ملاحظة: أي الحاضر الدم قد يقلل من كفاءة الهضم الأنزيمي الحل. - نقل كل قطعة من غشاء السلى في وعاء يحتوي على 50 مل من الأنزيمية الهضم حل، مع الحرص علىتقليل المرحل من HBSS.
- احتضان القطع السلى في الأنزيمية الهضم حل في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة لطيف لإزالة أي الدم المتبقية.
- إزالة قطع غشاء السلى من الأنزيمية الهضم حل وضعها في وعاء معقم جديدة.
- إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للغشاء السلى واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة مع طيف والهز (الهضم الأول).
- إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء.
ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية. - إضافة 100 مل من الأنزيمية جديدة هضم حل للالسلى قطع الغشاء واحتضان 60 دقيقة في حمام مائي أو غرفة دافئة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف (الهضم الثاني).
- تمرير suspensi خليةعلى من الخطوة 1.14 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1 مل للحصول على تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: في هذه المرحلة الخلايا يمكن أن تترك على الجليد حتى الخلايا من هضم الثاني هي في نفس المرحلة من المعالجة. - إزالة السلى قطع الغشاء ووضع في جديدة الرعاية أخذ حاوية للسماح للهضم الأنزيمية حل لاستنزاف من كل قطعة من الغشاء.
ملاحظة: ويمكن تحقيق ذلك عن طريق سحب القطع السلى على طول الحافة الداخلية للحاوية. - تمرير تعليق الخلية من الخطوة 1.18 من خلال مرشح 70 ميكرون والطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- إزالة وتجاهل طاف، و resuspend بيليه خلية في 4 مل HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع 1 مل صipette للحصول على تعليق خلية واحدة.
- خلايا تجمع من اثنين من هضم أو بدلا من ذلك الحفاظ على هضم خلية فصل حتى بعد عدد الخلايا.
ملاحظة: هذا يمنع الاختلاط الخلايا الجدوى يحتمل أن تكون منخفضة مع الخلايا قابلية عالية. - إضافة HBSS إلى الحجم النهائي من 10-20 مل وتنفيذ عدد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق لقياس قدرتها على البقاء.
- تأكيد النمط الظاهري الخلايا الظهارية بواسطة التدفق الخلوي. تشكل الكوكتيلات الأجسام المضادة المناسبة استخدام الألغام المضادة للEpCAM-PE (1: 2 التخفيف) لمكافحة CD90-PeCy5 (1: 250) ومكافحة CD105-APC (1: 100) في HBSS.
- و resuspend مجموعة فرعية من الخلايا من واحد أو كلا هضم في كوكتيل الأجسام المضادة بتركيز 25 × 10 6 خلية / مل.
- لالتدفق الخلوي، وصمة عار 1 × 10 6 خلايا مع الكوكتيلات الأجسام المضادة التي تحتوي على الضوابط نمط إسوي (على سبيل المثال. ضبط PE مفتش 1 + نمط إسوي مكافحة CD90-PeCy5 + مكافحة CD105-APC). إبقاء ~ 1 × 10 6 خلايا غير ملوثين لتدفق عداد الكريات انشاء.
- احتضان الخلايا في الجسم المضادالكوكتيلات في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- غسل الخلايا 3X في HBSS و resuspend كل 5 إلى 10 مليون خلية لكل مليلتر عن التدفق الخلوي.
- أداء التدفق الخلوي والنتائج المذكرة. ومن المتوقع أن يكون 90-95٪ و<1٪ على التوالي نقاء عزل الخلية (نسبة EpCAM إيجابي وCD90 / CD105 خلايا السلبية).
- تخصيص عدد مناسب من الخلايا لاختبار المعايير المناسبة لمراقبة الجودة أو الإفراج على النحو الذي يحدده التطبيق النهائي.
ملاحظة: يمكن أن يتضمن هذا المرض / الفحص الفيروسي، أو السلامة الأخرى أو المعايير البيولوجية. - للحصول على الخلايا المتبقية، متابعة بروتوكول الحفظ بالتبريد، أو بدلا من وضع مباشرة في ثقافة (المباشرة للثقافة الخطوة 3.6).
2. الحفظ بالتبريد من hAECs
- تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام التدفق الخلوي البيانات أو العد والفرز اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق.
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق.
- خلية في resuspendالصورة بين 1-10٬000٬000 خلايا لكل مل في الحيوانات خالية من المنتج الإعلامي الحفظ بالتبريد.
- ماصة حجم مناسب من الخلايا في قارورة الحفظ بالتبريد-الحلقية O والمكان الى جهاز معدل تجميد تسيطر عليها حيث يحدث التبريد في حوالي 1 ° C / دقيقة حتى -80 درجة يتحقق C.
- نقل قوارير في النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.
3. ذوبان وثقافة Cyropreserved hAECs
- إزالة قارورة الحفظ بالتبريد من النيتروجين السائل ووضع على الجليد.
ملاحظة: بالنسبة للنقل فقط - المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية. - ذوبان الجليد قارورة الحفظ بالتبريد بسرعة عند 37 درجة مئوية حتى فقط قطعة صغيرة (~ 5 مم × 5 مم) من يبقى الجليد.
ملاحظة: من المهم أن الحل الخلية لا الحارة للحد من الآثار السامة للDMSO في وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد. - تمييع وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد 10 أضعاف مع الباردة (~ 4 ° C) خالية من المصل وسائل الإعلام، وأضاف الإفلات من الحكمة في حجم مناسبد أنبوب أو حاوية.
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- resuspend في المصل خالية المتوسطة، إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية لكل مليلتر. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق. ويتوقع بقاء بعد ذوبان الجليد يكون 5-10٪ أقل من الجدوى قبل الحفظ بالتبريد.
- لوحة الخلايا على القياسية خلية المعالجة الثقافة البلاستيك وير، أو بدلا من ذلك استخدام النوع الأول الكولاجين على الأسطح الثقافة معطف.
- لمن النوع الأول الكولاجين طلاء اتباع البروتوكول التالي
- تحضير حامض للذوبان النوع الأول الكولاجين من المشيمة البشرية (15 ملغ الكولاجين مع 25 مل من الماء منزوع الأيونات و 50 ميكرولتر حمض الخليك الجليدي).
- تغطية الكأس مع بارافيلم ويقلب باعتدال عند 37 درجة مئوية حتى تذوب خيوط الكولاجين.
- معقم حل مرشح الكولاجين باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
- تمييع تصفيتها الكولاجين 1:10 الأسهم مع الماء منزوع الأيونات. هذا المخزون المخفف هو العمل بغية دراسته واقرارهحل ntration للأسطح طلاء من البلاستيك والغشاء.
- الكولاجين البلاستيك معطف، والزجاج، وغشاء الأسطح لمدة 2 ساعة على RT عند 37 درجة مئوية، أو O / N في 2-8 ° C.
- إزالة السوائل الزائدة من السطح المطلي، واتركه حتى يجف O / N.
- شطف مع زراعة الأنسجة المياه الصف معقمة أو HBSS قبل إدخال الخلايا والمتوسطة.
- hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والسماح التعلق تحدث عن 72-96 ساعة.
- وبعد التعلق، وتغيير وسائل الإعلام بواسطة الشفط بعناية واستبدالها مع حجم مناسب من المصل خالية المتوسطة كل 2-3 أيام.
- خلايا مرور باستخدام بروتوكول أدناه
- نضح وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتغسل مع حجم 1X من معقم HBSS
- إضافة حجم 1X من الأنزيمية الهضم الحل واحتضان لمدة 5-15 دقيقة، أو حتى خلايا لوحظ فصل من سطح ثقافة الخلية.
- جمع الأنزيمية الهضم محلول يحتوي على الخلايا، وضمان مLLS يتم فصل من سطح ثقافة الخلية بواسطة pipetting مرارا الأنزيمية الهضم حل ضد سطح خلية ثقافة
- أجهزة الطرد المركزي في 700 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend وبيليه الخلية في حجم مناسب من HBSS يحتوي على 1 ملغ / مل القائم على فول الصويا مثبط الإنزيم. بلطف ماصة مرارا وتكرارا مع ماصة 1ML للحصول على تعليق خلية واحدة.
- إضافة المصل خالية المتوسطة إلى تركيز تقريبي من 1 مليون خلية / مل. تحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء باستخدام الفرز الآلي أو اليدوي مع استبعاد التريبان الأزرق.
- hAECs لوحة في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلية / سم 2 في المصل خالية المتوسطة، والاستمرار في طرق زراعة القياسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عندما يتبع هذا الإجراء بشكل صحيح، ينبغي أن يتوقع متوسط العائد من 120 مليون hAECs، مع مجموعة نموذجية من 80-160٬000٬000 الخلايا. من هذه المحاصيل، ويمكن توقع متوسط بقاء 83 ± 4٪. قد يكون زيادة متوسط العائد وانخفاض طفيف جدوى في طريقة السريري بسبب ارتفاع النشاط التربسين من المنتج المشتق من الحيوان، وربما أيضا بسبب عدم وجود بروتينات مصل. hAECs معزولة إن متوسط الشخصي سطح الخلية من 92٪ EpCAM خلايا إيجابية مع <1٪ CD90، CD105 علامة الوسيطة خلايا إيجابية. وقد تم اختيار هذه العلامات بسبب خصوصيتها لالظهارية 24،25 والوسيطة 26 الأنساب على التوالي. هذه العملية يمكن أن تستغرق ما يقرب من 4-5 ساعة لاستكمال (الشكل 1).
الحفظ بالتبريد يتطلب 20-60 دقيقة اعتمادا على عدد من قوارير والعائد خلية النهائي. لقد اختبرنا سابقا مجموعة من وسائل الإعلام الحفظ بالتبريد وجدتأن العديد من الحيوانات الإعلام الحر المنتج أداء مناسب، ولكن تركيز DMSO الأمثل هو حوالي 5-10٪. وعادة ما يمكن للمرء أن يتوقع بقاء بعد ذوبان الجليد لتكون 5-10٪ أقل من الجدوى قبل الحفظ بالتبريد، وهذه الخسارة يمكن أن يكون أكبر بكثير بالنسبة للمستخدم عديم الخبرة (الشكل 2).
زراعة الخلايا لا يمكن أن يؤديها مع hAECs لتمكين توصيف، والتمايز، أو غيرها خاصة في إجراءات المختبر. هذه الخلايا نعلق في البداية إلى سطوح الخلايا مع كفاءة 50-80٪ (الملاحظة الشخصية). وهذا يزيد إلى 70-90٪ مع مقاطع لاحقة. ويمكن زيادة مرفق مع استخدام مواد طلاء السطح مثل نوع الكولاجين I، أو المنتجات المماثلة. hAECs الحفاظ على النمط الظاهري على الظهارية في وسائل الإعلام ثقافة خالية من المصل (الشكل 3). لقد وجدنا تغييرات كبيرة في ملامح علامة سطح الخلية التالية مرور المتكررة. بالإضافة إلى ذلك، بعد ما يقرب من 5 مقاطع hAECs يمكن إييثإيه تصل إلى الشيخوخة، أو الذهاب من خلال تغيرات شكلية تتفق مع الظهارية لالوسيطة الانتقالية. بعد مرور المتكررة، hAECs الحفاظ على النمط النووي العادي، أطوال التيلومير طويلة وتوزيع دورة الخلية. هذه الخصائص تشير إلى وجود مخاطر منخفضة من التحول أو tumorigenicity. بالإضافة إلى امتلاك الخصائص التنظيمية والمضادة للالتهابات المناعية، وقد ثبت hAECs أن يكون متعدد القدرات العالية في التجارب المختبرية والحية، التفريق إلى ممثل الأنساب خلية من الطبقات الجرثومية الأولية الثلاثة (الشكل 4).
الشكل 1: العائد المتوقعة الخلية، وسلامة ونقاء للبروتوكول العزلة السريري غلة خلية مماثلة وقدرتها على البقاء لا يمكن أن يتحقق باستخدام منتجات الحيوانات الكواشف المجانية بالمقارنة مع الطرق التي تحتوي على المنتجات الحيوانية القياسية. وينبغي أن يكون العزلة النموذجية> 90٪ EpCAM و<1٪ CD90 / CD105 إيجابيةالخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:.. المشاركة ذوبان الجليد الجدوى والتمثيل الغذائي للالمحتوية على مصل وخالية من المصل وسائل الاعلام الحفظ بالتبريد بالمقارنة مع FBS تحتوي على 10٪ DMSO، أظهرت الحيوانات سائل الإعلام الحفظ بالتبريد خالية من المنتجات المتاحة تجاريا مماثلة أو زيادة الجدوى بعد ذوبان الجليد والتمثيل الغذائي يرجى النقر هنا ل عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): مرفق نموذجي والنمو الشخصى hAECs في المصل خالية والتي تحتوي على مصل طريق مسدود خليةأظهر البنية المتوسطة. خالية من المنتجات الحيوانية وسائل الإعلام ثقافة مرفق مناسب خلية، والانتشار، وصيانة النمط الظاهري الظهارية. ومع مزيد من المصل خالية تطوير الوسائط هو مطلوب لتحقيق نتائج متساوية إلى وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل. الحانات النطاق تمثل 500 ميكرون.
الرقم 4: التمايز متعددة القدرات من hAECs في مرور وقت مبكر، وقد ثبت hAECs على التمايز إلى ممثل الأنساب خلايا متعددة الطبقات الجرثومية الأولية الثلاثة. وتشمل هذه الأنساب، ولكن لا تقتصر على، الخلايا العصبية وخلايا الشعر والجلد، ظهارة الرئة، العضلية، خلايا الكبد وخلايا البنكرياس، osteocytes والخلايا الشحمية. (الشكل مقتبس من 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من المعلمات الحرجة التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير في نجاح هذه المنهجية. تخزين المشيمة أو السلى لمدة تصل إلى 3 ساعات قبل عزل hAECs قد يكون من المرغوب فيه لأغراض لوجستية أو جدولة، ومع ذلك فمن المستحسن أن تتم معالجة الأنسجة في أقرب وقت ممكن. إذا الأنسجة ليتم تخزينها، فمن المستحسن أن تخزين أن يؤديها التالية تشريح وغسل غشاء السلى. السلى يمكن تخزينها في HBSS العقيمة التي تحتوي على المضادات الحيوية في 4 درجات مئوية، ومع ذلك بقاء الخلية يمكن أن تقلل مع تمديد فترة التخزين. ونحن، وغيرها وقد وجدت التغير في العائد الخلية وقدرتها على البقاء، والتقليل من هذا التباين فمن المستحسن أن يتم جمع من ولادة مصطلح صحية، وتسليمها يفضل العملية القيصرية أن المشيمة.
وجدنا أن تلوث غشاء السلى مع خلايا الدم سوف يؤدي إلى تثبيط نشاط انزيم وانخفاض في العائد الخلية. لذلكخطوة حاسمة في البروتوكول هو الغسل الكامل من المشيمة ويوصى غشاء السلى. فمن المستحسن أن الأنسجة السلى غسلها حتى يبدو أبيض / واضح لتجنب المصب تثبيط الانزيم. عزل السكان متجانسة نسبيا من الخلايا الظهارية مهم للاختبار توصيف ومراقبة الجودة.
في حالة حدوث عوائد منخفضة، قابلية أو تلوث العائد الخلية مع خلايا اللحمة المتوسطة هناك العديد من التعديلات التي يمكن القيام بها لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. إذا غلة خلية منخفضة، فمن المرجح أن النشاط الأنزيمي كان مستعمل بسبب تلوث الدم أو المصل. هذا لا يمكن حلها مع خطوات الغسيل أكثر دقة وإضافية و / أو التخلص قطع السلى الدموية أو الملوثة. ويمكن أيضا إنزيم فترة حضانة يمكن زيادة، ولكن هذا يمكن أن يضر بقاء الخلية. انخفضت قابلية أو تلوث مع خلايا اللحمة المتوسطة يمكن تجنبها من خلال خفض الوقت هضم. ومع ذلك، ثيقد ق أيضا تقليل العائد الكلي للخلايا. الأوقات التي تتراوح بين 30 دقيقة إلى 2 ساعة يمكن استخدامها لهذا البروتوكول. وتحتاج هذه الأوقات ليكون الأمثل لالمطلوب نقاء خلية وإجمالي العائد / قدرتها على البقاء. واحد الحد من هذه التقنية هو أن زيادة العائد الخلية أو جدوى يمكن أن تأتي على حساب بعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك، مكونات المصل خالية في الوقت الراهن ليس كما فعالة للحفاظ على بقاء الخلية بعد التعرض لنشاط الأنزيمي.
خلايا يمكن أن يكون cryopreserved دون أي انخفاض كبير في بقاء الخلية أو فقدان التمثيل الغذائي عن طريق التخزين في درجة الحرارة للرقابة نظام النيتروجين السائل. هذا يمكن أن تتراوح من جهاز الحفظ بالتبريد بسيطة مليئة الأيزوبروبانول إلى نظام دولة من بين الفن تسيطر معدل التجمد. على حد علمنا، لم يتم تحديد سعر تجميد الأمثل لhAECs في هذا النظام، إلا أن معدل قياسي قدره 1 ° C النتائج / دقيقة في صيانة مناسبة لبقاء الخلية والتمثيل الغذائي بعد ذوبان الجليد. خلال ذوبان سو خلايا cryopreserved، من المهم للحفاظ على الوقت الذوبان إلى أدنى حد ممكن للحد من التعرض الخلية إلى DMSO. الخلايا قد تعلق وتتكاثر بمعدل أقل التالية الحفظ بالتبريد والذوبان بالمقارنة مع زراعة الخلايا المعزولة حديثا.
التطبيق السريري لأنه قد يكون من المرغوب فيه خلايا الثقافة لزيادة عدد الخلايا أو لتوصيف المصب و / أو التلاعب في المختبر. يجب القراء من فهم الطريقة المحددة في التلاعب في المختبر قد يغير مسارات التنظيمية المعنية في التطبيق السريري لهذه الخلايا. نحن التحقيق أن حيوان خالية من المنتج مستنبت مثل EpiLife كان مناسبة لصيانة وتوسيع hAECs. ومع ذلك، هو مطلوب منها لتحسين تركيز عامل النمو لتحقيق زيادة معدلات النمو لهذا نوع من الخلايا. قضية الالتزام الخلية خلال الثقافة باستخدام مصفوفة الكولاجين طلاء الإنسان، ويزيد من كفاءة الطلاء. ومع ذلك، وبعد فترة طويلة الإلكترونيةxposure لعملية الهضم الأنزيمي كفاءة الطلاء ستكون دون المستوى الأمثل.
وخلاصة القول، وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتسهيل العزلة والثقافة من خلايا الإنسان الظهارية السلى (hAECs) باستخدام الكواشف خالية من المنتجات الحيوانية وفقا للممارسات التصنيع الجيدة الحالية (المركب) المبادئ التوجيهية. وميزة هذه الطريقة بالمقارنة مع الطرق البديلة العزلة، هو أن هذه الخلايا يمكن أن تكون معزولة، وتتميز، cryopreserved ومثقف دون التعرض لخطر تقديم مسببات الأمراض الحيوانية يمكن أن تكون ضارة للبشر، مع الحفاظ على عوائد خلية مناسبة، viabilities وإمكانات النمو. للباحثين الانتقال من الدراسات على الحيوانات ما قبل السريرية لتجارب سريرية، فإن هذه المنهجيات التعجيل بشكل كبير على موافقة الجهات التنظيمية، وانخفاض المخاطر وتحسين نوعية السكان الخلية العلاجية الخاصة بهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
