Introduction
Celler afledt af perinatale kilder, såsom moderkagen, placentamembraner, navlestreng og fostervand har tiltrukket opmærksomhed fra forskere og klinikere som en potentiel kilde til celler til regenerativ medicin 1,2. Grunden til denne interesse er, at disse celletyper alle besidder en vis grad af plasticitet og immunmodulerende kapacitet 3, egenskaber, der er afgørende for deres potentielle terapeutiske anvendelser.
hAECs er en heterogen epithelial befolkning, kan udledes sigt eller pre-term amnion membranen 4, giver en rigelig potentiel kilde til regenerativ cellemateriale. De egenskaber, der gør hAECs tiltalende som en cellulær terapi omfatter deres multipotency, lav immunogenicitet, og anti-inflammatoriske egenskaber. hAECs har vist sig at være yderst multipotente både in vitro og in vivo, er i stand til at differentiere til mesodermale slægter (cardiomyocytes, myocytter, osteocytter, adipocytter), endodermale slægter (pancreas celler, leverceller, lunge-celler) og ektodermale slægter (hår, hud, nerveceller og astrocytter) 5-10.
Beroligende, på trods af deres multipotency hAECs ikke synes at enten danne tumorer eller fremme tumorudvikling in vivo. Desuden hAECs er også immune privilegerede, der udtrykker lave niveauer af klasse II humane leukocytantigener (HLAS) 8. Denne egenskab sandsynligvis ligger bag deres evne til at omgå immunafstødning efter allogen og xenogen transplantation, som påvist i undersøgelser under anvendelse af immunkompetente aber, kaniner, marsvin, rotter og svin 11-13. hAECs vise potent immunmodulerende og immunosuppressive egenskaber og kan derfor tilbyde betydelige praktiske fordele for potentielle kliniske anvendelser i autoimmun sygdom terapi. hAECs menes at udøve immunmodulerende funktioner på både medfødte og adaptive immunforsvar. Påe af de mekanismer, som er blevet foreslået, er gennem udskillelsen af immunmodulerende faktorer 14.
Aktuelle anvendelser af hAECs i prækliniske dyremodeller indbefatter behandling af slagtilfælde, dissemineret sklerose, leversygdom, diabetes og kroniske og akutte lungesygdomme. Forskere har vist interesse i at bruge hAECs til behandling efter slagtilfælde hjernebetændelse på grund af deres unikke egenskaber. Der er bevis for, at hAECs kan krydse blod-hjerne barrieren, hvor de kan indpode, overleve i op til 60 dage, differentiere i neuroner, mindske inflammation og fremme regenerering af beskadiget væv fra centralnervesystemet i dyremodeller af neurologiske sygdomme 15.
hAECs tilbyder muligheden for at målrette og vende flere patologiske veje, der bidrager til udvikling og progression af multipel sklerose. For eksempel resultater fra dyreforsøg prækliniske tyder på, at hAECs er stærkt immunosuppressiv ogpotentielt kan inducere perifer immuntolerance og omvendt igangværende inflammatoriske responser. hAECs har også vist sig at have evnen til at differentiere i neurale celler in vivo og øge endogen neuroregeneration gennem sekretion af en bred vifte af neurotrofiske faktorer 16.
Menneskelige og gnaver amnion epitelceller har allerede vist deres terapeutiske virkning til behandling af leversygdom i dyremodeller. I en tetrachlormethan skade induktion model for leversygdom, HAEC transplantation føre til indpodning af levedygtige hAECs i leveren, ledsaget med reduceret hepatocyt apoptose og nedsat hepatisk inflammation og fibrose 17.
hAECs kan stimuleres til udtrykt pancreas faktorer, herunder insulin og glucose transportører. Flere undersøgelser har undersøgt potentialet for hAECs at genoprette blodsukkerniveauet i diabetiske mus 18. I mus, der modtoghAECs faldt begge dyrets kropsvægt og blodsukkerniveauer til normale niveauer efter injektion af celler. Disse undersøgelser er et vægtigt argument for brugen af hAECs til behandling af diabetes mellitus.
hAECs har en dokumenteret rolle i forebyggelse og reparation af eksperimentel akut og kronisk lungeskade i både voksne og neonatale modeller 19. Disse undersøgelser fastslog, at hAECs differentiere in vitro i funktionel lungeepitelceller udtrykker flere lunge-associerede proteiner, herunder cystisk fibrose transmembrane konduktionsregulatorkanaler (CFTR), ion-kanal, der er muteret i patienter med cystisk fibrose 20. Og når hAECs leveres til den skadede voksne og neonatal lunge, de udøver deres reparative virkninger via modulation af værtens immunceller, reducerer pulmonal leukocyt rekruttering, herunder neutrofiler, makrofager og lymfocytter 21-23.
På grund af deres overflod,sikkerhedsniveau, og gennemprøvede kliniske anvendelser for flere sygdomme, kliniske forsøg med hAECs er uundgåelig. Med målet om hurtigere at omsætte HAEC terapier til kliniske-forsøg, har vi udviklet metoder til at isolere, kryopræservere og kultur hAECs på en måde, der er egnet til kliniske forsøg, ved hjælp af animalsk produkt-fri reagenser i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (cGMP) retningslinjer .
Vi bygger denne protokol en tidligere offentliggjort protokol, vi brugte med succes at isolere hAECs hjælp animalske reagenser 6. Vi ændrede den oprindelige protokol til at erstatte animalske produkter med animalsk produkt-fri reagenser, og efterfølgende optimering blev udført for at optimere celle udbytte, levedygtighed og renhed. Vores mål var at udvikle en protokol, som ville opfylde lovmæssige standarder for celle fremstilling for humane kliniske forsøg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: efterbyrd skal indsamles fra singleton sunde graviditeter, med en præference for udtrykket elektiv kejsersnit. Skrevet bør informeret samtykke gives til indsamling af deres moderkage. Din relevant menneskelig videnskabsetisk komité skal godkendelse al indsamling og brug af humane væv.
1. Isolering af amnion epithelialceller
- Placer placenta på en steril overflade i en klasse II biologisk sikkerhedsskab.
- Brug sterile Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), vask så meget blod som muligt fra placenta overflade og membraner.
- Med moderkagen placeret med navlestrengen opad, mekanisk adskille den ydre kant af fosterhinden og chorion membraner.
- Når adskilt, manuelt fratage amnion membran fra chorion membran af moderkagen, der arbejder rundt i kanten af membranen, mod navlestrengen.
BEMÆRK: careful at fjerne eventuelle stykker af kontaminerende chorion membran fra amnion. - Ved hjælp af steril saks, klippe amnion membranen ca. 2 cm fra bunden af navlestrengen og sted i en 500 ml forseglet beholder indeholdende 250 ml HBSS.
- Vask grundigt ved at ryste den forseglede flaske indeholdende fosterhinden membran.
- Fjern amnion membran fra opsamlingsbeholderen ved hjælp af sterile pincetter, og anbringes i en 15 cm petriskål.
- Skær amnion membranen i stykker ca. 5 cm lange (når det holdes lodret med tang), kassere blodig eller iturevne stykker.
- Til en 500 ml forseglet beholder og vaskes med 250 ml HBSS ca. 3-5 gange eller indtil amnion membranen bliver gennemskinnelig uden kontaminerende blod.
BEMÆRK: blod til stede, kan reducere effektiviteten af den enzymatiske fordøje opløsning. - Overfør alle stykker af amnion membran i en beholder, der indeholder 50 ml af den enzymatiske fordøje løsning, idet manminimere overførsel af HBSS.
- Inkuber amnion stykker i enzymatisk fordøje opløsning i et vandbad eller varmt rum ved 37 ° C i 15 minutter under forsigtig omrøring for at fjerne enhver resterende blod.
- Fjern fosterhinden membran stykker fra den enzymatiske fordøje løsning og sted i en ny steril beholder.
- Tilsæt 100 ml frisk enzymatisk fordøje løsning på amnion membran og inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter i et vandbad eller varmt rum med forsigtig rystning (første fordøjelse).
- Fjern fosterhinden membran stykker og anbringes i ny container og sørg for at tillade den enzymatiske fordøje opløsningen går fra hvert stykke membran.
BEMÆRK: Dette kan opnås ved at trække amnion stykker langs indersiden rand af beholderen. - Der tilsættes 100 ml frisk enzymatisk fordøje løsning på fosterhinden membran stykker og inkuberes 60 min i et vandbad eller varmt rum ved 37 ° C under forsigtig omrystning (anden fordøjelse).
- Før cellen suspensipå fra trin 1.14 gennem et 70 um filter og der centrifugeres ved 1000 xg i 10 min.
- Fjern og kassér supernatanten, og resuspender cellepelleten i 4 ml HBSS indeholdende 1 mg / ml sojabønne-baserede enzym-hæmmer. Forsigtigt pipette gentagne gange med en 1 ml pipette til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
BEMÆRK: På dette stadium celler kan stå på is, indtil celler fra den anden Digest er i samme forarbejdningsgrad. - Fjern fosterhinden membran stykker og anbringes i ny container og sørg for at tillade den enzymatiske fordøje opløsningen går fra hvert stykke membran.
BEMÆRK: Dette kan opnås ved at trække amnion stykker langs indersiden rand af beholderen. - Pass cellesuspensionen fra trin 1.18 gennem et 70 um filter og der centrifugeres ved 1000 xg i 10 min.
- Fjern og kassér supernatanten, og resuspender cellepelleten i 4 ml HBSS indeholdende 1 mg / ml sojabønne-baserede enzym-hæmmer. Forsigtigt pipette gentagne gange med en 1 ml pipette til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
- Pool celler fra de to fordøjelser eller alternativt holde celle fordøjer adskilt indtil efter celletal.
BEMÆRK: Dette forhindrer blanding af potentielt lav spiredygtighed celler med høj spiredygtighed celler. - Tilføj HBSS til et endeligt volumen på 10-20 ml og udføre celletællinger ved hjælp af trypanblåt til at måle levedygtighed.
- Bekræft epitelcelle fænotype ved flowcytometri. Der fyldes op passende antistof cocktails anvendelse af anti-EpCAM-PE (1: 2 fortynding) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) og anti-CD105-APC (1: 100) i HBSS.
- Resuspender en delmængde af celler fra en eller begge fordøjelser i antistoffet cocktail ved en koncentration på 25 x 10 6 celler / ml.
- For flowcytometri, bejdse 1 x 10 6 celler med antistof cocktails indeholder isotypekontroller (f.eks. IgG 1 isotypekontrol-PE + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Hold ~ 1 x 10 6 celler ufarvet for flowcytometer set-up.
- Cellerne inkuberes i antistofcocktails ved 4 ° C i 60 min.
- Vask cellerne 3x i HBSS og resuspender ved 5 til 10 millioner celler pr ml for flowcytometri.
- Udfør flowcytometri og note resultater. Renheden af cellen isolat (procentdelen af EpCAM positive og CD90 / CD105-negative celler) forventes at være 90-95% og <1%.
- Afsæt et passende antal celler til undersøgelse for passende kvalitetskontrol eller frigivelse kriterier som bestemt ved den endelige ansøgning.
BEMÆRK: Dette kan omfatte sygdom / viral screening eller anden sikkerhed eller biologiske kriterier. - For de resterende celler, følg kryopræservering protokollen, eller alternativt placere direkte i kultur (direkte til kultur trin 3.6).
2. Kryopræservering af hAECs
- Bestem celleantal og levedygtighed ved anvendelse af flowcytometri data eller manuel optælling med trypan blå eksklusion.
- Centrifuger ved 700 x g i 5 min.
- Resuspender celles på 1-10 millioner celler pr ml i animalsk produkt-fri kryopræservering medier.
- Pipette en passende mængde af celler i O-ringede cryokonserveringshætteglas og anbringes i en kontrolleret apparat rate frysning hvor køling sker ved ca. 1 ° C / min, indtil -80 ° C er opnået.
- Overfør hætteglas i flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
3. Optøning og Kultur Cyropreserved hAECs
- Fjern cryokonserveringshætteglas fra flydende nitrogen og placere på is.
BEMÆRK: For overførsel kun - snarest at næste skridt. - Optø cryokonserveringshætteglas hurtigt ved 37 ° C, indtil kun et lille stykke (~ 5 mm x 5 mm) af is tilbage.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at cellen løsning ikke varme til at reducere de toksiske virkninger af DMSO i kryopræservering medier. - Fortynd kryopræservering medier 10-fold med koldt (~ 4 ° C) serum-frie medier, tilsat dråbevist i en passende størrelsed rør eller beholder.
- Centrifuger ved 700 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender i serum-frit medium til en omtrentlig koncentration på 1 million celler pr ml. Bestem celle nummer og levedygtighed ved hjælp af automatiseret eller manuel optælling med trypanblåteksklusion. Forventet levedygtighed efter optøning vil være 5-10% mindre end før kryopræservering levedygtighed.
- Plate celler på standard cellekultur-behandlede plast ware, eller alternativt bruge Type I kollagen til at belægge kultur overflader.
- Til type I collagen belægning følge protokollen nedenfor
- Forbered syreopløseligt type I collagen fra human placenta (15 mg collagen med 25 ml deioniseret vand og 50 pi iseddikesyre).
- Dæk bægerglasset med parafilm og omrøres moderat ved 37 ° C, indtil collagen tråde er opløst.
- Sterilt filter collagen opløsning under anvendelse af et 0,22 um filter.
- Fortynd den filtrerede collagen stock 1:10 med deioniseret vand. Denne fortyndede bestand er arbejdsmiljøet koncentration opløsning til belægning af plast og membranoverflader.
- Collagen coat plast, glas og membranoverflader i 2 timer ved stuetemperatur ved 37 ° C eller O / N ved 2-8 ° C.
- Fjern overskydende væske fra den belagte overflade, og lad det tørre O / N.
- Skyl med sterilt vævskulturkvalitet vand eller HBSS før der indføres celler og medium.
- Plate hAECs ved en densitet på 25.000 celler / cm2 i serum-frit medium, og tillader fastgørelse forekomme 72-96 timer.
- Efter fastgørelse ændre mediet ved forsigtigt opsugning og udskifte den med en passende mængde af serum-frit medium hver 2-3 dage.
- Passage celler under anvendelse af protokol nedenfor
- Aspirer celledyrkningsmedier og vask med 1x volumen sterilt HBSS
- Tilføj 1x volumen af enzymatisk fordøje opløsning og inkuberes i 5-15 minutter eller indtil cellerne observeret frigørelse fra cellekulturen overflade.
- Saml enzymatisk fordøje opløsning indeholdende celler, der sikrer ceLLS frigøres fra cellekulturen overflade ved gentagen pipettering enzymatisk fordøje løsning mod cellekulturen overflade
- Centrifuger ved 700 x g i 5 min.
- Resuspender cellepelleten i et egnet volumen HBSS indeholdende 1 mg / ml sojabønne-baserede enzym-inhibitor. Forsigtigt pipette gentagne gange med en 1 ml pipette til opnåelse af en enkelt cellesuspension.
- Tilføj serum-frit medium til en omtrentlig koncentration på 1 million celler / ml. Bestem celle nummer og levedygtighed ved hjælp af automatiseret eller manuel optælling med trypanblåteksklusion.
- Plate hAECs ved en densitet på 25.000 celler / cm2 i serum-frit medium, og fortsætte med standard dyrkningsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne procedure er fulgt korrekt, bør forventes et gennemsnitligt udbytte på 120 millioner hAECs, med et typisk udvalg af 80-160,000,000 celler. Fra disse udbytter, kan forventes en gennemsnitlig levedygtighed 83 ± 4%. Den øgede gennemsnitsudbytte og lidt lavere levedygtighed i klinisk metode kan skyldes højere trypsin aktivitet end dyreafledt produkt, og måske også på grund af manglen på serumproteiner. Isolerede hAECs har en gennemsnitlig celle overflade profil på 92% EpCAM positive celler med <1% CD90, CD105 mesenkymale markør positive celler. Disse markører blev udvalgt på grund af deres specificitet for epitelceller 24,25 og mesenchymal 26 afstamninger hhv. Denne proces kan tage ca. 4-5 timer for at fuldføre (figur 1).
Kryopræservering kræver 20-60 min afhængigt af antallet af hætteglas og endelig celle udbytte. Vi har tidligere testet en række kryokonservering medier og fundetat mange dyr produktspecifikke frie medier passende udføre, men den optimale DMSO-koncentration er ca. 5-10%. Typisk kan man forvente levedygtighed efter optøning at være 5-10% mindre end før kryopræservering levedygtighed, og dette tab kan være betydeligt større for den uerfarne bruger (figur 2).
Cellekultur kan udføres med hAECs at muliggøre karakterisering, differentiering eller anden specifik in vitro procedurer. Disse celler oprindeligt tillægger celleoverflader med en effektivitet på 50-80% (personlig observation). Dette stiger til 70-90% med efterfølgende passager. Attachment kan øges ved brug af Overfladebehandlinger materialer som collagen type I, eller lignende produkter. hAECs opretholde deres epithelial fænotype i serumfrit dyrkningsmedium (figur 3). Vi har fundet betydelige ændringer i celleoverflademarkør profiler efter gentagen passage. Derudover efter cirka 5 passager hAECs kan eithER nå senescens, eller gå gennem morfologiske ændringer i overensstemmelse med epitelial til mesenkymale overgang. Efter gentagen passage, hAECs opretholde en normal karyotype, lange telomer længder og cellecyklus distribution. Disse egenskaber tyder på en lav risiko for transformation eller tumorigenicitet. Ud over at besidde immune regulatoriske og anti-inflammatoriske egenskaber, har hAECs vist sig at være yderst multipotente in vitro og in vivo, differentiere i cellelinier repræsentative for de tre primære kimlag (figur 4).
Figur 1:. Forventet celleudbytte, levedygtighed og renhed til klinisk isolation protokol svarende celleudbytter og levedygtighed kan opnås ved anvendelse af animalsk produkt uden reagenser i forhold til standard animal produktholdige metoder. En typisk isolation skal være> 90% EpCAM og <1% CD90 / CD105 positiveceller. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:.. Post tø levedygtighed og stofskifte for serum-holdige og serum-frit kryopræservering medier Sammenlignet med FBS indeholdende 10% DMSO, kommercielt tilgængelige animalsk produkt-fri kryopræservering medier viste lignende eller forøget efter optøning levedygtighed og stofskifte Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Typisk fastgørelse og vækst profil hAECs i serumfrit og serumholdigt celle cultur medium. Animal produkt-fri kultur medier viste egnet celle vedhæftet fil, proliferation og vedligeholdelse af epitelial fænotype. Men yderligere udvikling af serum-frie medier er nødvendig for at opnå lige resultater til serum-holdige medier. Skalapanelerne repræsenterer 500 um.
Figur 4:. Multipotente differentiering af hAECs Ved tidlig passage har hAECs vist sig at differentiere til flere cellelinier repræsentative for de tre primære kimlag. Disse slægter omfatter, men er ikke begrænset til; neuroner, hår og hudceller, lunge epitel, cardiomyocytter, hepatocytter, pankreatiske celler, osteocytter og adipocytter. (Figur tilpasset fra 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere kritiske parametre, der kan få væsentlig indflydelse på succesen af denne metode. Opbevaring af placenta eller amnion op til 3 timer før isolering af hAECs kan være ønskeligt for logistiske eller planlægning formål, men det anbefales, at vævet er behandlet så hurtigt som muligt. Hvis væv skal opbevares, anbefales det, at opbevaring udføres efter dissektion og vask af amnion membran. Amnion kan opbevares i sterile HBSS indeholdende antibiotika ved 4 ° C, dog cellelevedygtighed kan falde med forlænget opbevaringstid. Vi og andre har fundet variabilitet i celle udbytte og levedygtighed, og for at minimere denne variation anbefales det, at placenta er indsamlet fra raske sigt fødsler, fortrinsvis leveret af kejsersnit.
Vi fandt, at forurening af amnion membran med blodceller vil resultere i hæmning af enzymaktivitet og en reduktion i celle udbytte. Derforet afgørende skridt i protokollen er grundig vask af moderkagen og anbefales fosterhinden membran. Det anbefales, at amnion væv vaskes indtil den vises hvid / klar for at undgå nedstrøms enzyminhibering. Isolering af en relativt homogen population af epitelceller er vigtig for karakterisering og kvalitetskontrol.
Hvis der opstår lave udbytter, levedygtighed eller forurening af cellen udbytte med mesenchymalceller er der flere ændringer, der kan udføres i forbindelse med fejlfinding. Hvis celle udbytterne er lave, er det sandsynligt, at den enzymatiske aktivitet blev inhiberet på grund af blod eller serum forurening. Dette kan løses med mere grundige og yderligere vasketrin og / eller genudsætning blodig eller forurenede amnion stykker. Enzyme inkubationstid kan også øges, men det kan være skadeligt for cellernes levedygtighed. Nedsat levedygtighed eller kontaminering med mesenchymale celler kan undgås ved at reducere digest tid. Imidlertid this kan også mindske det samlede udbytte af celler. Times fra 30 minutter til 2 timer kan anvendes til denne protokol. Disse tider skal optimeres til den ønskede celle renhed og samlet udbytte / levedygtighed. En begrænsning ved denne teknik er, at stigende celleudbytte eller levedygtighed kan komme på bekostning af hinanden. Derudover er serumfri bestanddele i øjeblikket ikke så effektiv til at opretholde cellelevedygtighed efter udsættelse for enzymatisk aktivitet.
Celler kan kryopræserveres uden større fald i rentabilitet eller tab af stofskiftet celle ved opbevaring i et temperaturstyret flydende nitrogen system. Dette kan variere fra en simpel isopropanol fyldt kryopræservering enhed til en state-of-the-art kontrolleret hastighed frysning system. Så vidt vi ved, har den optimale frysning sats for hAECs i dette system ikke blevet fastlagt, men den normale sats på 1 ° C / min resulterer i passende vedligeholdelse af cellernes levedygtighed og efter optøning stofskifte. Under optøning of kryopræserverede celler, er det vigtigt at holde optøning til et minimum for at reducere celle eksponering for DMSO. Celler kan knytte og formere sig ved en lavere hastighed efter kryopræservering og optøning i forhold til dyrkning frisk isolerede celler.
Til klinisk anvendelse kan det være ønskeligt at dyrke cellerne til at øge celleantallet eller nedstrøms karakterisering og / eller in vitro-manipulation. Læsere bør forstå, hvordan deres specifikke in vitro manipulation kan ændre de regulatoriske veje, der er involveret i den kliniske anvendelse af disse celler. Vi undersøgte, at et animalsk produkt-frit dyrkningsmedium såsom EpiLife var egnet til vedligeholdelse og udbygning af hAECs. Det er dog nødvendigt at optimere vækstfaktor koncentrationer til at opnå øget vækst for denne celletype. Spørgsmålet om cellevedhæftning i kultur ved anvendelse af et humant collagen-coating matrix forøger udpladningseffektiviteten. Men efter længere tids eXposure til enzymatisk nedbrydning udpladningseffektiviteten vil være optimal.
Sammenfattende er denne protokol blevet udviklet for at lette isolering og dyrkning af humane amnion epitelceller (hAECs) ved hjælp af animalsk produkt-fri reagenser i overensstemmelse med gældende god fremstillingspraksis (cGMP) retningslinjer. Fordelen ved denne metode i forhold til alternative isoleringsmetoder, er, at disse celler kan isoleres, karakteriseres, kryopræserveret og dyrkes uden risiko for at levere potentielt skadelige dyrepatogener til mennesker, og samtidig opretholde passende celleudbytter, levedygtighed og vækstpotentiale. For forskere, der flytter fra prækliniske dyreforsøg til kliniske forsøg, vil disse metoder i høj grad fremskynde myndighedsgodkendelse, mindske risiciene og forbedre kvaliteten af deres terapeutiske celle population.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
