Introduction
תאים המופקים ממקורות סביב הלידה, כגון השליה, שליה קרומים, חבל טבור ומי שפיר שמשכו את תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי של תאים לרפואת רגנרטיבית 1,2. הסיבה לעניין זה היא כי סוגים אלה תא כל יש מידה מסוימת של גמישות ויכולת המערכת החיסונית 3, תכונות שהן יסוד ליישומים הטיפוליים הפוטנציאל שלהם.
hAECs היא אוכלוסייה הטרוגנית אפיתל שניתן להפיק מקרום amnion טווח או מראש טווח 4, מתן מקור פוטנציאלי בשפע של חומר תאי משובי. התכונות שהופכות את hAECs מושך כטיפול תאי כוללות multipotency שלהם, immunogenicity הנמוך, ותכונות אנטי דלקתיות. hAECs כבר מצא להיות multipotent ביותר הן במבחנה in vivo, מסוגלים להבדיל לשושלות mesodermal (cardiomyocytes, myocytes, osteocytes, adipocytes), שושלות endodermal (תאי לבלב, תאים כבד, תאי ריאה) ושושלות ectodermal (שיער, עור, תאים עצביים והאסטרוציטים) 5-10.
מרגיע, למרות hAECs multipotency שלהם אינו מופיע לשני גידולי טופס או לקדם התפתחות גידול in vivo. יתר על כן, hAECs גם חיסון חסוי, המבטא רמות נמוכות של II אנטיגנים המעמד אנושיים לויקוציטים (HLAs) 8. נכס זה צפוי עומד בבסיס היכולת שלהם כדי להתחמק מדחייה חיסונית לאחר השתלה אלוגנאית וxenogenic, כפי שהודגם במחקרים בקופים חיסוניים מוסמכים, ארנבות, שרקנים, חולדות, וחזירים 11-13. hAECs להציג המערכת החיסונית חזקה ונכסים לדיכוי המערכת החיסונית ובכך להציע יתרונות מעשיים משמעותיים עבור יישומים קליניים פוטנציאליים בטיפול מחלה אוטואימונית. הם האמינו hAECs להפעיל פונקציות המערכת החיסונית בשתי מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. בדואר של המנגנונים הציעו, הוא באמצעות ההפרשה של המערכת החיסונית גורמי 14.
יישומים הנוכחיים של hAECs במודלים של בעלי החיים מחלה פרה-קליניים כוללים טיפול בשבץ מוחי, טרשת נפוצה, מחלת כבד, סוכרת ומחלות ריאה כרוניות ואקוטיות. חוקרים הראו עניין בשימוש hAECs לטיפול בדלקת מוח שבץ-פוסט בשל המאפיינים הייחודיים שלהם. יש ראיות לכך hAECs יכול לחצות את מחסום דם המוח שבו הם יכולים נקלטים, לשרוד עד 60 יום, להתמיין לתאי עצב, להקטין את הדלקת ולקדם את ההתחדשות של רקמות פגועות של מערכת עצבים מרכזיות במודלים של בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות 15.
hAECs מציע את היכולת לכוון ולהפוך מסלולי פתולוגי מרובים שתורמים להתפתחות וההתקדמות של טרשת נפוצה. לדוגמא, נובע ממחקרים בבעלי חיים פרה-קליניים מציע כי hAECs הם מאוד מדכא את מערכת חיסון ועלול לגרום לסובלנות חיסונית פריפריה ולהפוך תגובות דלקתיות מתמשכות. hAECs גם הוכח יש את היכולת להתמיין לתאים עצביים in vivo ולשפר neuroregeneration אנדוגני באמצעות ההפרשה של מגוון רחב של גורמי neurotrophic 16.
תאי אפיתל אדם וamnion המכרסם כבר הוכיחו היעילות הטיפולית שלהם לטיפול במחלות כבד במודלים של בעלי חיים. במודל פחמן טטרא אינדוקציה נזק של מחלת כבד, השתלה להוביל hAEC לengraftment של hAECs קיימא בכבד, מלווה באפופטוזיס hepatocyte מופחת, וירידה בדלקת ופיברוזיס 17 בכבד.
יכול להיות מגורה hAECs לגורמי לבלב הביעו כוללים מובילי אינסולין וגלוקוז. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל לhAECs לשחזר את רמות הגלוקוז בדם בעכברים סוכרתיים 18. בעכברים שקבלhAECs, שתי רמות הסוכר בדם ומשקל הגוף של בעלי החיים ירד לרמות נורמליות לאחר הזרקה של תאים. מחקרים אלה מציגים טיעון חזק לשימוש בhAECs לטיפול בסוכרת.
יש לי hAECs תפקיד מוכח במניעה ובתיקון של פגיעת ריאות חריפה וכרונית ניסיונית בשני מבוגרים ודגמי יילודי 19. מחקרים אלה מצאו כי hAECs להבחין במבחנה לתאי האפיתל ריאות פונקציונליות להביע חלבונים הקשורים ריאה מרובים, כוללים סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR), ערוץ היון שעובר מוטציה בחולים עם סיסטיק פיברוזיס 20. בנוסף, כאשר hAECs מועברים למבוגר הפצועה וריאות של ילוד, שהם מפעילים השפעות המתקן שלהם באמצעות האפנון של תאים חיסוניים מארח, צמצום גיוס לויקוציטים ריאה, כוללים נויטרופילים, מקרופאגים ולימפוציטים מסוג 21-23.
בהתחשב בשפע שלהם,שיא בטיחות, ויישומים קליניים מוכחים למחלות מרובות, ניסויים קליניים באמצעות hAECs הוא בלתי נמנע. במטרה להאיץ את התרגום של טיפולי hAEC לקליניים-ניסויים, שפיתחנו שיטות לבודד, cryopreserve וhAECs התרבות באופן מתאים לניסויים קליניים, באמצעות ריאגנטים ללא מוצר מן החי בהתאם לשיטות ייצור טובות הנוכחיות הנחיות (cGMP) .
פרוטוקול זה אנו מבוססים פרוטוקול שפורסם בעבר שאנחנו משתמשים בהצלחה לבודד hAECs באמצעות ריאגנטים מן החי 6. אנחנו שיניתי את הפרוטוקול המקורי כדי להחליף מוצרים המופקים מבעלי חיים עם ריאגנטים ללא מוצר מן החי, ואופטימיזציה שלאחר מכן בוצעה כדי לייעל את תשואת תא, כדאיות וטוהר. המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול שעומד בתקנים רגולטוריים לתא ייצור לניסויים קליניים בבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: Placentae יש לאסוף מהריונות בריאים סינגלטון, עם העדפה לניתוחים קיסריים אלקטיביים טווח. בכתב, הסכמה מדעת יש לתת לאיסוף השליה שלהם. ועדת האתיקה במחקר האנושית הרלוונטית שלך צריך אישור כל האיסוף ושימוש ברקמות אנושיות.
1. בידוד של תאי אפיתל amnion
- מניחים את השליה על גבי משטח סטרילי בתוך ארון בטיחות ביולוגי ברמה השנייה.
- באמצעות הנקס סטרילי תמיסת מלח מאוזן (HBSS), לשטוף כמה שיותר דם ככל האפשר ממשטח השליה והקרומים.
- עם השליה ממוקמת עם חבל הטבור כלפי מעלה, באופן מכאני להפריד את הקצה החיצוני של קרומי amnion וסיסיים.
- ברגע שנפרד, להפשיט ידני קרום amnion מן הקרום סיסית השליה, עובד מסביב לקצה של הקרום, לכיוון חבל הטבור.
הערה: careful כדי להסיר כל חתיכות של זיהום קרום סיסית מamnion. - בעזרת המספריים סטרילי, לחתוך את קרום amnion כ -2 סנטימטרים מהבסיס של חבל הטבור ומניחים במכל אטום 500 מיליליטר המכיל 250 מיליליטר HBSS.
- לשטוף ביסודיות על ידי טלטול בקבוק האטומה המכיל קרום amnion.
- להסיר את קרום amnion מהמכלים המיוחד לאיסוף באמצעות מלקחיים סטרילית, והמקום לתוך צלחת פטרי 15 סנטימטר.
- חותך את קרום amnion לחתיכות כ -5 סנטימטרים (כאשר החזיקו במאונך עם מלקחיים), השלכת חלקים דמו או קרועים.
- מקום במכל אטום 500 מ"ל ולשטוף עם 250 מיליליטר HBSS כ 3-5 פעמים או עד שקרום amnion הופך שקוף ללא דם מזהם.
הערה: כל דם נוכחי עלולים להפחית את היעילות של האנזימטית לעכל פתרון. - להעביר את כל החתיכות של קרום amnion לתוך מיכל המכיל 50 מיליליטר של האנזימטית לעכל פתרון, מקפידלמזער שריד של HBSS.
- דגירה חתיכות amnion בהאנזימטית לעכל פתרון באמבט מים או בחדר חם על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה כדי להסיר כל דם שנותר.
- הסר את חתיכות קרום amnion מהאנזימטית לעכל פתרון ומקום במכל סטרילי חדש.
- הוספה של האנזימטית טרי 100 מיליליטר לעכל פתרון לקרום amnion ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות באמבט מים או בחדר חם עם (עיכול ראשון) טלטול עדין.
- הסר את חתיכות קרום amnion ומקום לטיפול לקיחת מיכל חדש כדי לאפשר האנזימטית לעכל פתרון לניקוז מכל פיסת הקרום.
הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי גרירת חתיכות amnion לאורך השפה הפנימית של המכל. - הוסף להאנזימטית טרי 100 מיליליטר לעכל פתרון לחתיכות קרום amnion דגירה 60 דקות באמבט מים או בחדר חם על 37 מעלות צלזיוס עם (עיכול שני) טלטול עדין.
- להעביר את suspensi התאמהשלב 1.14 דרך מסנן 70 מיקרומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות.
- להסיר ולסלק supernatant, וresuspend התא גלולה ב 4 מיליליטר HBSS המכיל 1 מ"ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם פיפטה 1 מיליליטר לקבל השעיה תא בודדת.
הערה: בשלב זה ניתן להשאיר תאים על קרח עד תאים מהתקציר השני הם באותו השלב של עיבוד. - הסר את חתיכות קרום amnion ומקום לטיפול לקיחת מיכל חדש כדי לאפשר האנזימטית לעכל פתרון לניקוז מכל פיסת הקרום.
הערה: זו יכולה להיות מושגת על ידי גרירת חתיכות amnion לאורך השפה הפנימית של המכל. - להעביר את ההשעיה התא משלב 1.18 דרך מסנן 70 מיקרומטר ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 10 דקות.
- להסיר ולסלק supernatant, וresuspend התא גלולה ב 4 מיליליטר HBSS המכיל 1 מ"ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם p מיליליטר 1ipette לקבל השעיה תא בודדת.
- בריכת תאים משני המעכלים או לחלופין לשמור מעכלים תא מופרד עד לאחר ספירת תאים.
הערה: זה מונע ערבוב של תאי כדאיות פוטנציאל נמוכים עם תאי כדאיות גבוהים. - הוספת HBSS לנפח סופי של 10-20 מ"ל ולבצע ספירת תאים באמצעות trypan הכחול כדי למדוד את הכדאיות.
- לאשר את הפנוטיפ תאי אפיתל על ידי cytometry זרימה. איפור קוקטיילים נוגדן מתאימים באמצעות אנטי EpCAM-PE (1: 2 דילול) אנטי-CD90-PeCy5 (1: 250) ואנטי-CD105-APC (1: 100) בHBSS.
- Resuspend משנה של תאים מאחד או שניהם מעכלים בקוקטייל של הנוגדנים בריכוז של 25 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- לcytometry זרימה, כתם 1 x 10 6 תאים עם קוקטיילים נוגדן המכילים פקדי isotype (למשל. שליטה PE אלוטיפ 1 IgG + אנטי CD90-PeCy5 + אנטי-CD105-APC). שמור ~ 1 x 10 6 תאים בלא כתם לcytometer זרימת הגדרה.
- דגירה תאים בנוגדןקוקטיילים על 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות.
- לשטוף את תאי 3x בHBSS וגלול ב5-10,000,000 תאים לכל מיליליטר לזרימה cytometry.
- לבצע cytometry זרימה ותוצאות פתק. טוהר בודד התאים (אחוז EpCAM החיובית וCD90 / CD105 תאים שליליים) צפוי להיות 90-95% ו- <1% בהתאמה.
- מניח בצד מספר מתאים של תאים לבדיקת קריטריוני בקרת איכות או שחרור מתאימים כפי שנקבע על ידי יישום סופי.
הערה: זה יכול לכלול מחלה / הקרנה נגיפית, או בטיחות אחרת או קריטריונים ביולוגיים. - לתאים הנותרים, לעקוב אחר פרוטוקול ההקפאה, או לחלופין להציב ישירות לתוך התרבות (ישירה לצעד תרבות 3.6).
2. Cryopreservation של hAECs
- לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות זרימת cytometry נתונים או ספירה ידנית עם הדרת trypan כחולה.
- צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות.
- תא גלולשל בין 1-10 מיליון תאים למ"ל בתקשורת הקפאה ללא מוצר מן החי.
- פיפטה נפח מתאים של תאים לתוך צלוחיות הקפאה-טבעתי O ומקום לתוך מנגנון הקפאת קצב מבוקר שבי הקירור מתרחש בכ 1 ° C / min עד -80 ° C מושגת.
- העבר את הבקבוקונים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
3. הפשרה ותרבות של Cyropreserved hAECs
- הסר בקבוקוני הקפאה מחנקן נוזלי ומניח על קרח.
הערה: להעברה בלבד - להמשיך במהירות לשלב הבא. - להפשיר את ההקפאה במהירות הבקבוקונים ב 37 מעלות צלזיוס עד שרק חתיכה קטנה (~ 5 מ"מ x 5 מ"מ) של הקרח נשאר.
הערה: חשוב שפתרון התא אינו לחמם כדי להפחית את ההשפעות הרעילות של DMSO בתקשורת ההקפאה. - לדלל תקשורת הקפאה של פי 10 ב( ~ 4 ° C) סרום ללא מדיה קרה, הוסיף טיפה חכמה בגודל מתאיםצינור ד או מיכל.
- צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות על RT.
- Resuspend במדיום סרום ללא, לריכוז של כ 1 מיליון תאים לכל מיליליטר. לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות ספירה אוטומטית או ידנית עם הדרת trypan כחולה. לאחר הפשרה-כדאיות צפויה תהיה 5-10% פחות מכדאיות מראש הקפאה.
- תאי צלחת על כלי פלסטיק סטנדרטיים תא שטופל תרבות, או לחלופין להשתמש בסוג אני קולגן למשטחי תרבות מעיל.
- לציפוי קולגן אני סוג לעקוב אחר הפרוטוקול להלן
- הכן חומצת סוג מסיס אני קולגן משליית אדם (קולגן 15 מ"ג עם 25 מיליליטר מים deionized ו 50 חומצה אצטית קרחונית μl).
- לכסות כוס עם Parafilm ומערבבים באופן מתון על 37 מעלות צלזיוס עד גדילי קולגן הם מומסים.
- פתרון קולגן סינון סטרילי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
- לדלל את מניות 01:10 קולגן המסוננים במים ללא יונים. המניה מדוללת זה conce עובדפתרון ntration למשטחי פלסטיק ציפוי וקרום.
- פלסטיק מעיל קולגן, משטחי זכוכית וקרום לשעה 2 ב RT על 37 מעלות צלזיוס, או O / N ב 2-8 מעלות צלזיוס.
- להסיר את הנוזלים עודפים מהמשטח המצופה, ולאפשר לו להתייבש O / N.
- לשטוף עם מים סטריליים תרבות רקמות כיתה או HBSS לפני החדרת תאים ובינוני.
- hAECs הצלחת בצפיפות של 25,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום סרום ללא, ולאפשר התקשרות להתרחש עבור 72-96 שעות.
- בעקבות התקשרות, לשנות תקשורת על ידי aspirating בזהירות והחלפה עם נפח מתאים של מדיום סרום ללא כל 2-3 ימים.
- תאי מעבר באמצעות הפרוטוקול להלן
- תרבית תאי תקשורת לשאוב ולשטוף עם נפח 1x של HBSS סטרילי
- הוספת נפח 1x של האנזימטית לעכל פתרון דגירה של 5-15 דקות, או עד שתאים הם נצפו ניתוק ממשטח תרבית תאים.
- לאסוף האנזימטית לעכל תמיסה המכילה תאים, הבטחת ceLLS מנותקים ממשטח תרבית תאים על ידי pipetting האנזימטית שוב ושוב לעכל פתרון כנגד משטח תרבית תאים
- צנטריפוגה בXG 700 במשך 5 דקות.
- Resuspend התא גלולה בנפח מתאים של HBSS המכיל 1 מ"ג / מעכב אנזים מבוסס סויה מיליליטר. בעדינות פיפטה שוב ושוב עם פיפטה 1ml לקבל השעיה תא בודדת.
- הוסף בינוני סרום ללא לריכוז של כ 1 מיליון תאים / מיליליטר. לקבוע מספר תא ואת כדאיות באמצעות ספירה אוטומטית או ידנית עם הדרת trypan כחולה.
- hAECs הצלחת בצפיפות של 25,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום סרום ללא, ולהמשיך בשיטות סטנדרטי culturing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר הליך זה ואחריו בצורה נכונה, תשואה ממוצעת של 120 מ'hAECs צריכה להיות צפויה, עם מגוון טיפוסי של 80-160,000,000 תאים. מתשואות אלה, ניתן לצפות כדאיות ממוצעת של 83 ± 4%. הגידול בתשואה הממוצעת והכדאיות נמוכה במקצת בשיטה הקלינית יכולים להיות בגלל פעילות טריפסין גבוהה מהמוצר המופק מבעלי החיים, ואולי גם בשל היעדרם של חלבונים בסרום. יש לי hAECs המבודד פרופיל פני תא ממוצע של תאים חיוביים EpCAM 92% עם <תאים חיוביים סמן mesenchymal 1% CD90, CD105. סמנים אלה נבחרו בשל ייחודם ל24,25 וmesenchymal 26 שושלות אפיתל בהתאמה. תהליך זה יכול לקחת כ 4-5 שעות כדי להשלים (איור 1).
הקפאה דורשת 20-60 דקות בהתאם למספר של בקבוקונים ותשואת תא סופי. יש לנו נבדקו בעבר מגוון של מדיה הקפאה ומצאנוכי ללא מדיה מוצר רב של בעלי חיים לבצע כראוי, אולם ריכוז DMSO האופטימלי הוא כ 5-10%. בדרך כלל אפשר לצפות שלאחר ההפשרה-הכדאיות להיות 5-10% פחות מכדאיות מראש הקפאה, וההפסד הזה יכול להיות גדול יותר באופן משמעותי עבור המשתמשים חסרי ניסיון (איור 2).
תרבית תאים ניתן לבצע עם hAECs כדי לאפשר אפיון, בידול, או ספציפי אחרים בהליכי מבחנה. תאים אלה בתחילה לצרף למשטחי תאים עם יעילות של 50-80% (תצפית אישית). זה מגדיל ל70-90% עם קטעים שלאחר מכן. קובץ מצורף עשוי להיות מוגבר עם השימוש בחומרי ציפוי פני השטח כגון אני סוג קולגן, או מוצרים דומים. hAECs לשמור על הפנוטיפ האפיתל שלהם בתקשורת ותרבות חופשי בסרום (איור 3). מצאנו שינויים משמעותיים בפרופילי סמן תא שטח הבאים מעבר חוזר ונשנה. בנוסף, לאחר hAECs כ 5 מעברים יכול eithאה להגיע הזדקנות, או לעבור שינויים מורפולוגיים בקנה אחד עם אפיתל מעבר mesenchymal. לאחר מעבר חוזר ונשנה, hAECs לשמור קריוטיפ נורמלי, אורכי הטלומרים ארוכים והפצת מחזור התא. מאפיינים אלה מצביעים על סיכון נמוך לשינוי או tumorigenicity. בנוסף להחזקת נכסי רגולציה ואנטי דלקתיים חיסוניים, hAECs הוכח להיות multipotent מאוד במבחנת in vivo, הבחנה לנציג שושלות תאים של שלוש שכבות הנבט הראשוניות (איור 4).
איור 1:. תשואה צפויה תא, כדאיות וטהרה לפרוטוקול בידוד קליני תשואות תא דומים וכדאיות יכולים להיות מושגות באמצעות ריאגנטים חופשיים בעלי חי מוצר בהשוואה לשיטות המכיל מוצר סטנדרטיים בבעלי חיים. בידוד אופייני צריך להיות> EpCAM 90% ו- <CD90% 1 / CD105 חיוביתאים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:.. כדאיות הפשרת הודעה ואת חילוף חומרים לתקשורת הקפאה המכילה סרום והסרום ללא השוואה לFBS המכיל DMSO 10%, תקשורת הקפאה זמינה המסחרית של בעלי חיים ללא מוצר הראו יכולת קיום שלאחר הפשרה-דומה או מוגבר וחילוף חומרים אנא לחץ כאן ל להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: קובץ מצורף אופייני וצמיחת פרופיל של hAECs ברחוב ללא מוצא תא סרום ללא וסרום המכילture בינוני. תקשורת ותרבות ללא מוצר בעלי חיים הראתה קובץ מצורף מתאים תא, התפשטות, ותחזוקה של פנוטיפ אפיתל. עם זאת התפתחות נוספת של סרום ללא מדיה נדרשת על מנת להשיג תוצאות שווים לתקשורת סרום המכיל. ברים סולם מייצגים 500 מיקרומטר.
איור 4:. בידול multipotent של hAECs במעבר המוקדם, hAECs הוכח להתמיין לנציג שושלות תאים המרובים של שלוש שכבות הנבט העיקריות. שושלות אלה כוללות, אך אינם מוגבלים ל; נוירונים, תאי שיער ועור, אפיתל ריאות, cardiomyocytes, hepatocytes, תאי לבלב, osteocytes וadipocytes. (איור מותאם מ -27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם מספר פרמטרים קריטיים שיכול להשפיע באופן משמעותי בהצלחתה של מתודולוגיה זו. אחסון של השליה או amnion עד 3 שעות לפני הבידוד של hAECs עשוי להיות רצוי למטרות לוגיסטיים או תזמון, אולם מומלץ שרקמת מעובד בהקדם האפשרי. אם רקמה היא להיות מאוחסנת, מומלץ כי אחסון להתבצע הבא לנתיחה ושטיפה של קרום amnion. ניתן לאחסן amnion באנטיביוטיקת HBSS סטרילית המכילה על 4 מעלות צלזיוס, אולם כדאיות תא יכולות יפחתו עם זמן אחסון ממושך. אנחנו, ואחרים מצאנו השתנות בתשואת תא ואת הכדאיות, וכדי למזער את ההשתנות זו מומלץ השליה שנאספות מלידות טווח בריאים, נמסרו רצוי בניתוח קיסרי.
מצאנו כי הזיהום של קרום amnion עם תאי דם יגרום לעיכוב של פעילות אנזים וירידה בתשואת תא. לכןשלב קריטי בפרוטוקול הוא שטיפה יסודית של השליה וקרום amnion מומלץ. מומלץ רקמת amnion לשטוף עד להופעתה הלבנה / ברור, כדי למנוע עיכוב אנזים במורד הזרם. בידוד של אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאי האפיתל הוא חשוב לבדיקת שליטת אפיון ואיכות.
אם תשואות נמוכות, יכולת קיום או זיהום של תשואת התא עם תאי mesenchymal מתרחש יש כמה שינויים שניתן לבצע לפתרון בעיות. אם תשואות תא נמוכות, סביר להניח כי פעילות האנזימטית הייתה עצורה בשל דם או זיהום בדם. זה יכול להיפתר בצעדים יסודיים יותר ונוספים שטיפה ו / או חתיכות amnion דמו או מזוהמות השלכת. יכול גם להיות מוגבר זמן דגירה אנזים, אבל זה יכול להיות מזיק לכדאיויות תא. בירידה בניתן להימנע כדאיות או זיהום עם תאי mesenchymal ידי הפחתת הזמן לעכל. עם זאת, thiים עשוי גם להקטין את התשואה הכוללת של תאים. פעמים שנעו בין 30 דקות לשעה 2 יכולות לשמש לפרוטוקול זה. בימים אלה צריכים להיות מותאמים לטוהר תא רצוי ותשואה בסך הכל / כדאיות. מגבלה אחת של שיטה זו היא כי תשואת תא הגדלת או כדאיות יכולה לבוא על החשבון שני. בנוסף, רכיבי סרום ללא כרגע לא יעילים כמו של שמירה על כדאיות תא בעקבות חשיפה לפעילות האנזימטית.
תאים יכולים להיות cryopreserved ללא כל ירידה משמעותית בכדאיויות תא או הפסד של חילוף חומרים על ידי אחסון במערכת חנקן נוזלי בטמפרטורה מבוקרת. זה יכול לנוע בין מכשיר הקפאה מלא isopropanol פשוטה למערכת ממלכתית-of-the-אמנות הקפאת קצב מבוקרת. למיטב ידיעתנו, שיעור ההקפאה האופטימלי לhAECs במערכת זו עדיין לא נקבע, אך השיעור הסטנדרטי של 1 ° C תוצאות / min בתחזוקה המתאימה של כדאיות תא וחילוף חומרים שלאחר הפשרה. במהלך o ההפשרהf תאי cryopreserved, חשוב לשמור על זמן הפשרה למינימום כדי להפחית את החשיפה לתא DMSO. תאים עשויים לצרף ולהתרבות בקצב נמוך יותר בעקבות הקפאה והפשרה בהשוואה לתאי culturing מבודדים טרי.
ליישום קליני זה עשוי להיות רצוי לתאי תרבות כדי להגדיל את המספר הסלולרי שלך או לאפיון במורד הזרם ו / או במניפולציה חוץ גופית. קוראים צריכים להבין כיצד הספציפי שלהם במניפולצית מבחנה עשוי לשנות את המסלולים רגולטוריים מעורבים ביישום הקליני של תאים אלה. חקרנו שמדיום תרבות חיה נטול מוצר כגון EpiLife היה מתאים לתחזוקה והרחבת hAECs. עם זאת, הוא נדרש כדי לייעל את ריכוזי גורם הגדילה להשיג שיעורי צמיחה מוגברות לסוג תא כזה. הנושא של דבקות תא במהלך התרבות באמצעות מטריצת קולגן ציפוי אנושית, מגביר את יעילות הציפוי. עם זאת, בעקבות דואר ממושךxposure לעיכול אנזימטי יעילות הציפוי תהיה תת-אופטימלית.
לסיכום, פרוטוקול זה פותח כדי להקל על הבידוד והתרבות של תאים אנושיים amnion אפיתל (hAECs) באמצעות ריאגנטים ללא מוצר מן החי בהתאם לשיטות ייצור טובות הנוכחיות הנחיות (cGMP). יתרונה של שיטה זו בהשוואה לשיטות בידוד חלופיות, הוא שיכולים להיות מבודדים תאים אלה, המתאפיינים, cryopreserved ותרבותי ללא הסיכון של מסירת פתוגנים בעלי חיים מזיקים לבני אדם, תוך שמירה על תשואות מתאימות תא, viabilities ופוטנציאל צמיחה. לחוקרים עוברים ממחקרים בבעלי חיים פרה-קליניים לניסויים קליניים, מתודולוגיות אלה יאיצו מאוד אישור רגולטורים, להפחית סיכונים ולשפר את איכות אוכלוסיית התאים הטיפולית שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
