Introduction
Cellen afkomstig van perinatale bronnen, zoals de placenta, placentamembranen, navelstreng en vruchtwater zijn aandacht van wetenschappers en artsen aangetrokken als een potentiële bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. De reden voor deze belangstelling is dat deze celtypen bezitten allemaal een zekere mate van plasticiteit en immunomodulerende capaciteit 3, eigenschappen die essentieel zijn voor de mogelijke therapeutische toepassingen.
hAECs zijn een heterogene populatie epitheliale die kunnen worden ontleend term of premature amnion membraan 4, die een rijke potentiële bron van regeneratieve celmateriaal. De eigenschappen die hAECs aantrekkelijk als een cellulaire therapie te maken onder hun multipotentie, lage immunogeniciteit, en anti-inflammatoire eigenschappen. hAECs gevonden zeer multipotente zowel in vitro als in vivo kunnen differentiëren tot mesodermale lineages is (cardiomyocytes, myocytes, osteocyten, adipocyten), endodermale geslachten (pancreas cellen, levercellen, longcellen) en ectodermale geslachten (haar, huid, neurale cellen en astrocyten) 5-10.
Geruststellend, ondanks hun multipotent hAECs lijken niet beide vormen tumoren of bevorderen de ontwikkeling van tumoren in vivo. Verder hAECs zijn ook immuun bevoorrecht, uiten lage niveaus van klasse II menselijke leukocyten antigenen (HLAs) 8. Deze eigenschap waarschijnlijk ten grondslag vertrouwde afstoting omzeilen na allogene en xenogene transplantatie, zoals aangetoond in onderzoeken met immuuncompetente apen, konijnen, cavia's, ratten en varkens 11-13. hAECs geven krachtige immunomodulerende en immunosuppressieve eigenschappen en bieden daarmee belangrijke praktische voordelen voor potentiële klinische toepassingen in de auto-immuunziekte therapie. hAECs worden verondersteld immunomodulerende functie uit te oefenen op zowel het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. Ope van de mechanismen gesuggereerd is door de afscheiding van immunomodulerende factoren 14.
Momenteel houdt hAECs in preklinische dierlijke ziektemodellen omvatten de behandeling van een beroerte, multiple sclerose, leverziekte, diabetes en chronische en acute longziekten. Onderzoekers hebben interesse getoond in het gebruik hAECs om na een beroerte ontsteking van de hersenen te behandelen vanwege hun unieke eigenschappen. Er is bewijs dat hAECs de bloed-hersenbarrière, waar ze kunnen engraft kunnen oversteken, overleven voor maximaal 60 dagen, differentiëren in neuronen, ontsteking te verminderen en het bevorderen van de regeneratie van beschadigde centrale zenuwstelsel weefsel in diermodellen van neurologische aandoeningen 15.
hAECs bieden de mogelijkheid te richten en reverse meerdere pathologische trajecten die bijdragen aan de ontwikkeling en progressie van multiple sclerose. Bijvoorbeeld, het gevolg is van preklinische dierstudies suggereren dat hAECs sterk immunosuppressieve enkan mogelijk perifere immuun tolerantie induceren en achteruit lopend ontstekingsreacties. hAECs hebben ook aangetoond dat het vermogen om te differentiëren tot neurale cellen in vivo en versterken endogene neuroregeneratie door de afscheiding van een breed scala van neurotrofe factoren 16 hebben.
Menselijke en knaagdieren amnion epitheelcellen hebben hun therapeutische werkzaamheid aangetoond voor de behandeling van leverziekte bij diermodellen. In een tetrachloorkoolstof schade inductie model van leverziekte, HAEC transplantatie leiden tot innesteling van levensvatbare hAECs in de lever, gepaard met verminderde hepatocyt apoptose en verminderde hepatische inflammatie en fibrose 17.
hAECs kunnen worden gestimuleerd om uitgedrukt alvleesklier factoren, waaronder insuline en glucose-transporters. Verschillende studies hebben het potentieel onderzocht voor hAECs om de bloedsuikerspiegel te herstellen in diabetische muizen 18. In muizen diehAECs zowel dierlijk lichaamsgewicht en bloedsuikerspiegel daalde tot normale niveaus na injectie van cellen. Deze studies vormen een krachtig argument voor het gebruik van hAECs voor de behandeling van diabetes mellitus.
hAECs een bewezen rol bij het voorkomen en herstellen van experimentele acute en chronische longschade in zowel volwassen en neonatale modellen 19. Deze studies gevonden dat hAECs differentiëren in vitro in functionele longepitheelcellen expressie meerdere long geassocieerde eiwitten, waaronder Cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), het ionkanaal dat mutaties in patiënten met cystische fibrose 20. Bovendien, wanneer hAECs worden geleverd aan de gewonde volwassen en neonatale long-, ze oefenen hun herstellende effecten via de modulatie van gastheer immuuncellen, het verminderen van pulmonale leukocyten werving, waaronder neutrofielen, macrofagen en lymfocyten 21-23.
Gezien hun overvloed,veiligheid record, en bewezen klinische toepassingen voor meerdere ziekten, klinische studies met behulp van hAECs is onvermijdelijk. Met als doel het versnellen van de vertaling van HAEC therapieën in de klinische-trials, ontwikkelden we methoden om te isoleren, cryopreserve en cultuur hAECs op een wijze die geschikt is voor klinische studies, met behulp van dierlijk product-vrije reagentia in overeenstemming met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) richtlijnen .
Dit protocol is gebaseerd een eerder gepubliceerde protocol dat we met succes werden gebruikt om hAECs te isoleren met behulp van dierlijke reagentia 6. We veranderde de oorspronkelijke protocol om dierlijke producten te vervangen door dierlijk product-vrije reagentia, en de daaropvolgende optimalisatie werd uitgevoerd om celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid te optimaliseren. Ons doel was om een protocol dat zou voldoen aan de wettelijke normen voor mobiele productie voor menselijke klinische proeven te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: placenta moet worden verzameld van singleton gezonde zwangerschappen, met een voorkeur voor de term electieve keizersneden. Geschreven, moet toestemming worden gegeven voor het verzamelen van de placenta. Uw relevante menselijke ethische toetsingscommissie moet goedkeuring hele verzameling en het gebruik van menselijke weefsels.
1. Isolatie van Amnion epitheelcellen
- Leg de placenta op een steriel oppervlak binnen een klasse II bioveiligheidskast.
- Met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), wassen zoveel mogelijk bloed uit de placenta oppervlak en membranen.
- Met de placenta geplaatst met de navelstreng omhoog mechanisch scheiden de buitenrand van het amnion en chorion membranen.
- Eenmaal gescheiden, handmatig amnion membraan strippen van het chorion membraan van de placenta, werken rond de rand van het membraan, naar de navelstreng.
LET OP: Wees careful om alle stukken van vervuilende chorion membraan van het amnion te verwijderen. - Met behulp van een steriele schaar, knip de amnion membraan ongeveer 2 cm vanaf de basis van de navelstreng en plaats in een 500 ml verzegelde container met 250 ml HBSS.
- Grondig wassen door het schudden van de verzegelde fles met het amnion membraan.
- Verwijder de amnion membraan uit de collectie container met behulp van een steriel pincet, en plaats in een 15 cm petrischaal.
- Snijd de amnion membraan in stukken van ongeveer 5 cm lang (als verticaal wordt gehouden met een pincet), waarbij bloederige of gescheurde stukken.
- Plaats in een 500 ml verzegelde container en wassen met 250 ml HBSS ongeveer 3-5 keer of totdat de amnion membraan wordt doorzichtig zonder vervuilende bloed.
OPMERKING: Als er bloed aanwezig is kan de efficiëntie van de enzymatische verminderen verteren oplossing. - Transfer alle stukken van amnion membraan in een container met 50 ml van de enzymatische verteren oplossing, en zorg ervoor datminimaliseren overdracht van HBSS.
- Incubeer de amnion stukken op enzymatische vertering oplossing in een waterbad of warme kamer bij 37 ° C gedurende 15 minuten onder zacht schudden om alle resterende bloed te verwijderen.
- Verwijder de amnion membraan stukken uit de enzymatische verteren oplossing in een nieuwe steriele container.
- Voeg 100 ml vers enzymatische verteren oplossing voor het amnion membraan en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten in een waterbad of een warme kamer met zacht schudden (eerste spijsvertering).
- Verwijder de amnion membraan stukken en plaats in de nieuwe container verzorgen zodat de enzymatische verteren oplossing kan afvloeien van elk stuk membraan.
Opmerking: Dit kan worden bereikt door te slepen amnion stukken langs de binnenrand van de houder. - Voeg 100 ml vers enzymatische verteren oplossing voor het amnion membraan stukken en incubeer 60 minuten in een waterbad of een warme kamer bij 37 ° C onder zacht schudden (tweede spijsvertering).
- Passeer de cel suspensiverder vanaf stap 1.14 door een 70 urn filter en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in 4 ml HBSS dat 1 mg / ml soja gebaseerde remmer. Voorzichtig pipet herhaaldelijk met een pipet 1 ml om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
Opmerking: In dit stadium kunnen de cellen worden op ijs gelaten totdat de cellen van de tweede digest zijn in hetzelfde stadium van bewerking. - Verwijder de amnion membraan stukken en plaats in de nieuwe container verzorgen zodat de enzymatische verteren oplossing kan afvloeien van elk stuk membraan.
Opmerking: Dit kan worden bereikt door te slepen amnion stukken langs de binnenrand van de houder. - Leid de celsuspensie uit stap 1.18 door een 70 urn filter en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 10 min.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in 4 ml HBSS dat 1 mg / ml soja gebaseerde remmer. Zachtjes pipet herhaaldelijk met een 1 ml pipette een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Pool cellen van de twee verteert of als alternatief te houden cel verteert gescheiden tot na-tellingen.
LET OP: Dit voorkomt het mengen van potentieel lage levensvatbaarheid van cellen met hoge levensvatbaarheid cellen. - Voeg HBSS tot een eindvolume van 10-20 ml en uitvoeren celtellingen met trypan blauw levensvatbaarheid meten.
- Bevestig de epitheelcellen fenotype door flowcytometrie. Vul geschikte antilichaam cocktail met anti-EpCAM-PE (1: 2 verdunning) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) en anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS.
- Resuspendeer een subset van cellen van een of beide digesten in het antilichaam cocktail in een concentratie van 25 x 10 6 cellen / ml.
- Voor flowcytometrie, beits 1 x 10 6 cellen met antilichaam cocktails met isotypecontroles (bijv. IgG 1 isotypecontrole-PE + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Houd ~ 1 x 10 6 cellen ongekleurd voor doorstroomcytometer set-up.
- Incubeer cellen in antilichaamcocktails bij 4 ° C gedurende 60 min.
- Was de cellen 3x in HBSS en resuspendeer in 5-10.000.000 cellen per ml voor flowcytometrie.
- Voeren flowcytometrie en noot resultaten. De zuiverheid van de cel isolaat (het percentage positieve EpCAM en CD90 / CD105 negatieve cellen) zou 90-95% en <1% respectievelijk.
- Vernietiging van een geschikt aantal cellen voor het testen voor een passende kwaliteitscontrole of vrijlating criteria zoals bepaald door de uiteindelijke toepassing.
LET OP: Dit kan onder meer de ziekte / virale screening, of andere veiligheid of biologische criteria. - Voor de resterende cellen, volg de cryopreservatieprotocol, of als alternatief te plaatsen rechtstreeks in de cultuur (direct naar de cultuur stap 3.6).
2. cryopreservatie van hAECs
- Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid behulp van flowcytometrie gegevens of handmatige telling met trypanblauwexclusie.
- Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer cels in de klasse 1-10 miljoen cellen per ml in dierlijk product-vrije cryopreservatie media.
- Pipetteer een geschikte hoeveelheid van cellen in O-ringen cryopreservatie flacons en plaats in een geregelde snelheid invriesapparaat wanneer afkoeling plaatsvindt bij ongeveer 1 ° C / min tot -80 ° C wordt bereikt.
- Transfer flacons in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
3. Ontdooien en Cultuur van Cyropreserved hAECs
- Verwijder cryopreservatie flacons uit vloeibare stikstof en plaats op ijs.
OPMERKING: Voor de overdracht alleen - ga snel naar de volgende stap. - Ontdooi de cryopreservatie flesjes snel bij 37 ° C totdat er slechts een klein stukje (~ 5 mm x 5 mm) ijs blijft.
Opmerking: Het is belangrijk dat de celoplossing niet warm in de cryopreservatie media de toxische effecten van DMSO verminderen. - Verdun cryopreservatie medium 10-voudig met koude (~ 4 ° C) serumvrij medium, druppelsgewijs toegevoegd in een geschikte grootted buis of container.
- Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Resuspendeer in serumvrij medium, met een geschatte concentratie van 1 miljoen cellen per ml. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van geautomatiseerde of handmatige telling met trypanblauwexclusie. Verwachte levensvatbaarheid post-dooi zal 5-10% minder dan vooraf cryopreservatie levensvatbaarheid zijn.
- Plaat cellen op standaard celcultuur behandeld plastic waren, of als alternatief te gebruiken type I collageen om de vacht van cultuur oppervlakken.
- Type I collageen coating volg onderstaande protocol
- Bereid zuur oplosbaar type I collageen uit humane placenta (15 mg collageen met 25 ml gedeïoniseerd water en 50 ul ijsazijn).
- Dek bekerglas met Parafilm en roer matig bij 37 ° C totdat collageenvezels worden opgelost.
- Filtreer steriel collageenoplossing met een 0,22 urn filter.
- Verdun de gefilterde collageen voorraad 01:10 met gedemineraliseerd water. Deze verdunde voorraad is de werkende concentration oplossing voor het coaten van kunststof en membraanoppervlakken.
- Collageen laag plastic, glas en membraanoppervlakken 2 uur bij kamertemperatuur bij 37 ° C of O / N bij 2-8 ° C.
- Verwijder overtollig vocht uit het gecoate oppervlak, en laat ze drogen O / N.
- Spoelen met steriele weefselkweek kwaliteit water of HBSS vóór de invoering van de cellen en medium.
- Plate hAECs bij een dichtheid van 25.000 cellen / cm2 in serumvrij medium, en laat bevestiging optreden 72-96 uur.
- Na bevestiging, veranderen media door voorzichtig opzuigen en vervangen met een geschikt volume van serumvrij medium elke 2-3 dagen.
- Passage cellen met behulp van de onderstaande protocol
- Zuig celcultuurmedia en wassen met 1x volume van steriele HBSS
- Voeg 1x volume enzymatische analyseoplossing en incubeer gedurende 5-15 min of totdat cellen waargenomen loskomen van de celkweek oppervlak.
- Verzamel enzymatische verteren oplossing bevattende cellen, zorgen cells worden losgemaakt van de celkweek oppervlak door herhaaldelijk pipetteren de enzymatische analyseoplossing tegen de celkweek oppervlak
- Centrifugeer bij 700 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de celpellet in een geschikt volume van HBSS dat 1 mg / ml soja gebaseerde remmer. Voorzichtig pipet herhaaldelijk met een 1 ml pipet om een enkele celsuspensie te verkrijgen.
- Voeg serumvrij medium tot een concentratie van ongeveer 1.000.000 cellen / ml. Bepaal het aantal cellen en de levensvatbaarheid met behulp van geautomatiseerde of handmatige telling met trypanblauwexclusie.
- Plate hAECs bij een dichtheid van 25.000 cellen / cm2 in serumvrij medium, en verder met standaard kweekmethoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wanneer deze procedure correct wordt nageleefd, moet een gemiddelde opbrengst van 120 miljoen hAECs worden verwacht, met een typische reeks 80-160,000,000 cellen. Uit deze rendementen kan een gemiddelde levensvatbaarheid van 83 ± 4% worden verwacht. De toegenomen gemiddelde opbrengst en iets lager levensvatbaarheid klinische methode kan door hogere trypsine activiteit dan de dierlijke producten, en misschien ook door het ontbreken van serumeiwitten. Geïsoleerde hAECs hebben een gemiddelde celoppervlak profiel van 92% EpCAM positieve cellen met <1% CD90, CD105 mesenchymale marker positieve cellen. Deze merkers werden geselecteerd vanwege hun specificiteit voor epitheliale en mesenchymale 24,25 26 lineages respectievelijk. Dit proces kan ongeveer 4-5 uur duren (Figuur 1).
Cryopreservatie nodig 20-60 min, afhankelijk van het aantal flacons en laatste cel opbrengst. We hebben eerder getest een reeks van cryopreservatie media en gevondendat veel dieren productvrij media uitvoeren geschikt, maar de optimale DMSO concentratie ongeveer 5-10%. Meestal kan men verwachten dat de levensvatbaarheid na ontdooiing 5-10% minder dan voor de cryopreservatie levensvatbaarheid, en dit verlies kan significant groter voor de onervaren gebruiker (figuur 2) zijn.
Celkweek kan worden uitgevoerd met hAECs karakterisering, differentiatie, of andere specifieke in vitro procedures mogelijk. Deze cellen aanvankelijk hechten aan celoppervlakken met een efficiëntie van 50-80% (persoonlijke waarneming). Dit verhoogt tot 70-90% latere passages. Attachment kan worden verhoogd door het gebruik van oppervlakte deklaag materialen zoals collageen type I of soortgelijke producten. hAECs behouden hun epitheliaal fenotype in serumvrij kweekmedium (figuur 3). We hebben belangrijke veranderingen in celoppervlaktemerker profielen na herhaalde passage gevonden. Bovendien, na ongeveer 5 passages hAECs kan eitheh bereiken veroudering, of ga door middel van morfologische veranderingen in overeenstemming met epitheliale naar mesenchymale transitie. Na herhaalde passage, hAECs handhaven van een normaal karyotype, lange telomeren lengtes en celcyclus distributie. Deze eigenschappen wijzen op een laag risico van transformatie of tumorgeniciteit. Naast het bezitten immuunregulerende en anti-inflammatoire eigenschappen hebben hAECs aangetoond zeer multipotente in vitro en in vivo, differentiëren in cellijnen vertegenwoordiger van de drie primaire kiemlagen (figuur 4).
Figuur 1:. Verwachte celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid klinische isolatieprotocol dezelfde cel opbrengst en levensvatbaarheid kan worden bereikt met dierlijk product vrij reagentia vergelijking met standaard dierlijk product bevattende methoden. Een typische isolatie moet> 90% EpCAM en <1% CD90 / CD105 positiefcellen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:.. Bericht dooi levensvatbaarheid en metabolisme voor serumhoudend en serum-vrij cryopreservatie media Vergeleken met FBS met 10% DMSO, commercieel beschikbare dierlijk product-vrije cryopreservatie media toonde vergelijkbare of hogere levensvatbaarheid en metabolisme na de dooi Klik hier om bekijk een grotere versie van deze figuur.
Figuur 3: Typische aanhechting en groei profiel van hAECs in serum-vrij en serumhoudend cel cultuur medium. Animal-product gratis voedingsbodems toonde geschikte cel gehechtheid, proliferatie, en het onderhoud van epitheliale fenotype. Maar verdere ontwikkeling van serumvrij medium moet gelijk resultaten serumbevattende media bereiken. Schaalbalken vertegenwoordigen 500 urn.
Figuur 4:. Multipotent differentiatie van hAECs Op vroege passage, hAECs is aangetoond differentiëren in meerdere cellijnen vertegenwoordiger van de drie primaire kiembladen. Deze lijnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot; neuronen, haar en huid cellen, longepitheel, hartspiercellen, hepatocyten, pancreas cellen, osteocyten en adipocyten. (Figuur aangepast van 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn een aantal kritische parameters die een aanzienlijke invloed op het succes van deze methode kan hebben. Opslag van de placenta of amnion tot 3 uur voor isolatie van hAECs wenselijk logistieke planning of doeleinden, maar het wordt aanbevolen dat de weefsels zo snel mogelijk verwerkt. Als weefsel moet worden opgeslagen, is het raadzaam dat de opslag worden uitgevoerd na dissectie en wassen van de amnion membraan. Amnion kunnen worden opgeslagen in steriele HBSS dat antibiotica bij 4 ° C, maar cellevensvatbaarheid kan afnemen met verlengde opslagtijd. Wij, en anderen hebben variabiliteit in cel opbrengst en levensvatbaarheid gevonden, en om deze variabiliteit is het aanbevolen dat de placenta worden verzameld van gezonde termijn geboorten, bij voorkeur geleverd door keizersnede te minimaliseren.
We vonden dat verontreiniging van het amnion membraan met bloedcellen resulteert in remming van enzymactiviteit en een vermindering in cel opbrengst. DaaromEen kritische stap in het protocol grondig wassen van de placenta en de amnion membraan aanbevolen. Het wordt aanbevolen dat de muisamnion gewassen worden totdat het er wit / helder aan downstream enzymremming voorkomen. Isolatie van een relatief homogene populatie van epitheliale cellen is belangrijk voor karakterisering en kwaliteitscontrole.
Indien lage opbrengsten, levensvatbaarheid of vervuiling van de cel opbrengst met mesenchymale cellen duurt er verschillende modificaties die voor probleemoplossing kan worden uitgevoerd. Als cel opbrengst laag is, is het waarschijnlijk dat enzymatische activiteit werd geremd door bloed of serum verontreiniging. Dit kan worden opgelost met een meer grondige en extra stappen te wassen en / of zich ontdoen van bloederige of verontreinigd amnion stukken. Enzyme incubatietijd kan ook worden verhoogd, maar schadelijk voor cellevensvatbaarheid zijn. Verminderde levensvatbaarheid of verontreiniging met mesenchymale cellen kan worden voorkomen door het verminderen van de digest tijd. Echter, this mag de totale opbrengst aan cellen verminderen. Tijden van 30 min tot 2 uur kan worden gebruikt voor dit protocol. Deze tijden moeten worden geoptimaliseerd voor gewenste cel zuiverheid en totale opbrengst / levensvatbaarheid. Een beperking van deze techniek is dat het verhogen celopbrengst of levensvatbaarheid kunnen ten koste van elkaar. Daarnaast serumvrije componenten zijn nog niet zo effectief handhaven cellevensvatbaarheid na blootstelling aan enzymatische activiteit.
Cellen kunnen gecryopreserveerde zijn zonder al te grote daling van de levensvatbaarheid of het verlies van de stofwisseling cel door opslag in een temperatuur gecontroleerde vloeibare stikstof-systeem. Dit kan variëren van een eenvoudige isopropanol gevuld cryopreservatie inrichting een systeem state of the art geregelde snelheid invriezen. Voor zover wij weten, is de optimale vriessnelheid voor hAECs in dit systeem niet bepaald, maar de standaard snelheid van 1 ° C / min resultaten in geschikte handhaving van cellevensvatbaarheid en na ontdooien metabolisme. Tijdens het ontdooien of gecryopreserveerde cellen, is het belangrijk om te ontdooien tijd tot een minimum te beperken tot cel blootstelling aan DMSO verminderen. Cellen kunnen hechten en verspreiden tegen een lager tarief na cryopreservatie en ontdooien in vergelijking met het kweken van vers geïsoleerde cellen.
Voor klinische toepassing kan het gewenst zijn om kweek cellen om het aantal cellen of stroomafwaartse karakterisering en / of in vitro manipulatie verhogen. Lezers moeten begrijpen hoe de specifieke in vitro manipulatie de regulerende routes betrokken bij de klinische toepassing van deze cellen veranderen. We hebben onderzocht dat een dier-product vrij kweekmedium, zoals EpiLife geschikt was voor het onderhoud en de uitbreiding van hAECs. Het is echter vereist om de groeifactor concentraties optimaliseren verhoogde groeisnelheden dergelijke celtype bereiken. De kwestie van de cel volgen ervan tijdens de cultuur door het gebruik van een humaan collageen-coating matrix, verhoogt de plating efficiëntie. Echter, na langdurige eXposure om enzymatische afbraak van de plating efficiëntie zal sub-optimaal zijn.
Samengevat is dit protocol is ontwikkeld om de isolatie en kweek van menselijke amnion epitheelcellen (hAECs) met behulp van dierlijk product-vrije reagentia in overeenstemming met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP) richtlijnen te vergemakkelijken. Het voordeel van deze methode ten opzichte van andere isolatiemethoden, is dat deze cellen kunnen worden geïsoleerd, gekarakteriseerd gecryopreserveerd en gekweekt zonder het risico van het leveren potentieel schadelijke dierlijke pathogenen voor de mens, met behoud geschikte cel opbrengsten levensvatbaarheid en groeipotentieel. Voor onderzoekers die zich bewegen van preklinische dierstudies aan klinische studies, zullen deze methodieken enorm versnellen wettelijke goedkeuring, risico's te verminderen en verbeteren van de kwaliteit van hun therapeutische cel populatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
