We beschrijven een protocol om humane amnion-epitheelcellen (hAEC's) te isoleren en te kweken met behulp van dierlijk productvrije reagentia in overeenstemming met de richtlijnen voor goede fabricagepraktijken (cGMP).
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, cryopreservatie en cultuur van de mens Amnion epitheelcellen voor klinische toepassingen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Epifysaire cellen uit het menselijke amnion (hAECs) die zijn afgeleid van term of pre-term amnionmembranen hebben de aandacht getrokken van onderzoekers en clinici als een potentiële bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde. De reden voor deze interesse is het bewijs dat deze cellen een zeer multipotent differentiatie-vermogen, lage immunogeniciteit en ontstekingsremmende functies hebben. Deze eigenschappen hebben onderzoekers ertoe aangezet om het potentieel van hAECs te onderzoeken voor het behandelen van een verscheidenheid aan ziekten en aandoeningen in preklinische dierstudies met veel succes.
hAECs hebben een brede toepassing gevonden voor de behandeling van een reeks ziekten en aandoeningen. Potentiële klinische toepassingen van hAECs omvatten de behandeling van beroerte, multiple sclerose, leverziekte, diabetes en chronische en acute longziekten. Het doorgaan van preklinische dierstudies naar klinische onderzoeken vereist een hogere standaard van kwaliteitscontrole en veiligheid voor celtherapieproducten. Voor veiligheid en kwaliteitscontrole is het de voorkeur dat celisolatieprotocollen dierproefvrije reagentia gebruiken.
We hebben protocollen ontwikkeld om onderzoekers in staat te stellen hAECs te isoleren, cryobewaren en te kweken met behulp van dierproefvrije reagentia. Het voordeel van deze methode is dat deze cellen kunnen worden geïsoleerd, gekarakteriseerd, cryobewaard en gekweekt zonder het risico om potentieel schadelijke dierlijke pathogenen aan mensen te leveren, terwijl geschikte celopbrengsten, levensvatbaarheden en groeipotentieel worden gehandhaafd. Voor onderzoekers die overgaan van preklinische dierstudies naar klinische onderzoeken, zullen deze methodologieën de snellere goedkeuring door de regelgevende instanties aanzienlijk versnellen, de risico's verminderen en de kwaliteit van hun therapeutische celpopulatie verbeteren.
Inleiding
Cellen afkomstig van perinatale bronnen, zoals de placenta, placentamembranen, navelstreng en vruchtwater zijn aandacht van wetenschappers en artsen aangetrokken als een potentiële bron van cellen voor regeneratieve geneeskunde 1,2. De reden voor deze belangstelling is dat deze celtypen bezitten allemaal een zekere mate van plasticiteit en immunomodulerende capaciteit 3, eigenschappen die essentieel zijn voor de mogelijke therapeutische toepassingen.
hAECs zijn een heterogene populatie epitheliale die kunnen worden ontleend term of premature amnion membraan 4, die een rijke potentiële bron van regeneratiev....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: placenta moet worden verzameld van singleton gezonde zwangerschappen, met een voorkeur voor de term electieve keizersneden. Geschreven, moet toestemming worden gegeven voor het verzamelen van de placenta. Uw relevante menselijke ethische toetsingscommissie moet goedkeuring hele verzameling en het gebruik van menselijke weefsels.
1. Isolatie van Amnion epitheelcellen
- Leg de placenta op een steriel oppervlak binnen een klasse II bioveiligheidskast.
- Met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), wassen zoveel mogelijk bloed uit de placenta oppervlak en membranen.
- Me....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Wanneer deze procedure correct wordt nageleefd, moet een gemiddelde opbrengst van 120 miljoen hAECs worden verwacht, met een typische reeks 80-160,000,000 cellen. Uit deze rendementen kan een gemiddelde levensvatbaarheid van 83 ± 4% worden verwacht. De toegenomen gemiddelde opbrengst en iets lager levensvatbaarheid klinische methode kan door hogere trypsine activiteit dan de dierlijke producten, en misschien ook door het ontbreken van serumeiwitten. Geïsoleerde hAECs hebben een gemiddelde celoppervlak profiel van 92% Ep.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn een aantal kritische parameters die een aanzienlijke invloed op het succes van deze methode kan hebben. Opslag van de placenta of amnion tot 3 uur voor isolatie van hAECs wenselijk logistieke planning of doeleinden, maar het wordt aanbevolen dat de weefsels zo snel mogelijk verwerkt. Als weefsel moet worden opgeslagen, is het raadzaam dat de opslag worden uitgevoerd na dissectie en wassen van de amnion membraan. Amnion kunnen worden opgeslagen in steriele HBSS dat antibiotica bij 4 ° C, maar cellevensvatbaarheid.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs erkennen de financiële steun van het Operational Infrastructure Support Program van de regering van Victoria.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Collectiekit | |||
| Schilladebakje | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressingtang, puntig 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Schaar - Scherp/Blunt Rechtstreeks | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Steriele latexhandschoenen | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Beschermende kleding | |||
| Beschermende kleding (jas) | U-line | S-15374-M | |
| Isolatiejazen | U-line | S-15374-M | |
| Steriele latexhandschoenen | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Gebruiksmasker | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnetjes | Medline | CRI1001 | |
| Schoenovertrekken | U-line | S-7873W | |
| Media en reagentia | |||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | zonder calcium of magnesium |
| TrypZean (dierlijk product-vrij recombinant trypsine) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Sojaboon Trypsine Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blauw reagens | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collageen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Verbruiksartikelen | |||
| 50 ml graduele pipet | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduele pipet | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduele pipet | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml Falcon buizen | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml Falcon buizen | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri schotels | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipetpunten | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipetpunten | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Spuit | BD/Medical | 309661 | |
| Kunststof spatel | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Kunststof weegschaal | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Apparatuur | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biogevaarkas |
Referenties
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
