Introduction
Клетки, полученные из перинатальных источников, таких как плаценты, плацентарная мембран, пуповины и околоплодных вод привлекают внимание исследователей и клиницистов в качестве потенциального источника клеток для регенеративной медицины 1,2. Причина этого интереса является то, что эти типы клеток все обладают некоторой степени пластичности и иммуномодулирующим возможности 3, свойств, которые имеют основополагающее значение для их потенциальных терапевтических применений.
hAECs представляют собой гетерогенную эпителиальных населения, которые могут быть получены из термина или досрочного амниона мембраны 4, обеспечивая богатый потенциальный источник регенеративной клеточного материала. Свойства, которые делают hAECs привлекательными как клеточной терапии включают их мультипотентность, низкой иммуногенностью и противовоспалительными свойствами. hAECs Было обнаружено, что весьма мультипотентных как в пробирке и в естественных условиях, способны дифференцироваться в мезодермальных линий (cardiomyocytes, миоциты, остеоцитов, адипоциты), энтодермальные клоны (клеток поджелудочной железы, печени, клетки легких) и эктодермальные линий (волосы, кожа, нервных клеток и астроцитов) 5-10.
Обнадеживает, несмотря на их мультипотентность hAECs, кажется, не ни опухолей форме или способствовать развитию опухоли в естественных условиях. Кроме того, hAECs также иммунопривилегированных, выражая низкие уровни класса II антигенов лейкоцитов человека (HLAs) 8. Это свойство, вероятно лежит в основе их способности уклоняться от иммунного отторжения после аллогенной и ксеногенной трансплантации, как показано в исследованиях с использованием иммунных компетентных обезьян, кроликов, морских свинок, крыс и свиней 11-13. hAECs отображения мощным иммуномодулирующим и иммуносупрессивных свойств и, таким образом, имеют значительные практические преимущества для потенциальных клинических применений в аутоиммунного терапии заболевания. hAECs, как полагают, оказывают иммуномодулирующее функции на врожденных и адаптивных систем застрахован. Нае механизмов, предложенных, через секрецию иммуномодулирующих факторов 14.
Текущие приложения hAECs в моделях доклинических заболеваний животных включают лечение инсульта, рассеянного склероза, болезни печени, сахарный диабет и хронические и острые заболевания легких. Исследователи показали, заинтересованность в использовании hAECs для лечения воспаления мозга после инсульта из-за их уникальных свойств. Существует доказательство того, что hAECs может пересечь гематоэнцефалический барьер, где они могут привить, выживать в течение 60 дней, дифференцируются в нейроны, уменьшают воспаление и способствуют регенерации поврежденных центральной нервной системы ткани на животных моделях неврологических заболеваний 15.
hAECs предлагают возможность предназначаться и обратить вспять несколько патологических путей, которые способствуют развитию и прогрессированию рассеянного склероза. Например, результатом доклинических исследованиях на животных показывают, что hAECs сильно иммуносупрессивной ипотенциально может вызвать периферическую иммунную толерантность и обратного текущие воспалительные реакции. hAECs также было показано, что способность к дифференцировке в нервные клетки в естественных условиях и повышения эндогенного нейрорегенерации через секрецию огромный массив нейротрофических факторов 16.
Клетки эпителия человека и грызунов амниона уже продемонстрировали свою терапевтическую эффективность для лечения заболеваний печени на животных моделях. В четыреххлористого углерода индукции повреждения модели болезни печени, НАЕС трансплантации приводят к приживления жизнеспособных hAECs в печени, сопровождающихся пониженной апоптоза гепатоцитов и снижение печени воспаления и фиброза 17.
hAECs можно стимулировать с выраженными поджелудочной железы факторов, включая инсулина и глюкозы перевозчиков. Несколько исследований изучали потенциал для hAECs по восстановлению уровня глюкозы в крови в диабетических мышей 18. У мышей, получавшихhAECs, оба тела животного вес и уровень глюкозы в крови снизилось до нормальных уровней после инъекции клеток. Эти исследования дают веские основания для использования hAECs для лечения сахарного диабета.
hAECs есть доказанный роль в профилактике и ремонту экспериментальной острой и хронической травмы легких в взрослых и новорожденных моделей 19. Эти исследования показали, что hAECs дифференцировать в пробирке в функциональные легких эпителиальных клеток, экспрессирующих несколько легких ассоциированных белков, включая кистозный фиброз трансмембранной проводимости регулятора (CFTR), ионного канала, который мутировал у пациентов с кистозным фиброзом 20. Кроме того, при hAECs доставляются в поврежденной взрослых и новорожденных легких, они проявляют свое репаративные эффекты с помощью модуляции иммунного клеток, снижение легочной набора лейкоцитов, в том числе нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов 21-23.
Учитывая их численность,показатели безопасности и проверенных клинических приложений для нескольких заболеваний, клинические испытания с использованием hAECs неизбежна. С целью ускорения перевода НАЕС терапии в клиническую-исследований, мы разработали методы, чтобы изолировать, криоконсервируют и культуры hAECs в форме, приемлемой для клинических исследованиях с использованием продуктов без реагентов животных в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ) руководящих принципов ,
Мы основали этот протокол ранее опубликованная протокол, который мы использовали, чтобы успешно изолировать hAECs с использованием реагентов животного происхождения 6. Мы изменили первоначальный протокол, чтобы заменить продуктов животного происхождения с продуктом без реагентов животных и последующей оптимизации была проведена для оптимизации выхода клеток, жизнеспособности и чистоты. Наша цель в том, чтобы разработать протокол, который будет соответствовать нормативным стандартам для изготовления клеток для клинических испытаний на людях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Плацент должны быть собраны из одноэлементных здоровой беременности, с предпочтением долгосрочных плановое кесарево сечение. Письменное информированное согласие должно быть дано для сбора их плаценты. Ваш профильный комитет этике научных исследований человека должны утверждение всю коллекцию и использование человеческих тканей.
1. Выделение Амнион эпителиальных клеток
- Поместите плаценту на стерильной поверхности в пределах класса II кабинете биологической безопасности.
- Использование стерильных Хэнкс сбалансированный солевой раствор (HBSS), мыть столько крови, сколько возможно от поверхности плаценты и оболочек.
- С плаценты, размещенные в пуповина вверх, механически отделить внешний край амниона и хориона мембран.
- После отделения вручную полосы амнион мембраны из хориона оболочки плаценты, работающих вокруг края мембраны, к пуповины.
Примечание: carefул удалить все остатки загрязняющих хориона мембрану от амниона. - Использование стерильных ножниц, вырезать амнион мембраны примерно 2 см от основания пуповины и место в 500 мл герметичном контейнере, содержащий 250 мл HBSS.
- Тщательно вымыть, встряхивая запечатанный флакон, содержащий амнион мембраны.
- Удалить амнион мембраны из контейнера для сбора помощи стерильного пинцета, и места в 15 см чашки Петри.
- Вырезать амнион мембраны в куски длиной примерно 5 см (при вертикальном щипцами), отбрасывая кровавые или куски.
- Место в 500 мл герметичном контейнере и не мыться с 250 мл HBSS примерно в 3-5 раз или до тех пор, амнион мембраны становится прозрачным, без загрязняющего крови.
Примечание: Все присутствует в крови может снизить эффективность ферментативного переваривания раствора. - Передача все части амниона мембраны в контейнер, содержащий 50 мл ферментативной переварить решение, обращая внимание наминимизировать вынос HBSS.
- Инкубируйте амнион части в ферментативных переварить раствор в водяной бане или теплом помещении при температуре 37 ° С в течение 15 мин при осторожном перемешивании для удаления остатков крови.
- Удалить амнион мембраны отрывки из ферментативного переваривания решение и свое место в новой стерильный контейнер.
- Добавить 100 мл свежего ферментативных переварить решение амниона мембраны и инкубируют при 37 ° С в течение 60 мин на водяной бане или теплом помещении при осторожном встряхивании (первая пищеварения).
- Удалить амнион мембраны кусочки и поместить в новый помощи контейнер с захватом, чтобы ферментативный переварить решение для слива от каждой части мембраны.
Примечание: Это может быть достигнуто путем перетаскивания амниона части вдоль внутренней ободу емкости. - Добавить 100 мл свежего ферментативных переварить решение амнион мембраны кусочки и инкубировать 60 мин на водяной бане или теплом помещении при температуре 37 ° С при осторожном встряхивании (второй пищеварения).
- Пропустите клеток suspensiна шаге от 1,14 через фильтр 70 мкм и центрифуге при 1000 мкг в течение 10 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 4 мл HBSS, содержащего 1 мг / мл соевого основе ингибитор фермента. Осторожно пипетки раз с 1 мл пипетки, чтобы получить суспензии отдельных клеток.
Примечание: В этой стадии клетки можно оставить на льду до клетки из второго сборника не находятся на одной и той же стадии обработки. - Удалить амнион мембраны кусочки и поместить в новый помощи контейнер с захватом, чтобы ферментативный переварить решение для слива от каждой части мембраны.
Примечание: Это может быть достигнуто путем перетаскивания амниона части вдоль внутренней ободу емкости. - Проход клеточной суспензии со стадии 1,18 через фильтр 70 мкм и центрифуге при 1000 х г в течение 10 мин.
- Снимите и выбросьте супернатант, и ресуспендируют осадок клеток в 4 мл HBSS, содержащего 1 мг / мл соевого основе ингибитор фермента. Аккуратно пипетки несколько раз с 1 мл рipette, чтобы получить суспензии отдельных клеток.
- Бассейн клетки из двух сборников или, альтернативно, картинка на дайджесты не разделенные до окончания кровяных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это предотвращает смешивание потенциально низких жизнеспособность клеток с высоким жизнеспособность клеток. - Добавить HBSS до конечного объема 10-20 мл и выполнять подсчет клеток с использованием трипанового синего для измерения жизнеспособности.
- Подтверждение эпителиальный фенотип клеток методом проточной цитометрии. Макияж соответствующие антитела коктейли с использованием анти-EpCAM-PE (Разведение 1: 2) анти-CD90-PeCy5 (1: 250) и анти-CD105-APC (1: 100) в HBSS.
- Ресуспендируют подмножество ячеек от одного или обоих сборников в смесь антител в концентрации 25 х 10 6 клеток / мл.
- Для проточной цитометрии, пятно 1 х 10 6 клеток с коктейлями антител, содержащих элементы управления изотипа (например. Контрольно-PE IgG 1 изотип + анти-CD90-PeCy5 + анти-CD105-APC). Держите ~ 1 х 10 6 клеток неокрашенных для проточной цитометрии настройки.
- Инкубируйте клетки в антителакоктейли при 4 ° С в течение 60 мин.
- Промывают клетки 3 раза в HBSS и ресуспендируют в 5 до 10 миллионов клеток на мл для проточной цитометрии.
- Выполните проточной цитометрии и результаты нот. Чистоту клеток изолята (в процентах от ЕрСАМ положительной и CD90 / CD105 отрицательные клетки), как ожидается, будет 90-95% и <1% соответственно.
- Отложите подходящее количество клеток для тестирования соответствующих критериев контроля качества или выпуска в качестве определяется конечного применения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это может включать в себя болезнь / вирусной скрининг, или другие защитные элементы или биологических критериев. - Для остальных клеток, следовать протоколу криоконсервации, или, альтернативно, следует размещать непосредственно в культуру (прямой к культуре шагом 3,6).
2. Криоконсервация hAECs
- Определение количества клеток и жизнеспособности с помощью проточной цитометрии данных или ручного подсчета с трипанового синего.
- Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клетокс между 1-10 миллионов клеток на мл в продукции животноводства без криоконсервации СМИ.
- Пипетки подходящий объем клеток в O-кольцами криоконсервации флаконах и поместить в контролируемой скорости аппарата замерзания, когда охлаждение происходит при приблизительно 1 ° С / мин до -80 ° С достигается.
- Передача флаконов в жидкий азот для длительного хранения.
3. Размораживание и культура Cyropreserved hAECs
- Удалить криоконсервации флаконы из жидкого азота и поставить на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для передачи только - быстро переходите к следующему шагу. - не разморозить криоконсервации флаконы быстро при 37 & deg; С до тех пор, лишь небольшой части (~ 5 мм х 5 мм) из льда остается.
Примечание: Важно, чтобы раствор клеток не нагревается, чтобы уменьшить токсические эффекты ДМСО в криоконсервации сред. - Развести криоконсервации средствам массовой 10 раз холодным (~ 4 ° С) не содержащей сыворотки среде, добавляли по каплям в подходящего размерад трубки или контейнера.
- Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Ресуспендируют в бессывороточной среде, чтобы приблизительной концентрации 1000000 клеток на мл. Определение количества клеток и жизнеспособности с помощью автоматизированной или ручной подсчет с трипанового синего. Ожидаемая жизнеспособность после оттепели будут на 5-10% ниже, чем до криоконсервации жизнеспособности.
- Пластина клеток на стандартной клеточной культуры обработанных пластиковая посуда, или альтернативно использовать Тип I коллагена для покрытия культуры поверхности.
- Для типа I коллагена покрытием следовать протоколу ниже
- Подготовьте кислоты растворимы типа коллагена из плаценты человека (15 мг коллагена с 25 мл деионизированной воды и 50 мкл лед ной уксусной кислоты).
- Крышка стакан парафильмом и перемешивают умеренно при 37 ° С до тех пор, коллагеновые нити не растворятся.
- Стерильный фильтр раствора коллагена с помощью 0,22 мкм фильтра.
- Развести отфильтрованный коллагена запаса 1:10 деионизированной водой. Этот разбавленный акции работает Concentration решение для пластиковых покрытий и поверхностей мембран.
- Коллаген покрытие из пластика, стекла и поверхности мембраны в течение 2 ч при комнатной температуре при 37 ° С, или О / N при температуре 2-8 ° С.
- Удалить лишнюю жидкость из поверхности с покрытием, и дайте ему высохнуть O / N.
- Промыть стерильной культуры тканей класса водой или HBSS до введения клеток и среды.
- Пластинчатые hAECs при плотности 25000 клеток / см 2 в среде без сыворотки, и позволяют подключать происходить за 72-96 часов.
- После прикрепления, изменить носитель, тщательно аспирации и замене с подходящим объемом бессывороточной среды каждые 2-3 дня.
- Прохождение клетки, используя приведенную ниже протокол
- Вытяжку для культивирования клеток и промыть 1x объема стерильной HBSS
- Добавить 1x объем ферментативных переварить раствор и инкубируют в течение 5-15 мин или до тех пор, пока клетки не наблюдаются отсоединения от поверхности клеточной культуры.
- Сбор ферментативная переварить раствор, содержащий клетки, обеспечивая сезаполняет отделены от поверхности клеточной культуры путем многократного пипетки ферментативную переварить решение в отношении поверхности клеточной культуры
- Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин.
- Ресуспендируют осадок клеток в подходящем объеме HBSS, содержащем 1 мг / мл соевого основе ингибитор фермента. Осторожно пипетки раз с 1 мл пипетки, чтобы получить суспензии отдельных клеток.
- Добавить бессывороточной среды с приблизительной концентрацией 1000000 клеток / мл. Определение количества клеток и жизнеспособности с помощью автоматизированной или ручной подсчет с трипанового синего.
- Пластинчатые hAECs при плотности 25000 клеток / см 2 в среде без сыворотки, и по-прежнему с использованием стандартных методов культивирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда эта процедура выполняются правильно, средняя урожайность 120 млн hAECs и следовало ожидать, а типичный диапазон 80-160 миллионов клеток. Из этих выходов, средняя жизнеспособность 83 ± 4% можно ожидать. Увеличение среднего дохода и несколько ниже жизнеспособность в клинической метода может быть связано с более высокой активности трипсина, чем животного происхождения продукта, а также, возможно, из-за отсутствия сывороточных белков. Изолированные hAECs имеют средний профиль поверхности клеток 92% EpCAM позитивных клеток с <1% CD90, CD105 мезенхимальных маркеров положительных клеток. Эти маркеры были выбраны из-за их специфичности эпителиальных 24,25 и мезенхимальных 26 линий соответственно. Этот процесс может занять около 4-5 часов для завершения (рисунок 1).
Криоконсервации требуется 20-60 мин в зависимости от количества флаконов и конечным выходом клеток. Ранее мы протестировали ряд криоконсервации СМИ и обнаружили,Этот продукт среды, свободной от многих видов животных выполнять надлежащим образом, однако оптимальная концентрация ДМСО составляет примерно 5-10%. Обычно можно ожидать жизнеспособность после оттепели быть на 5-10% ниже, чем до криоконсервации жизнеспособности, и эта потеря может быть значительно больше для неопытного пользователя (Рисунок 2).
Клеточные культуры могут быть выполнены с hAECs для того, чтобы охарактеризовать, дифференцировки или другие специфические процедуры, в пробирке. Эти клетки изначально приложить к поверхности клеток с эффективностью 50-80% (личное наблюдение). Это увеличивает до 70-90% с последующими переходами. Приложение может быть увеличена с использованием материалов покрытия поверхности, например, коллагена типа I, или аналогичными продуктами. hAECs сохранить свою эпителиальных фенотип без сыворотки культуральной среде (рис 3). Мы нашли существенные изменения в клеточной поверхности профилей маркеров следующие повторном прохождении. Кроме того, примерно через 5 пассажей hAECs может eithэ достичь старение, или пройти через морфологические изменения в соответствии с эпителиальной к мезенхимальных перехода. После многократного прохождения, hAECs поддерживать нормальный кариотип, длинных теломер и распределения клеточного цикла. Эти свойства указывают на низкий риск трансформации или туморогенности. В дополнение к обладающих иммунные регуляторные и противовоспалительными свойствами, hAECs, как было показано, весьма мультипотентных в пробирке и в естественных условиях, дифференцироваться в клеточные клоны представителем трех первичных зародышевых листков (рис 4).
Рисунок 1:. Ожидаемое выход клеток, жизнеспособность и чистота по протоколу клинического изоляции Подобные выходы клеток и жизнеспособность может быть достигнуто с использованием животных-бесплатно товар реагентов по сравнению со стандартными, содержащих продукт методов животных. Типичный изоляция должна быть> 90% EpCAM и <1% CD90 / CD105 положительныйклетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:.. После размораживания жизнеспособность и метаболизм для сыворотки, содержащей и не содержащей сыворотки криоконсервации СМИ сравнению с FBS, содержащей 10% ДМСО, коммерчески доступный продукт без криоконсервации СМИ животных показали одинаковую или увеличение жизнеспособности после оттаивания и обмен веществ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Типичные привязанность и рост профиль hAECs в бессывороточной и содержащей сыворотку куль клетокры среды. Продукт свободной культуральные среды для животных показали крепление подходит клеток, пролиферации и поддержанию эпителиального фенотипа. Тем не менее дальнейшее развитие сыворотки среде требуется для достижения равных результатов в содержащей сыворотку средах. Шкала бары представляют 500 мкм.
Рисунок 4:. Мультипотентных дифференциация hAECs В начале прохода, hAECs было показано, дифференцироваться в несколько клеточных линий представителем трех первичных зародышевых листков. Эти клоны включают, но не ограничиваются ими; нейроны, волос и кожи клетки, легких эпителия, кардиомиоциты, гепатоциты, клетки поджелудочной железы, остеоцитами и адипоциты. (Рис адаптировано из 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько важных параметров, которые могут оказать значительное влияние на успех этой методологии. Хранение плаценты или амниона до 3 ч перед выделением hAECs может быть желательно для логистических или планирования целей, однако рекомендуется, чтобы ткань обрабатывают, как можно скорее. Если ткань должна быть сохранена, рекомендуется для хранения быть выполнены следующие рассечения и промывки мембраны амниона. Амнион можно хранить в стерильных HBSS, содержащих антибиотики при 4 ° С, однако жизнеспособность клеток можно уменьшить при длительного времени хранения. Мы и другие нашли изменчивость урожайности клеток и жизнеспособности, и свести к минимуму эту изменчивость, то рекомендуется плаценты у здоровых срочных родов, предпочтительно, предоставляемых кесарева сечения.
Мы обнаружили, что загрязнение амниона мембраны с клетками крови будет приводить к ингибированию активности фермента и снижению урожайности клеток. ПоэтомуВажным шагом в Киотском протоколе, тщательное мытье плаценты и амнион мембраны рекомендуется. Рекомендуется, чтобы амнион ткани мыть до тех пор, пока не появится белый / прозрачный, чтобы избежать вниз по течению торможение фермента. Выделение относительно однородной популяции клеток эпителия имеет важное значение для тестирования характеристик и качества управления.
Если происходит низкие урожаи, жизнеспособность или загрязнение выход клеток с мезенхимальных клеток есть несколько модификаций, которые могут быть выполнены для устранения неполадок. Если выходы клеток низки, вполне вероятно, что ферментативная активность ингибируется за счет крови или сыворотки загрязнения. Эту проблему можно решить с более тщательных и дополнительных стадий промывки и / или выбрасывание кровавых или загрязненных амниона штук. Фермент Инкубационный период может быть увеличен, но это может быть вредно для жизнеспособности клеток. Снижение жизнеспособности или загрязнение мезенхимных клеток можно избежать путем уменьшения времени дайджест. Тем не менее, Тхис также может снизить общий выход клеток. Времени от 30 мин до 2 ч могут быть использованы для этого протокола. Эти времена должны быть оптимизированы для желаемой чистоты клеток и общий выход / жизнеспособности. Одним из ограничений этого метода является то, что повышение выход клеток или жизнеспособность может происходить за счет друг друга. Кроме того, сыворотки, свободной компоненты в данный момент не так эффективны в поддержании жизнеспособности клеток после воздействия на них ферментативной активности.
Клетки могут подвергнуть криоконсервации без каких-либо серьезных снижению жизнеспособности или потери клеточного метаболизма путём хранения в регулируемой температурой системы жидкого азота. Это может варьироваться от простого изопропилового спирта заполненные криоконсервации устройства государственной системы оф-арт регулируемой скоростью замораживания. Насколько нам известно, оптимальная скорость замораживания в течение hAECs в этой системе не был определен, однако стандартная ставка 1 ° результатам C / мин в подходящем поддержания жизнеспособности клеток и пост-оттаивания метаболизма. Во время таяния ОF криоконсервированных клеток, важно сохранить время размораживания к минимуму, чтобы уменьшить воздействие клеток ДМСО. Клетки могут подключаться к размножаться при более низкой скорости после криоконсервации и оттаивания по сравнению с культивированием недавно изолированных клеток.
Для клинического применения может быть желательно, чтобы культура клетки для увеличения количества клеток или для последующей характеризации и / или в пробирке манипуляции. Читатели должны понять, как их удельный в пробирке манипуляции могут изменить нормативные путей, участвующих в клиническом применении этих клеток. Мы исследовали, что животное продукт без культуральной среды, такие как EpiLife подходит для поддержания и расширения hAECs. Тем не менее, необходимо оптимизировать концентрации фактора роста для достижения повышенные темпы роста такого типа клеток. Вопрос о соблюдении клеток в процессе культивирования с использованием человеческого матрицу коллагена покрытия, повышает эффективность покрытия. Тем не менее, после длительного EXposure для ферментативного расщепления эффективность нанесения покрытия будет неоптимальным.
В целом, этот протокол был разработан, чтобы облегчить выделение и культуру человека амниона эпителиальных клеток (hAECs) с использованием продукта без реагентов животных в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ) руководящих принципов. Преимущество этого метода по сравнению с альтернативными методами изоляции, является то, что эти клетки могут быть выделены, характеризуется, криоконсервированных и культивировали без риска доставки потенциально вредных патогенов животных к человеку, при сохранении приемлемых выходов клеток, viabilities и потенциал роста. Для исследователей, переходящих от доклинических исследований на животных к клиническим испытаниям, эти методологии будут значительно ускорить одобрение регулирующих органов, снизить риски и повысить качество их терапевтического клеточной популяции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
