Introduction
从围产期来源，如胎盘，胎盘胎膜，脐带和羊水来源的细胞已经吸引了研究人员和临床医生关注，因为细胞的再生医学1,2的潜在来源。这样做的原因兴趣的是，这些类型的细胞都具有一定程度的可塑性和免疫调节能力3，即是基本的，以它们的潜在的治疗应用的属性。
hAECs是可从术语或预术语羊膜4中可以得出，提供再生细胞材料的一种丰富的潜在来源的异质上皮人口。使hAECs吸引力作为细胞治疗的属性包括其多能，低免疫原性，和抗炎特性。 hAECs已被发现是在体外和体内的多能高度，能分化成中胚层谱系（cardiomyocytes，肌细胞，骨细胞，脂肪细胞），内胚层谱系（胰腺细胞，肝细胞，肺细胞）和外胚层谱系（头发，皮肤，神经细胞和星形胶质细胞）5-10。
令人放心，尽管它们的多能hAECs似乎没有任何形式的肿瘤或促进肿瘤的发展在体内 。此外，hAECs也是免疫特权，表达II类人类白细胞抗原（的HLA）8水平低。这个属性可能underlies他们逃避免疫排斥异体异种及移植后，这表现在使用免疫能力的猴子，兔子，豚鼠，大鼠和猪11-13研究能力。 hAECs显示强大的免疫调节和免疫特性，从而为自身免疫性疾病的治疗潜在的临床应用显著实用的优点。 hAECs被认为发挥免疫调节功能上都先天和适应性免疫系统。上Ë建议的机制，是通过免疫调节的分泌因子14。
hAECs在临床前的动物疾病模型中的电流的应用包括中风，多发性硬化，肝疾病，糖尿病和慢性和急性肺部疾病的治疗。研究人员已经证明在使用hAECs治疗中风后的脑炎症的兴趣，由于其独特的性质。有证据表明，hAECs能够穿越血脑屏障，他们可以嫁接，存活长达60天，分化为神经元，减少炎症和促进在神经系统疾病15的动物模型中损伤的中枢神经系统组织的再生。
hAECs提供目标和反向有助于多发性硬化的发生和发展的多个病理途径的能力。例如，从临床前动物研究结果表明，hAECs强烈的免疫抑制和有可能引起外周免疫耐受和反向持续炎症反应。 hAECs也已经显示出具有分化成神经细胞在体内并通过神经营养的繁多因子16的分泌增强内源性神经再生的能力。
人类和啮齿类羊膜上皮细胞已经表明它们的治疗功效肝病动物模型中的治疗。在肝脏疾病，HAEC导致在肝脏可行hAECs的移植移植，伴随着降低肝细胞凋亡的四氯化碳诱导损伤模型，降低肝脏炎症和纤维化17。
hAECs可以刺激表达胰腺因子包括胰岛素和葡萄糖转运。几项研究已经调查了潜力hAECs恢复的血糖水平在糖尿病小鼠18。在小鼠接受hAECs，无论动物体重和血糖水平在注射后的细胞下降到正常水平。这些研究提出了强烈的情况下使用hAECs对糖尿病的治疗。
hAECs具有预防和修复实验性急性和慢性肺损伤的成年和新生模型19在一个成熟的作用。这些研究发现，hAECs 在体外分化成表达多个肺相关蛋白质，包括囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR），该突变在囊性纤维化患者20的离子通道功能的肺上皮细胞。此外，当hAECs被输送到受伤成人和新生儿肺部，它们通过宿主免疫细胞的调制发挥它们的修复效果，降低肺白细胞招募，包括中性粒细胞，巨噬细胞和淋巴细胞21-23。
鉴于其丰富，的安全记录，并用于多种疾病的公认的临床应用中，使用hAECs临床试验是不可避免的。以加快HAEC疗法进入临床试验的翻译的目标，我们开发的方法分离，冻存和文化hAECs适合于临床试验的方式，利用动物产品无试剂按照现行良好生产规范（cGMP）的指导方针。
我们根据这个协议，我们正在使用成功使用动物源性试剂6隔离hAECs先前公布的协议。我们改变了原来的协议与动物产品无试剂替代动物源性产品，以及随后的优化进行优化细胞产量，活力和纯度。我们的目标是开发一个协议，将符合法规标准的电池制造的人体临床试验。
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Protocol
注：胎盘应该从健康的单胎妊娠进行收集，偏重短期选修剖腹产。书面知情同意应给予他们胎盘的收集。您有关人类研究伦理委员会的批准应该全部收集和使用人体组织。
1.分离羊膜上皮细胞
- 将胎盘到无菌表面的II级生物安全柜中。
- 使用无菌的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，从胎盘表面和膜洗尽可能多血越好。
- 与胎盘放置脐带朝上，机械分离羊膜和绒毛膜膜的外边缘。
- 一旦分离，手动从胎盘的绒毛膜膜剥离羊膜，围绕该膜的边缘的工作，向脐带。
注：carefUL，以消除任何碎片从羊膜绒毛膜污染膜。 - 使用无菌剪刀，剪去羊膜约2cm从脐带并置于500毫升的基部密封含250毫升HBSS容器。
- 通过摇动含羊膜的密封的瓶子，彻底冲洗。
- 除去使用无菌镊子地方收集容器，以及羊膜成15cm的培养皿。
- 切羊膜成片约5厘米长的（用血管钳垂直握持时），丢弃血性或撕成碎片。
- 地方在500ml密闭容器中，并洗净，用250毫升的HBSS大约3-5次，或直到羊膜变成半透明，没有污染的血液。
注意：任何血液存在可能降低酶的消化效率的解决方案。 - 转移羊膜的所有片放入含有50ml酶的消化溶液的容器中，同时注意尽量减少HBSS结转。
- 孵育羊膜片在酶促消化在水浴或温室的溶液，在37℃下进行15分钟，温和搅拌，以除去任何剩余的血液。
- 除去羊膜片从酶消化溶液并置于一个新的无菌容器中。
- 加入100毫升新鲜的酶消化溶液的羊膜和孵化在37℃的水浴中或温暖的房间轻轻振荡（第一消化）60分钟。
- 除去羊膜片，并放入新容器小心，以允许酶促消化溶液从每片膜的流失。
注意：这可以通过拖动羊膜片沿容器的内沿达到。 - 加入100毫升新鲜的酶消化溶液的羊膜片和孵化在水浴或温室60分钟，在37℃轻微振荡（第二消化）。
- 通过细胞suspensi从步骤1.14到1000 XG 10分钟70微米的过滤器和离心机。
- 除去并弃去上清液，并重新悬浮含有1毫克/毫升大豆基酶抑制剂的细胞沉淀在4毫升HBSS中。轻轻地用1毫升移液管反复吸液管，以获得单细胞悬浮液。
注：在此阶段细胞可置于冰上直至从第二消化细胞是在处理的相同阶段。 - 除去羊膜片，并放入新容器小心，以允许酶促消化溶液从每片膜的流失。
注意：这可以通过拖动羊膜片沿容器的内沿达到。 - 通过一个70微米的过滤器和离心机通过从步骤1.18的细胞悬浮液在1000×g离心10分钟。
- 除去并弃去上清液，并重新悬浮含有1毫克/毫升大豆基酶抑制剂的细胞沉淀在4毫升HBSS中。轻轻地用1毫升对反复吸取ipette以得到单细胞悬浮液。
- 从两个摘要或备选池细胞保持单元概要分离直到细胞计数之后。
注意：这可以防止潜在的低存活率细胞具有高生存能力的细胞混合。 - 添加HBSS至10-20毫升的最终体积，并使用台盼蓝测定存活进行细胞计数。
- 确认上皮细胞表型通过流式细胞术。补使用抗EpCAM-PE适当抗体的鸡尾酒（1:2稀释）的抗CD90-PeCy5（1：250）和抗CD105-APC（1：100）在HBSS。
- 重悬的细胞从一个或两个消化的抗体混合物的一个子集，在25×10 6细胞/ ml的浓度。
- 对于流式细胞术，污点1×10 6个细胞用含有同种型对照抗体的鸡尾酒（例如IgG的1同种型对照-PE +抗CD90-PeCy5 +抗CD105-APC）。保持〜1×10 6个细胞未染色用于流式细胞仪建立。
- 孵育细胞抗体鸡尾酒在4℃下60分钟。
- 洗涤细胞3倍的HBSS重悬在5〜10万个细胞每毫升的流式细胞仪。
- 执行流式细胞仪和笔记结果。细胞分离物（EpCAM的阳性和CD90 / CD105阴性细胞的百分比）的纯度，预期分别为90-95％和<1％。
- 预留的细胞的合适数量为测试对于适当的质量控制或释放标准由最终应用决定。
注意：这可以包括疾病/病毒筛查，或其他安全或生物标准。 - 对于剩下的细胞，按照冷冻保存协议，或者直接放入培养（直接向培养步骤3.6）。
2.冻存hAECs的
- 确定使用流式细胞术数据或人工计数与台盼蓝排除细胞数量和存活力。
- 离心在700×g离心5分钟。
- 悬浮细胞秒每毫升1-10万细胞在动物产品无冷冻保存介质之间。
- 吸取合适体积的细胞成O形圆环状冻存小瓶并放入一个受控速率冷冻装置，其中冷却在大约发生1℃/分钟，直至-80℃的实现。
- 转移到小瓶液氮长期贮存。
3.解冻Cyropreserved hAECs与文化
- 从液氮中取出冻存小瓶，置于冰上。
注：对于只转移 - 迅速进行下一步。 - 迅速解冻的冷冻保存的小瓶在37℃下，直到只有一小片（约5毫米×5毫米）的冰的存在。
注：该细胞溶液不暖，以减少在冷冻保存介质DMSO中的毒性作用是重要的。 - 稀释冷冻保存介质10倍用冷（〜4℃）的无血清培养基，滴加在合适的尺寸卯管或容器。
- 离心在700×g离心5分钟，在室温。
- 重悬在无血清培养基中，以每毫升百万细胞的近似浓度。确定采用自动或手动计数与台盼蓝染色细胞数量和活力。预期存活率解冻后会比预先冷冻保存存活率少5-10％。
- 板的细胞在标准细胞培养处理过的塑料制品，或可替代地使用I型胶原涂覆培养表面。
- 对于I型胶原蛋白涂层遵循以下协议
- 从人胎盘（15毫克的胶原蛋白用25毫升去离子水和50微升冰醋酸）准备酸溶I型胶原蛋白。
- 覆盖烧杯用Parafilm搅拌适度，在37℃，直至胶原股被溶解。
- 用0.22微米的过滤器无菌过滤的胶原溶液。
- 稀释所述过滤的胶原股票1:10的去离子水。这种稀释股价的工作conce涂层塑料膜表面ntration解决方案。
- 胶原涂层的塑料，玻璃和膜面进行2小时，在室温，在37℃，或O / N在2-8℃。
- 从被涂覆表面除去多余的流体，并允许它以干燥O / N。
- 引入细胞中之前用无菌组织培养级水或HBSS冲洗。
- 板hAECs以25,000细胞/ cm 2的无血清培养基中的密度，并允许附着到发生为72-96小时。
- 以下附件，通过仔细地抽吸和与合适体积的无血清培养基中，每2-3天更换更换介质。
- 使用以下协议代细胞
- 吸细胞培养基洗净用无菌HBSS的1倍量
- 添加酶的1×体积消化溶液并孵育5-15分钟，或直至细胞被观察到从细胞培养表面分离。
- 收集酶消化解决方案，包含电池，保证CELLS从细胞培养表面通过反复吹打酶促消化针对细胞培养表面分离的溶液
- 离心在700×g离心5分钟。
- 悬浮在HBSS中的含有1mg / ml的大豆基酶抑制剂的合适体积的细胞沉淀。轻轻地用1毫升吸管反复吸取以获得单细胞悬浮液。
- 加入无血清培养基，以100万个细胞/ ml的近似浓度。确定采用自动或手动计数与台盼蓝染色细胞数量和活力。
- 板hAECs以25,000细胞/ cm 2的无血清培养基中的密度，并继续与标准培养方法。
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Representative Results
当此过程被正确执行，1.2亿hAECs平均产量应该预计，随着80-160百万细胞的典型范围。从这些产量，83±4％的平均存活率可以预期。增加的平均产量和稍低生存能力在临床方法可以由于缺乏血清蛋白是由于比动物衍生产物更高胰蛋白酶活性，或许也是。孤立hAECs有92％的EpCAM阳性细胞与<1％CD90，CD105间充质标志物阳性细胞的平均细胞表面轮廓。这些标志物由于分别选择它们的特异性上皮24,25和间质26谱系。这个过程可能需要大约4-5小时来完成（ 图1）。
冷冻保存需要20-60分钟取决于小瓶和最终细胞产量的数量。之前我们已经测试了一系列冻存媒体发现许多动物产品的培养基进行适当的，但最佳的DMSO浓度大约为5-10％。通常可以预期的生存能力解冻后，以比预冻存存活率少5-10％，而这种损失可显著更大对于没有经验的用户（ 图2）。
细胞培养物可与hAECs被执行以使表征，分化，或其他特定的体外过程。这些细胞最初附着在细胞表面有50-80％的效率（个人观察）。这增加了70-90％，随后的段落。附件可以增加与使用的表面涂层材料如I型胶原，或类似的产品。 hAECs维持其上皮表型在无血清培养基中（ 图3）。我们已经发现在细胞表面标记剖面下列重复通道显著改变。此外，在大约5代hAECs可以eith呃达到衰老，或通过与上皮间质转化一致的形态变化。反复传代后，hAECs保持正常的核型，长的端粒长度和细胞周期分布。这些性质表明转化或致瘤性的低风险。除了 具有免疫调节和抗炎性质，hAECs已经显示在体外和体内的多能高度，分化成细胞谱系代表三种主要胚层（ 图4）。
图1：预期细胞产量，存活率和纯度为临床隔离协议类似的细胞产量和活力可以通过使用动物副产品游离的试剂与标准动物含有产物的方法来实现。一个典型的隔离应> 90％的EpCAM和<1％CD90 / CD105阳性细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：解冻后活力和新陈代谢含血清和无血清细胞冻存媒体相比，以含10％DMSO FBS，市售的动物产品无冻存媒体显示出类似的或提高解冻后的活力和代谢请点击这里查看该图的放大版本。
图3：hAECs在无血清和含血清细胞尽头典型附着和生长轮廓TURE平台。动物产品的无培养基表明合适的细胞附着，增殖和维持上皮表型。然而无血清培养基的进一步发展是必需的，以实现相等的结果，以含有血清的培养基。比例尺代表500微米。
图4：hAECs的多向分化在早通路，hAECs已经显示出分化成多种细胞谱系代表三种主要胚层。这些谱系包括但不限于：神经元，头发和皮肤细胞，肺上皮细胞，心肌细胞，肝细胞，胰腺细胞，骨细胞和脂肪细胞。 （图改编自27）
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Discussion
有迹象表明，可以在该方法的成功显著影响几个关键参数。 hAECs分离之前胎盘或羊膜长达3小时的存储可能希望后勤或调度目的，然而，建议组织被尽快处理。如果组织是要被存储，则建议存储以下夹层的羊膜和洗涤来进行。羊膜可以在4℃储存在无菌HBSS中含有的抗生素，但是细胞生存力可与延长贮存时间减少。我们和其他人已经发现变异细胞产量和活力，并最大限度地减少这种变化，建议胎盘从健康术语胎，优选通过剖宫产收集。
我们发现，羊膜与血细胞的污染会导致酶活性的抑制和细胞产量的减少。因此在协议中的一个关键步骤是胎盘彻底洗涤和羊膜膜被推荐。因此建议，直到它以避免下游酶抑制出现白色/清晰的羊膜组织进行洗涤。上皮细胞的相对均匀种群隔离是用于表征和质量控制测试重要。
如果细胞产量与间充质细胞的产量低，活力或污染出现有可以用于故障诊断进行若干修改。如果细胞产量很低，它是可能的酶活性被抑制由于血液或血清的污染。这可以通过更彻底的和额外的洗涤步骤和/或丢弃血性或污染羊膜片来解决。酶孵育时间还可以增加，但是这可能是有害的细胞生存力。降低存活率或污染与间充质细胞，可避免通过减小消化时间。然而，THI而是也可降低细胞的总产率。时间从30分钟到2小时，可用于该协议。这些时间需要为所需的细胞的纯度和总收率/可行性进行优化。该技术的一个限制是，增加细胞产量或活力能来在彼此的费用。此外，无血清组分目前不能有效维持细胞存活力在暴露于酶活性。
细胞可以冷冻保存，而不在细胞生存力或代谢的损失任何重大降低由存储在一个温度控制的液体氮体系。这可以从一个简单的异丙醇填充低温保存设备先进设备，最先进的控制率冻结的系统。就我们所知，最优冻结速率为在该系统中hAECs尚未确定，1℃/分钟的结果在适当维持细胞生存力和解冻后代谢但是标准速率。在解冻Ø˚F冻存细胞，重要的是要保持解冻时间为最小，以减少细胞暴露于DMSO中。细胞可以附着并增殖以较低的速率以下冷冻保存和解冻相比培养新鲜分离细胞。
对于临床应用，可能希望向培养细胞以增加细胞数量或用于下游表征和/或体外操纵。读者应该了解其具体的体外操纵可能改变参与这些细胞的临床应用的调节途径。我们研究了一个动物产品的无培养基如的EpiLife是适于hAECs的维护和扩展。然而，需要以优化生长因子的浓度，以实现提高的生长速率为这样的细胞类型。细胞粘附的培养过程中通过使用人胶原涂覆基质的问题，提高了电镀效率。然而，在长期êxposure酶消化电镀效率将是次优的。
综上所述，该协议已经发展到便于使用的动物产品无试剂按照现行良好生产规范（cGMP）的指引，人羊膜上皮细胞（hAECs）的分离和培养。此方法相比，替代的分离方法的优点是，这些细胞可被分离，其特征在于，冷冻保存和培养，而不提供潜在的有害动物病原体对人体的危险性，同时保持合适的细胞产量，存活率和生长潜力。研究人员从临床前动物研究临床试验活动，这些方法将大大加快监管机构的批准，减少风险，并提高其治疗性细胞群的质量。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
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