Introduction
Zellen von perinatalen Quellen, wie Plazenta, Plazentamembranen, Nabelschnur und Fruchtwasser abgeleitet haben die Aufmerksamkeit von Forschern und Klinikern als potentielle Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1,2 angezogen. Der Grund für dieses Interesse ist, dass diese Zelltypen besitzen alle ein gewisses Maß an Plastizität und immunmodulatorische Fähigkeit 3, Eigenschaften, die von grundlegender Bedeutung für ihre mögliche therapeutische Anwendungen geeignet sind.
hAECs sind eine heterogene Population Epithelzellen, die aus Laufzeit oder vorzeitigen Amnionmembran 4 abgeleitet werden kann, wodurch ein reichliches potentielle Quelle für regenerative Zellmaterial. Die Eigenschaften, die hAECs ansprechend als Zelltherapie machen gehören ihrer Multi, geringe Immunogenität und entzündungshemmende Eigenschaften. hAECs gefunden wurden hochmulti sowohl in vitro als auch in vivo, zur Differenzierung zu mesodermalen Abstammungslinien zu sein (cardiomyocytes, Muskelzellen, Knochenzellen, Fettzellen), endodermalen Linien (Bauchspeicheldrüsenzellen, Leberzellen, Lungenzellen) und ektodermalen Linien (Haare, Haut, Nervenzellen und Astrozyten) 5-10.
Beruhigend, trotz ihrer Multipotenz hAECs Sie nicht, entweder Form Tumoren erscheinen oder zu fördern Tumorentwicklung in vivo. Darüber hinaus sind auch hAECs Immun privilegierten, zum Ausdruck geringe Klasse II Human-Leukozyten-Antigene (HLA) 8. Diese Eigenschaft wahrscheinlich zugrunde ihre Fähigkeit, Immunabstoßung nach allogener und xenogener Transplantation zu entgehen, wie in Studien mit immunkompetenten Affen, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Schweine von 11 bis 13 gezeigt. hAECs anzuzeigen potente immunmodulatorische und immunsuppressive Eigenschaften und bieten somit erhebliche praktische Vorteile für potentielle klinische Anwendungen bei Autoimmunerkrankungen Therapie. hAECs sind vermutlich immunmodulatorische Funktionen sowohl auf der angeborenen und adaptiven Immunsystem auszuüben. Aufe der Mechanismen vorgeschlagen, ist durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren 14.
Aktuelle Anwendungen der hAECs in vorklinischen Tierkrankheitsmodellen gehören die Behandlung von Schlaganfall, Multiple Sklerose, Lebererkrankungen, Diabetes und chronischen und akuten Lungenerkrankungen. Forscher haben Interesse an der Nutzung hAECs um nach Schlaganfall Gehirn Entzündung aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften gezeigt. Es gibt Hinweise darauf, dass hAECs die Blut-Hirn-Schranke, wo sie engraft überqueren können, überleben für bis zu 60 Tage, zu differenzieren zu Neuronen, verringern Entzündungen und fördern Regeneration geschädigter Gewebe des zentralen Nervensystems in Tiermodellen für neurologische Erkrankungen 15.
hAECs bieten die Möglichkeit, gezielt und Rückwärts mehrere pathologische Wege, die zu der Entwicklung und Progression von Multipler Sklerose bei. Beispielsweise ergibt sich aus der präklinischen Tierstudien legen nahe, dass hAECs stark immunsuppressive undpotenziell induzieren peripheren Immuntoleranz und Reverse laufenden Entzündungsreaktionen. hAECs haben auch gezeigt, dass die Fähigkeit, in vivo in neurale Zellen zu differenzieren und zu verbessern endogenen Neuroregeneration durch die Sekretion einer Vielzahl von neurotrophen Faktoren 16 haben.
Mensch und Nager Amnion Epithelzellen haben bereits ihre therapeutische Wirksamkeit nachgewiesen für die Behandlung von Lebererkrankungen in Tiermodellen. In einem Tetrachlorkohlenstoff Schäden Induktions Modell einer Lebererkrankung, HAEC Transplantation führen zur Verpflanzung von lebensfähigen hAECs in der Leber, in Begleitung mit reduzierter Hepatozyten Apoptose und Verminderung der Leberentzündung und Fibrose 17.
hAECs kann ausgedrückt Pankreas Faktoren, einschließlich Insulin und Glucose-Transporter stimuliert werden. Mehrere Studien haben das Potenzial für hAECs den Blutglucosespiegel in diabetischen Mäusen 18 wiederherzustellen sucht. In Mäusen, diehAECs verringerte beide Tierkörpergewicht und den Blutzuckerspiegel auf ein normales Niveau nach der Injektion von Zellen. Diese Studien stellen ein starkes Argument für den Einsatz von hAECs zur Behandlung von Diabetes mellitus.
hAECs haben eine nachgewiesene Rolle bei der Prävention und Reparatur von experimentellen akuten und chronischen Lungenschädigung in Erwachsenen und Neugeborenen-Modelle 19. Diese Studien zeigten, dass hAECs Differenzierung in vitro in funktionaler Lungenepithelzellen exprimieren multiple Lungen-assoziierten Proteine, einschließlich Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), des Ionenkanals, die bei Patienten mit zystischer Fibrose 20 mutiert ist. Außerdem, wenn hAECs an den verletzten Erwachsenen und Neugeborenen Lunge zugeführt, die reparative Wirkungen auszuüben sie über die Modulation der Immunzellen, wodurch Lungen Leukozytenrekrutierung, einschließlich Neutrophilen, Makrophagen und Lymphozyten 21-23.
Angesichts ihrer Hülle und Fülle,Sicherheitsbilanz und bewährte klinische Anwendungen für mehrere Krankheiten, klinische Studien mit hAECs ist unvermeidlich. Mit dem Ziel, beschleunigte Umsetzung HAEC Therapien in klinischen Studien-entwickelten wir Methoden, um in einer für die klinischen Studien Weise zu isolieren, Kryokonservierung und Kultur hAECs mit Tierproduktfreien Reagenzien gemäß den aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) Leitlinien .
Wir basieren diesem Protokoll eine zuvor veröffentlichte Protokoll, das wir erfolgreich verwendet haben, um hAECs Verwendung von Tieren stammenden Reagenzien 6 zu isolieren. Wir veränderten das ursprüngliche Protokoll an Tieren stammenden Produkte mit tierischen Erzeugnissen freien Reagenzien zu ersetzen, und die anschließende Optimierung durchgeführt, um die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit zu optimieren. Unser Ziel war es, ein Protokoll, das mit regulatorischen Standards für Zellfertigung für den menschlichen klinischen Studien erfüllen zu entwickeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HINWEIS: Plazenten sollte von Singleton gesunde Schwangerschaft gesammelt werden, mit einer Vorliebe für tigen Kaiserschnitt Abschnitte. Geschrieben sollte informierte Zustimmung zur Sammlung ihrer Plazenta gegeben werden. Ihre einschlägigen Menschen Forschung Ethik-Kommission sollte die Genehmigung alle Sammlung und Verwendung von menschlichen Geweben.
1. Isolierung von Amnion Epithelzellen
- Legen Sie die Plazenta auf eine sterile Oberfläche innerhalb einer Klasse II Sicherheitswerkbank.
- Verwendung steriler Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), wasche die so viel Blut wie möglich aus der Plazenta Oberfläche und Membranen.
- Mit der Plazenta mit der Nabelschnur nach oben eingelegt, mechanisch trennen den äußeren Rand der Amnion und Chorion Membranen.
- Einmal getrennt, manuell die Amnionmembran Streifen aus dem Chorion Membran der Plazenta, die rund um die Kante der Membran in Richtung der Nabelschnur.
HINWEIS: Tö Beul, alle Stücke von verunreinigenden Chorion Membran aus dem Amnion zu entfernen. - Mit Hilfe einer sterilen Schere, schneiden Sie die Amnionmembran ca. 2 cm von der Basis der Nabelschnur und in einen 500-ml verschlossenen Behälter mit 250 ml HBSS.
- Gründlich durch Schütteln des verschlossenen Flasche, die die Amnionmembran waschen.
- Entfernen Sie die Amnionmembran aus dem Auffangbehälter mit einer sterilen Pinzette und Ort in eine 15 cm Petrischale.
- Schneiden Sie die Amnionmembran in ca. 5 cm lang (bei vertikal mit einer Pinzette gehalten) Stücke, Verwerfen blutiger oder Papierreste.
- Platz in einem 500 ml verschlossenen Behälter und wäscht mit 250 ml HBSS etwa 3-5 mal, oder bis die Amnionmembran durchscheinend ohne gefährdend Blut.
HINWEIS: Jede Blut kann die Effizienz der enzymatischen reduzieren Abbaulösung. - Übertragen Sie alle Stücke von Amnionmembran in einen Behälter mit 50 ml der enzymatischen Abbaulösung, wobei darauf zuminimieren Trag von HBSS.
- Inkubieren Sie die Amnion Stücke in enzymatischen Abbaulösung im Wasserbad oder warmen Raum bei 37 ° C für 15 min unter leichtem Schütteln, um alle verbleibenden Blut zu entfernen.
- Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aus der enzymatischen Abbaulösung und in einen neuen sterilen Behälter.
- 100 ml frischer Enzymanalysenlösung in den Amnionmembran und bei 37 ° C für 60 min in einem Wasserbad oder warmen Raum unter leichtem Schütteln (erste Verdauung).
- Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aufnehmen und in neue Container kümmert, damit die enzymatischen Abbaulösung von jedem Membranstück abtropfen lassen.
ANMERKUNG: Diese kann durch Ziehen Amnion Stücke entlang der Innenrand des Behälters erreicht werden. - 100 ml frischer Enzymanalysenlösung in der Amnionmembran Stücke und Inkubation 60 min in einem Wasserbad oder warmen Raum bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (zweite Verdauung).
- Übergeben Sie die Zellschutzsperreauf aus Schritt 1.14 durch einen 70 um-Filter und Zentrifuge bei 1.000 × g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 4 ml HBSS, enthaltend 1 mg / ml Sojabohnenbasis-Enzym-Inhibitor. Sanft wiederholt Pipette mit einer 1 ml Pipette in eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
HINWEIS: In diesem Stadium Zellen auf Eis gelassen werden, bis die Zellen von der zweiten Digest sind im gleichen Stadium der Verarbeitung. - Entfernen Sie die Amnionmembran Stücke aufnehmen und in neue Container kümmert, damit die enzymatischen Abbaulösung von jedem Membranstück abtropfen lassen.
ANMERKUNG: Diese kann durch Ziehen Amnion Stücke entlang der Innenrand des Behälters erreicht werden. - Übergeben Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.18 durch einen 70 um-Filter und Zentrifuge bei 1.000 × g für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand und Zellpellet in 4 ml HBSS, enthaltend 1 mg / ml Sojabohnenbasis-Enzym-Inhibitor. Gently wiederholt pipettieren mit einer 1 ml pipette um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Pool-Zellen aus den beiden verdaut, oder alternativ halten Zelle verdaut, getrennt, bis nach der Zellzahl.
HINWEIS: Dies verhindert, dass das Mischen von potenziell geringen Lebensfähigkeit Zellen mit hoher Tragfähigkeit Zellen. - Hinzufügen HBSS auf ein Endvolumen von 10-20 ml und führen Zellzahlen unter Verwendung von Trypanblau zur Rentabilität zu messen.
- Bestätigen Sie den epithelialen Zell-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie. Make up geeigneten Antikörper-Cocktails mit anti-EpCAM-PE (1: 2 Verdünnung) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) und anti-CD105-APC (1: 100) in HBSS.
- Resuspendieren eine Untergruppe von Zellen von einer oder beiden Digests in der Antikörpermischung in einer Konzentration von 25 x 10 6 Zellen / ml.
- Für die Durchflusszytometrie Fleck 1 x 10 6 Zellen mit Antikörper-Cocktails, die Isotypkontrollen (z. IgG1 Isotyp-Kontroll-PE + Anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Halten ~ 1 x 10 6 Zellen ungefärbt für Durchflusszytometer Set-up.
- Zellen in Antikörper-InkubationCocktails bei 4 ° C für 60 min.
- Wasche die Zellen 3x in HBSS resuspendieren bei 5 bis 10 Millionen Zellen pro ml für die Durchflusszytometrie.
- Führen Durchflusszytometrie und Anmerkungs Ergebnisse. Die Reinheit des Zell Isolat (der Prozentsatz der EpCAM-positive und CD90 / CD105-negativen Zellen) wird erwartet, dass 90 bis 95% und <1% betragen.
- Beiseite eine geeignete Anzahl von Zellen für den Test geeignete Qualitätskontrolle oder Freigabekriterien wie Endanwendung bestimmt.
Hinweis: das kann Krankheit / Virus Screening oder andere Sicherheit oder biologischen Kriterien umfassen. - Für die übrigen Zellen, folgen Sie der Kryokonservierungsprotokolls oder alternativ direkt in die Kultur (direkt an Kultur Schritt 3.6).
2. Kryokonservierung von hAECs
- Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Durchflusszytometrie Daten oder manuelle Zählung mit Trypanblau-Ausschluss.
- Zentrifuge bei 700 × g für 5 min.
- Resuspendieren Zells von 1-10 Millionen Zellen pro ml in Tierproduktfreien Kryokonservierung Medien.
- Pipettieren ein geeignetes Volumen der Zellen in die O-Ring-Kryokonservierung Fläschchen aufnehmen und in einer kontrollierten Rate Gefriervorrichtung, wo die Abkühlung tritt bei etwa 1 ° C / min bis -80 ° C erreicht wird.
- Übertragen Fläschchen in flüssigem Stickstoff zur Langzeitlagerung.
3. Auftauen und Kultur Cyropreserved hAECs
- Entfernen Kryokonservierung Fläschchen aus flüssigem Stickstoff und legen auf Eis.
HINWEIS: Für die Übertragung nur - schnell weiter zum nächsten Schritt. - Auftauen Kryokonservierung Ampullen schnell bei 37 ° C, bis nur noch ein kleines Stück (~ 5 mm x 5 mm) des Eises verbleibt.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Zelllösung nicht erwärmt, um die toxischen Wirkungen von DMSO bei der Kryokonservierung Medien reduzieren. - Verdünne Kryokonservierung Medium 10-fach mit kaltem (ca. 4 ° C) serumfreien Medien, tropfenweise in einer geeigneten Größed Rohr oder Behälter.
- Zentrifuge bei 700 × g für 5 min bei RT.
- Ein Resuspendieren in serumfreien Medium, um eine ungefähre Konzentration von 1 Million Zellen pro ml. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit automatisierten oder manuellen Zählung mit Trypanblau-Ausschluss. Erwartete Lebensfähigkeit nach dem Auftauen werden 5-10% weniger als vor der Kryokonservierung Lebensfähigkeit.
- Plattenzellen auf Standard-Zellkultur behandelten Kunststoffwaren, oder alternativ Typ-I-Kollagen zu beschichten Kulturoberflächen.
- Für Typ-I-Collagen-Beschichtung folgen das Protokoll unter
- Bereiten säurelöslichem Kollagen Typ I aus der menschlichen Plazenta (15 mg Kollagen mit 25 ml entionisiertem Wasser und 50 ul Eisessig).
- Bedeckung Becherglas mit Parafilm und rühren mäßig bei 37 ° C bis Kollagenstränge gelöst sind.
- Sterile Filtercollagenlösung unter Verwendung einer 0,22 um-Filter.
- Verdünnen Sie die gefilterten Kollagen Lager 01.10 mit VE-Wasser. Diese verdünnte Lager ist die Arbeits concentration Lösung für die Beschichtung von Kunststoff-und Membranoberflächen.
- Kollagen-Kunststoff, Glas und Membranoberflächen für 2 h bei RT bei 37 ° C oder O / N bei 2-8 ° C.
- Entfernen überschüssiger Flüssigkeit von der beschichteten Oberfläche, und lassen Sie sie O / N trocknen.
- Spülen Sie mit sterilen Gewebekultur-Wasser oder HBSS vor der Einführung von Zellen und Medium.
- Platte hAECs in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 in einem serumfreien Medium und ermöglichen die Befestigung an für 72-96 h auf.
- Nach Anlegen Verändern Medien durch vorsichtiges Ansaugen und Ersetzen mit einem geeigneten Volumen an Serum-freies Medium alle 2-3 Tage.
- Passage-Zellen mit dem untenstehenden Protokoll
- Absaugen von Zellkulturmedien und wäscht mit 1x Volumen an sterilem HBSS
- Hinzufügen 1x Volumen von enzymatischen Abbaulösung und Inkubation für 5-15 Minuten oder bis Zellen beobachtet Ablösen von der Zellkulturoberfläche.
- Sammeln enzymatische Verdauung Lösung, die Zellen, die Gewährleistung cells werden aus der Zellkulturoberfläche durch wiederholtes Pipettieren des enzymatischen Aufschlußlösung vor der Zellkulturoberfläche abgelöst
- Zentrifuge bei 700 × g für 5 min.
- Zellpellet in einem geeigneten Volumen an HBSS mit 1 mg / ml Sojabohnenbasis Enzyminhibitor. Sanft wiederholt Pipette mit einer 1 ml Pipette in eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
- Serumfreies Medium hinzuzufügen einer ungefähren Konzentration von 1 Million Zellen / ml. Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit automatisierten oder manuellen Zählung mit Trypanblau-Ausschluss.
- Platte hAECs in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 in einem serumfreien Medium und mit Standardkultivierungsverfahren fortzusetzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wenn dieses Verfahren korrekt befolgt, sollte ein Durchschnittsertrag von 120 Millionen hAECs rechnen, wobei ein typischer Bereich von 80-160 Millionen Zellen. Aus diesen Erträgen kann eine durchschnittliche Überlebensfähigkeit von 83 ± 4% zu erwarten. Der erhöhte mittlere Ausbeute und einer etwas niedrigeren Lebensfähigkeit im klinischen Verfahren kann aufgrund der höheren Trypsin-Aktivität als die von Tieren stammenden Produkt aufgrund des Fehlens von Serumproteinen ist, und vielleicht auch. Isolierte hAECs eine durchschnittliche Zelloberflächenprofil von 92% EpCAM-positiven Zellen mit <1% CD90, CD105 mesenchymalen Marker positiven Zellen. Diese Marker wurden aufgrund ihrer Spezifität für Epithelzellen 24,25 und 26 mesenchymale Linien jeweils gewählten. Dieser Vorgang kann ca. 4-5 Stunden in Anspruch nehmen (Abbildung 1).
Kryokonservierung erfordert 20-60 min in Abhängigkeit von der Anzahl der Ampullen und endgültige Zellausbeute. Wir haben zuvor getestet einen Bereich der Kryokonservierung Medien und fandendass viele Tierprodukt-freie Medien durchführen passend, aber die optimale DMSO-Konzentration beträgt ca. 5-10%. In der Regel kann man erwarten, dass die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen werden 5-10% weniger als vor der Kryokonservierung Lebensfähigkeit, und dieser Verlust deutlich größer für den unerfahrenen Anwender (Abbildung 2).
Zellkultur mit hAECs geführt werden, um eine Charakterisierung, Differenzierung oder andere spezifische in vitro-Verfahren ermöglichen. Diese Zellen zunächst Befestigen an Zelloberflächen mit einem Wirkungsgrad von 50-80% (persönliche Beobachtung). Dies erhöht auf 70-90% mit anschließender Durchgänge. Die Befestigung kann durch die Verwendung von Oberflächenbeschichtungsmaterialien, wie Kollagen Typ I oder ähnlichen Produkten erhöht werden. hAECs behalten ihre epithelialen Phänotyp in serumfreien Kulturmedien (Abbildung 3). Wir haben erhebliche Veränderungen in der Zelloberflächenmarker Profile nach wiederholten Durchgang gefunden. Zusätzlich nach ca. 5 Passagen hAECs eith könnener erreichen Seneszenz, oder gehen Sie durch morphologische Veränderungen, die mit epithelialen zu mesenchymale Transition. Nach mehrmaligem Durchgang, hAECs pflegen einen normalen Karyotyp, lange Telomerlängen und Zellzyklus-Verteilung. Diese Eigenschaften zeigen ein geringes Risiko der Transformation oder Tumorbildung. Neben mit immun regulatorischen und entzündungshemmende Eigenschaften haben hAECs gezeigt, dass sie hochgradig multi in vitro und in vivo Differenzierung in Zelllinien repräsentativ für die drei primären Keimblättern (Abbildung 4).
Abb. 1: Erwartete Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit für die klinische Isolierungsprotokoll Ähnliche Zellausbeuten und die Lebensfähigkeit unter Verwendung tierischer Nebenprodukt frei Reagenzien im Vergleich zu Standard-Tierprodukthaltigen Methoden erreicht werden. Eine typische Isolation sollte> 90% EpCAM und <1% CD90 / CD105 positiv seinZellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 2:. Beitrag Tauwetter Lebensfähigkeit und den Stoffwechsel zu serumhaltigem und serumfreien Medien Kryokonservierung Vergleich zu FBS mit 10% DMSO zeigte handelsüblichen Tierproduktfreien Kryokonservierung Medien ähnliche oder erhöhte nach dem Auftauen die Lebensfähigkeit und den Stoffwechsel Bitte klicken Sie hier, um sehen eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Typische Anhaftung und das Wachstum Profil hAECs in serumfreiem und serumhaltigem Zell cultur Medium. Tierproduktfreien Kulturmedien zeigte geeigneten Zellanheftung, Proliferation und Wartung von epithelialen Phänotyp. Jedoch Weiterentwicklung serumfreien Medien ist erforderlich, um gleiche Ergebnisse zu serumhaltigen Medien zu erzielen. Maßstabsbalken repräsentieren 500 um.
Fig. 4: multipotenten Differenzierung hAECs Bei frühen Passage, hAECs wurde gezeigt, dass in mehrere Zelllinien repräsentativ für die drei primären Keimblättern unterscheiden. Diese Linien umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt; Neuronen, Haar- und Hautzellen, Lungenepithel, Kardiomyozyten, Hepatozyten, Pankreaszellen, Knochenzellen und Adipozyten. (Bild angepasst von 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Es gibt mehrere kritische Parameter, die erhebliche Auswirkungen auf den Erfolg dieser Methode haben können. Speicherung der Plazenta oder Amnion für 3 h vor der Isolierung hAECs kann logistischer oder Planungszwecke wünschenswert sein, es wird jedoch empfohlen, dass das Gewebe so schnell wie möglich verarbeitet werden. Wenn Gewebe gelagert werden soll, ist es empfehlenswert, dass der Lagerung nach der Präparation und Waschen der Amnionmembran geführt werden. Amnion in sterile HBSS mit Antibiotika bei 4 ° C gelagert werden, können jedoch die Lebensfähigkeit der Zellen mit längerer Lagerzeit zu verringern. Wir und andere haben Variabilität der Zellausbeute und Lebensfähigkeit gefunden, und diese Variabilität ist es empfehlenswert, dass die Plazenta von gesunden Geburten, vorzugsweise durch Kaiserschnitt gesammelt minimieren.
Wir fanden, dass eine Kontamination der Amnionmembran mit Blutzellen wird in der Hemmung der Enzymaktivität und eine Verringerung der Zellausbeute führen. Deshalbein kritischer Schritt im Protokoll ist gründliches Waschen der Plazenta und der Amnionmembran empfohlen. Es wird empfohlen, das Amnion Gewebe gewaschen werden, bis es erscheint weiß / klar nachgeschalteten Enzymhemmung zu vermeiden. Isolierung eines relativ homogene Population von Epithelzellen wichtig ist für die Charakterisierung und Qualitätskontrolle.
Wenn geringe Ausbeuten, Lebensfähigkeit oder Kontamination der Zellausbeute mit mesenchymalen Zellen auftritt gibt es verschiedene Änderungen, die für die Fehlersuche durchgeführt werden kann. Wenn Zellausbeuten sind niedrig, ist es wahrscheinlich, dass die enzymatische Aktivität wurde durch Blut oder Serum Verunreinigungen gehemmt. Dies kann mit gründlicher und zusätzliche Waschschritte und / oder Verwerfen von blutigen oder kontaminierten Amnion Stücke aufgelöst werden. Enzym Inkubationszeit kann auch erhöht werden, aber dies kann sich nachteilig auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu sein. Eine verringerte Lebensfähigkeit oder Kontamination mit mesenchymalen Zellen kann durch Verringern der Digest Zeit vermieden werden. Allerdings this kann auch die Gesamtausbeute an Zellen zu verringern. Zeiten im Bereich von 30 min bis 2 h kann für dieses Protokoll verwenden. Diese Zeiten müssen für die gewünschte Zelle Reinheit und Gesamtertrag / Fähigkeit optimiert werden. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass die Erhöhung oder die Lebensfähigkeit Zellausbeute auf Kosten der jeweils anderen zu kommen. Darüber hinaus sind Serum-freien Komponenten derzeit nicht so effektiv Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen nach Exposition gegenüber enzymatischer Aktivität.
Zellen können ohne großen Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen oder den Verlust der Stoffwechsel durch Lagerung in einem temperaturgesteuerten flüssigen Stickstoff System kryokonserviert werden. Dies kann von einer einfachen Isopropanol gefüllten Kryokonservierung Gerät mit einem State-of-the-Art-kontrollierten Rate Gefriersystem reichen. Soweit uns bekannt ist, hat die optimale Gefriergeschwindigkeit für hAECs in diesem System nicht bestimmt worden, aber die Standard-Geschwindigkeit von 1 ° C / min ergibt geeignete Wartung der Lebensfähigkeit der Zellen und nach dem Auftauen Stoffwechsel. Beim Auftauen of kryokonservierten Zellen, ist wichtig, um dem Auftauen auf ein Minimum zu halten, um die Zell Exposition gegenüber DMSO reduzieren. Die Zellen können zu befestigen und sich vermehren zu einem niedrigeren Zinssatz folgenden Kryokonservierung und Auftauen im Vergleich zum Kultivieren von frisch isolierten Zellen.
Für die klinische Anwendung kann es wünschenswert sein, Zellen zu kultivieren, um die Zellzahl oder zur nachgeschalteten Charakterisierung und / oder in vitro-Manipulation erhöhen. Die Leser sollten wissen, wie ihre spezifischen in vitro-Manipulation könnte die Regulationswege in der klinischen Anwendung dieser Zellen beteiligt zu ändern. Wir untersuchten, dass ein Tier Produkt freien Kulturmedium, wie EpiLife war für den Erhalt und Ausbau der hAECs. Jedoch ist es erforderlich, die Wachstumsfaktor-Konzentrationen zu optimieren, um erhöhte Wachstumsraten wie Zelltyp zu erzielen. Die Frage der Zellhaftung während der Kultur durch die Verwendung eines menschlichen Kollagen-Beschichtungsmatrix, erhöht die Plattierungseffizienz. Doch nach längerem exposure auf enzymatische Verdauung die Beschichtungseffizienz werden nicht optimal sein.
Zusammenfassend wurde dieses Protokoll entwickelt, um die Isolierung und Kultivierung von menschlichen Amnion-Epithelzellen (hAECs) mit Tierproduktfreien Reagenzien gemäß den aktuellen guten Herstellungspraxis (cGMP) Richtlinien zu erleichtern. Der Vorteil dieses Verfahrens im Vergleich zu alternativen Isolierungsverfahren ist, dass diese Zellen isoliert werden können, dadurch gekennzeichnet, kryokonserviert und kultiviert ohne das Risiko der Abgabe potentiell schädlichen Tierkrankheitserreger bei Menschen, unter Beibehaltung geeigneter Zellausbeuten, Lebensfähigkeit und Wachstumspotential. Für Forscher Übergang von präklinischen Tierstudien, klinische Studien, werden diese Methoden erheblich beschleunigt die Zulassung, verringern Risiken und zur Verbesserung der Qualität ihrer therapeutischen Zellpopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
