Introduction
Celler avledet fra perinatale kilder, for eksempel morkaken, morkake membraner, navlestreng og fostervann har tiltrukket seg oppmerksomhet fra forskere og klinikere som en potensiell kilde til celler for regenerativ medisin 1,2. Årsaken til denne interessen er at disse celletyper alle har en viss grad av plastisitet og immunmodulerende evne 3, egenskaper som er avgjørende for deres potensielle terapeutiske anvendelser.
hAECs er en heterogen populasjon epitel som kan være avledet fra sikt eller pre-term amnion membran 4, som gir en rikelig potensiell kilde til regenerativ cellemateriale. De egenskapene som gjør hAECs tiltalende som en mobil terapi inkluderer deres multipotency, lav immunogenisitet, og anti-inflammatoriske egenskaper. hAECs har blitt funnet å være meget multipotent både in vitro og in vivo, er i stand til å differensiere til mesodermal linjene (cardiomyocytes, myocytes, osteocytter, adipocytter), endodermal linjene (bukspyttkjertelen celler, leverceller, lungeceller) og ectodermal linjene (hår, hud, nerveceller og astrocytter) 5-10.
Betryggende, til tross for sine multipotency hAECs ikke synes å enten skjema svulster eller fremme svulst utvikling in vivo. Videre hAECs er også immune privilegert, uttrykker lave nivåer av klasse II menneskelige leukocyttantigener (HLAs) 8. Denne egenskapen sannsynlig ligger bak deres evne til å unngå immun avvisning etter allogen og xenogen transplantasjon, som demonstrert i studier med immun kompetente aper, kaniner, marsvin, rotter og griser 11-13. hAECs vise potent immunmodulerende og immunsupprimerende egenskaper og dermed gi betydelige praktiske fordeler for potensielle kliniske anvendelser i autoimmun sykdom terapi. hAECs antas å utøve immunmodulerende funksjoner på både medfødte og ervervede immunforsvar. Påe av mekanismene foreslåtte, er gjennom utskillelsen av immunmodulerende faktorer 14.
Nåværende anvendelser av hAECs i prekliniske dyresykdomsmodeller inkluderer behandling av hjerneslag, multippel sklerose, leversykdom, diabetes og kroniske og akutte lungesykdommer. Forskere har vist interesse for å bruke hAECs å behandle post-takts hjernebetennelse på grunn av sine unike egenskaper. Det er dokumentert at hAECs kan krysse blod-hjerne barrieren der de kan innpode, overleve i opptil 60 dager, differensiere i nevroner, redusere betennelse og fremme regenerering av skadet sentralnervesystemet vev i dyremodeller av nevrologiske sykdommer 15.
hAECs tilbyr muligheten til å målrette og reversere flere patologiske pathways som bidrar til utvikling og progresjon av multippel sklerose. For eksempel resultater fra prekliniske dyrestudier tyder på at hAECs er sterkt immundempende ogkan potensielt indusere perifer immuntoleranse og reversere pågående betennelsesreaksjoner. hAECs har også vist seg å ha kapasitet til å differensiere i nerveceller in vivo og forbedre endogen neuroregeneration gjennom utskillelsen av et stort utvalg av neurotrof faktorer 16.
Humane og gnager amnion epitelceller har allerede demonstrert deres terapeutiske effekt ved behandling av leversykdom hos dyremodeller. I en karbontetraklorid skade induksjon modell av leversykdom, HAEC transplantasjon fører til innpoding av levedyktige hAECs i leveren, sammen med redusert hepatocytter apoptose, og redusert hepatisk inflammasjon og fibrose 17.
hAECs kan stimuleres til uttrykt i bukspyttkjertelen faktorer, inkludert insulin og glukose transportører. Flere studier har undersøkt muligheten for hAECs å gjenopprette blodglukosenivåer i diabetiker mus 18. I mus som mottokhAECs, både dyr kroppsvekt og blodsukker redusert til normale nivåer etter injeksjon av celler. Disse studiene presentere en sterk sak for bruk av hAECs for behandling av diabetes mellitus.
hAECs har en bevist rolle i forebygging og reparasjon av eksperimentell akutt og kronisk lungeskade både voksne og neonatale modeller 19. Disse studiene fant at hAECs skille in vitro til funksjonell lunge epitelceller uttrykker flere lunge-assosiert proteiner, inkludert Cystisk fibrose transmembran Conductance Regulator (CFTR), ion-kanalen som er mutert hos pasienter med cystisk fibrose 20. I tillegg, når hAECs blir levert til den skadde voksen og neonatal lunge, utøver de sin reparerende virkninger via modulering av vertsimmunceller, redusere lunge leukocytt-rekruttering, inkludert neutrofiler, makrofager og lymfocytter 21-23.
Gitt sin overflod,sikkerhet posten, og påvist kliniske applikasjoner for flere sykdommer, kliniske forsøk med hAECs er uunngåelig. Med mål om å fremskynde oversettelse av HAEC behandlinger i kliniske-studier, har vi utviklet metoder for å isolere, fryse ned og kultur hAECs på en måte som er egnet for kliniske studier, ved hjelp av animalske produkt-free reagenser i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practices (cGMP) retningslinjer .
Vi baserte denne protokollen en tidligere utgitt protokoll som vi brukte med hell for å isolere hAECs bruker animalske reagenser 6. Vi endret den opprinnelige protokollen for å erstatte animalske produkter med dyreproduktfritt reagenser, og påfølgende optimalisering ble utført for å optimalisere celleutbytte, levedyktighet og renhet. Vårt mål var å utvikle en protokoll som ville være i samsvar med regelverkets krav til celle produksjon for kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: morkaker skal samles fra Singleton sunt svangerskap, med en preferanse for langtids elektive keisersnitt. Skrevet, bør informert samtykke gis for innsamling av sin morkake. Din relevant menneskelige forskningsetisk komité bør godkjenning all innsamling og bruk av menneskelig vev.
1. Isolering av amnion Epitelceller
- Plasser morkaken på en steril overflate i en klasse II biologisk sikkerhetskabinett.
- Ved hjelp av sterile Hanks balanserte saltløsning (HBSS), vaskes så meget blod som mulig fra placenta overflaten og membraner.
- Med placenta plassert med navlestrengen opp, mekanisk separere den ytre kanten av amnion og chorion membraner.
- Når separert manuelt strippe amnion membranen fra chorion membran av placenta, som arbeider rundt kanten av membranen, mot navlestrengen.
MERK: Være careful for å fjerne eventuelle deler av kontaminerende chorion membranen fra amnion. - Ved hjelp av steril saks, klippe amnionen membran ca 2 cm fra bunnen av navlestrengen og plasser i en 500 ml forseglet beholder som inneholder 250 ml HBSS.
- Vask grundig ved å riste forseglet flaske inneholder amnionen membran.
- Fjern amnionen membran fra samlingen container ved hjelp steril tang, og plass til en 15 cm petriskål.
- Skjær amnion membran i biter ca 5 cm lange (når den holdes vertikalt med pinsett), forkaster blodig eller papirbiter.
- Sted i en 500 ml lukket beholder og vask med 250 ml HBSS ca 3-5 ganger eller til amnion membranen blir gjennomskinnelig uten forurensende blod.
MERK: Alle blodprøver stede kan redusere effektiviteten av den enzymatiske fordøye løsning. - Overføre alle biter av amnion membran i en beholder med 50 ml av den enzymatiske fordøye løsning, ta vare åminimere overføring av HBSS.
- Inkuber amnion stykker i enzymatisk fordøye løsningen i et vannbad eller i et varmt rom ved 37 ° C i 15 min med forsiktig omrøring for å fjerne gjenværende blod.
- Fjern amnionen membran stykker fra enzymatisk fordøye løsning og plass i en ny steril beholder.
- Tilsett 100 ml friskt enzymatisk digest løsning på amnion membran og inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter i et vannbad eller i et varmt rom med forsiktig risting (første spaltning).
- Fjern amnionen membran biter og legg inn ny container ta vare å la den enzymatiske fordøye løsning å renne fra hver del av membran.
MERK: Dette kan oppnås ved å dra amnion stykker langs innsiden kanten av beholderen. - Tilsett 100 ml friskt enzymatisk digest løsning amnion membranstykkene og inkuberes 60 min i et vannbad eller i et varmt rom ved 37 ° C med forsiktig risting (andre fordøyelse).
- Passere celleopphengpå fra trinn 1.14 gjennom et 70 um filter og sentrifuger ved 1000 xg i 10 min.
- Fjern og kast supernatant, og cellepelleten suspenderes i 4 ml HBSS inneholdende 1 mg / ml soyabønne-basert enzymhemmer. Forsiktig pipettere gjentatte ganger med en 1 ml pipette for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
NB: I denne fasen celler kan stå på is inntil cellene fra den andre digest er på samme stadium av behandlingen. - Fjern amnionen membran biter og legg inn ny container ta vare å la den enzymatiske fordøye løsning å renne fra hver del av membran.
MERK: Dette kan oppnås ved å dra amnion stykker langs innsiden kanten av beholderen. - Passere cellesuspensjonen fra trinn 1.18 gjennom et 70 um filter og sentrifuger ved 1000 xg i 10 min.
- Fjern og kast supernatant, og cellepelleten suspenderes i 4 ml HBSS inneholdende 1 mg / ml soyabønne-basert enzymhemmer. Forsiktig pipette gjentatte ganger med en 1 ml pipette å oppnå en enkel cellesuspensjon.
- Basseng celler fra de to fordøyer eller alternativt holde cellefordøyer skilt før etter celletall.
MERK: Dette hindrer blanding av potensielt lave levedyktighet celler med høy levedyktighet celler. - Legg HBSS til et sluttvolum på 10-20 ml og utføre celletellinger ved bruk av trypan-blått for å måle levedyktigheten.
- Bekrefte epitelcelle fenotype ved strømningscytometri. Sminke passende antistoff cocktails ved hjelp av anti-EpCAM-PE (1: 2 fortynning) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) og anti-CD105-APC (1: 100) i HBSS.
- Resuspender en undergruppe av celler fra en av eller begge fordøyer i antistoffet cocktail i en konsentrasjon på 25 x 10 6 celler / ml.
- For flowcytometri, beis 1 x 10 6 celler med antistoff cocktails inneholder isotype kontroller (f.eks. IgG en isotypekontroll-PE + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Hold ~ 1 x 10 6 celler unstained for flowcytometer set-up.
- Inkuber celler i antistoffcocktails ved 4 ° C i 60 min.
- Vask cellene 3x i HBSS og resuspender på 5-10 millioner celler per ml for flowcytometri.
- Utføre flowcytometri og notat resultater. Renheten av cellen isolat (prosentandelen av EpCAM positive og CD90 / CD105-negative celler) er forventet å være 90-95% og <1% hhv.
- Sett av et passende antall celler for testing for aktuelle kvalitetskontroll eller utslipp kriterier som bestemmes av endelig søknad.
MERK: Dette kan omfatte sykdom / viral screening, eller annen sikkerhet eller biologiske kriterier. - For de resterende celler, følger nedfrysing protokollen, eller alternativt plassere direkte i kultur (direkte til kultur trinn 3.6).
2. kryokonservering hAECs
- Bestem celle nummer og levedyktighet ved hjelp av flowcytometri data eller manuell telling med trypanblå eksklusjon.
- Sentrifuger ved 700 xg i 5 min.
- Suspender celles mellom 1-10 millioner celler per ml i animalske produkt fritt nedfrysing media.
- Pipettere et egnet volum av celler i O-ringmerket nedfrysing ampuller og fyll i en kontrollert hastighet fryseapparat hvor kjølingen skjer ved ca. 1 ° C / min til -80 ° C er oppnådd.
- Overføre ampuller i flytende nitrogen for langtidslagring.
3. Tining og kultur Cyropreserved hAECs
- Fjern nedfrysing ampuller fra flytende nitrogen og legg på is.
MERK: For overføring bare - gå raskt til neste trinn. - Tine nedfrysing ampullene raskt ved 37 ° C inntil bare en liten del (~ 5 mm x 5 mm) av is gjenstår.
NB: Det er viktig at celle løsningen ikke varmes for å redusere toksiske effekter av DMSO i kryopreservering media. - Fortynne nedfrysing media 10 ganger med kaldt (~ 4 ° C) serum-frie medier, dråpevis i en passende størrelsed tube eller beholder.
- Sentrifuger ved 700 xg i 5 minutter ved RT.
- Resuspender i serumfritt medium, til en omtrentlig konsentrasjon på 1 million celler per ml. Bestem celle nummer og levedyktighet ved hjelp av automatisert eller manuell telling med trypanblå eksklusjon. Forventet levedyktighet post-tøvær vil være 5-10% mindre enn før nedfrysing levedyktighet.
- Plate celler på standard cellekultur-behandlet plast ware, eller alternativt bruke Type I kollagen å belegge kultur overflater.
- For type I kollagen belegg følge protokollen under
- Forbered syreløselig kollagen type I fra human placenta (15 mg kollagen med 25 ml avionisert vann og 50 ul iseddik).
- Dekk begerglass med Parafilm og omrør moderat ved 37 ° C inntil kollagentråder er oppløst.
- Sterilt filter kollagen løsning ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter.
- Fortynne filtrert kollagen lager 1:10 med avionisert vann. Dette utvannet aksje er arbeids concentration løsning for belegg plast og membran flater.
- Kollagen belegge plast, glass og membranflater i 2 timer ved romtemperatur ved 37 ° C, eller O / N ved 2-8 ° C.
- Fjern overflødig væske fra den belagte overflaten, og la det tørke O / N.
- Skyll med sterilt vev kultur grade vann eller HBSS før innføring av celler og medium.
- Tallerken hAECs ved en tetthet på 25.000 celler / cm2 i serumfritt medium, og tillater festing til å oppstå i 72-96 timer.
- Etter festing, endrer medier ved forsiktig å aspirere og erstatte med et egnet volum av serum-fritt medium etter 2-3 dager.
- Passage celler ved hjelp av protokollen under
- Aspirer cellekulturmedier og vask med 1x volum sterilt HBSS
- Legg 1x volum av enzymatisk digest løsning og inkuberes i 5 til 15 minutter, eller inntil cellene er observert å løsne fra cellekulturoverflate.
- Samle enzymatisk digest oppløsning inneholdende celler, som sikrer cells blir løsrevet fra cellekulturoverflate ved gjentatte ganger å pipettere enzymatisk digest løsningen mot cellekulturoverflate
- Sentrifuger ved 700 xg i 5 min.
- Resuspender cellepelleten i et egnet volum av HBSS inneholdende 1 mg / ml soyabønne-basert enzymhemmer. Forsiktig pipettere gjentatte ganger med en 1 ml pipette for å oppnå en enkel cellesuspensjon.
- Legg serumfritt medium til en omtrentlig konsentrasjon på 1 million celler / ml. Bestem celle nummer og levedyktighet ved hjelp av automatisert eller manuell telling med trypanblå eksklusjon.
- Tallerken hAECs ved en tetthet på 25.000 celler / cm2 i serumfritt medium, og fortsetter med standard dyrkningsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når denne fremgangsmåte følges fullstendig, bør en gjennomsnittlig utbytte på 120 millioner hAECs være forventet, med et typisk område på fra 80 til 160 millioner celler. Fra disse utbytter, kan forventes en gjennomsnittlig levedyktigheten til 83 ± 4%. Den økede gjennomsnittlig utbytte og litt lavere levedyktigheten i klinisk metode kan skyldes høyere trypsin-aktivitet enn animalsk-avledede produkt, og kanskje også på grunn av mangel av serumproteiner. Isolerte hAECs har en gjennomsnittlig celleoverflateprofil på 92% EpCAM positive celler med <1% CD90, CD105 mesenchymale markør positive celler. Disse markørene ble valgt på grunn av sin spesifisitet for epitelceller og 24,25 mesenchymale 26 linjene hhv. Denne prosessen kan ta ca 4-5 timer å fullføre (figur 1).
Nedfrysing krever 20-60 min avhengig av antall hetteglass og endelig celle yield. Vi har tidligere testet en rekke nedfrysing media og funnetat mange dyr produkt-frie medier utføre passende, men den optimale DMSO konsentrasjonen er ca 5-10%. Vanligvis kan man forvente levedyktighet post-tøvær å være 5-10% mindre enn pre-cryopreservation levedyktighet, og dette tapet kan være betydelig større for den uerfarne bruker (figur 2).
Cellekultur kan utføres med hAECs aktivere karakterisering, differensiering eller annen spesifikk in vitro prosedyrer. Disse cellene i utgangspunktet legge til celleoverflater med en virkningsgrad på 50-80% (personlig observasjon). Dette øker til 70-90% med påfølgende passasjer. Vedlegg kan økes ved bruk av overflatebeleggmaterialer slik som kollagen type I, eller tilsvarende produkter. hAECs opprettholde sin epitelial fenotype i serumfrie dyrkningsmedier (figur 3). Vi har funnet betydelige endringer i celleoverflatemarkør profiler følgende gjentatte passasje. I tillegg, etter ca 5 passasjer hAECs kan either nå senescence, eller gå gjennom morfologiske forandringer forenlig med epitelial til mesenchymale overgang. Etter gjentatte passasje, hAECs opprettholde en normal karyotype, lange telomere lengder og cellesyklus distribusjon. Disse egenskapene indikerer en lav risiko for transformasjon eller tumorgenisiteten. I tillegg til å inneha immunregulerings og anti-inflammatoriske egenskaper, har hAECs vist seg å være meget multipotent in vitro og in vivo, å differensiere til celle-linjene er representative for de tre primær bakterie lag (Fig 4).
Fig. 1: Forventet celleutbytte, levedyktighet og renhet for klinisk isolasjonsprotokoll Lignende celleutbytte og levedyktighet kan oppnås ved hjelp av dyreprodukt frie reagenser sammenlignet med standard dyreproduktinneholdende metoder. En typisk isolasjon bør være> 90% EpCAM og <1% CD90 / CD105 positiveceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:.. Post tine levedyktighet og metabolisme for serumholdig og serum-fri kryokonservering media Sammenlignet med FBS inneholder 10% DMSO, kommersielt tilgjengelige animalske produkt-free nedfrysing media viste lik eller økt post-tine levedyktighet og metabolisme Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Typisk festing og vekst profil hAECs i serumfrie og serumholdige celle culture medium. Animal produkt frie dyrkningsmedier viste passende cellebinding, spredning og vedlikehold av epitelial fenotype. Men videre utvikling av serum-fritt medium er nødvendig for å oppnå likeverdige resultater til serum-inneholdende medier. Skala barer representerer 500 mikrometer.
Fig. 4: multipotente differensiering av hAECs Ved tidlig passasje, har hAECs blitt vist til å differensiere til flere celle linjene er representative for de tre primær bakterie lag. Disse linjene omfatter, men er ikke begrenset til; nevroner, hår og hudceller, lunge epitel, cardiomyocytes, hepatocytter, bukspyttkjertelen celler, osteocytter og adipocytter. (Figur tilpasset fra 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er flere viktige parametere som kan ha en betydelig innvirkning på suksessen av denne metodikken. Lagring av morkaken eller amnion i opp til 3 timer før isolering av hAECs kan være ønskelig for logistikk eller planleggingsformål, men det anbefales at vevet er behandlet så snart som mulig. Hvis vevet skal lagres, er det anbefalt at lagring kan utføres etter disseksjon og vasking av amnion membran. Amnion kan lagres i sterile HBSS inneholdende antibiotika ved 4 ° C, men kan redusere cellenes levedyktighet med forlenget lagringstid. Vi, og andre har funnet variasjon i celleutbytte og levedyktighet, og for å minimere denne variasjonen, anbefales det at morkaken er hentet fra friske varige fødsler, gjerne levert med keisersnitt.
Vi har funnet at forurensning av amnion membran med blodceller vil resultere i hemming av enzymaktivitet og en reduksjon i celleutbyttet. Derforet kritisk trinn i protokollen er grundig vasking av placenta og amnion membranen er anbefalt. Det anbefales at amnionen vev vaskes før den vises hvit / klar for å unngå nedstrøms enzyminhibering. Isolering av en forholdsvis homogen populasjon av epitel-celler er viktig for karakterisering og kvalitetskontroll.
Hvis lave avlinger, levedyktighet eller forurensning av cellen utbyttet med mesenchymalceller skjer det flere endringer som kan utføres for feilsøking. Hvis celleutbytte er lav, er det sannsynlig at enzymatisk aktivitet ble inhibert på grunn av blod eller serum forurensning. Dette kan løses med mer grundige og flere vasketrinn og / eller forkaste blodige eller forurensede amnion stykker. Enzym inkubasjonstid kan også økes, men dette kan være skadelig for cellelevedyktighet. Redusert levedyktighet eller forurensning med mesenchymale celler kan unngås ved å nedsette spaltningen tid. Men this kan også redusere det totale utbytte av celler. Tider som strekker seg fra 30 minutter til 2 timer kan brukes for denne protokollen. Disse tidene må optimaliseres for ønskede celle renhet og totalt utbytte / levedyktighet. En begrensning ved denne teknikk er at økende celleutbytte eller levedyktighet kan gå på bekostning av hverandre. I tillegg serum-frie komponenter er for tiden ikke så effektive for å opprettholde cellenes levedyktighet etter eksponering for enzymatisk aktivitet.
Celler kan fryses uten noen større reduksjon i cellelevedyktighet eller tap av metabolismen ved lagring i et temperaturkontrollert væske nitrogen. Dette kan være alt fra en enkel isopropanol fylt kryokonservering enhet til en state-of-the-art kontrollert hastighet fryseanlegg. Så vidt vi vet, har den optimale frysehastighet for hAECs i dette systemet ikke fastslått, men den standard hastighet på 1 ° C / min resultatene i egnet vedlikehold av celle levedyktighet og post-tine metabolisme. Under tining of cryopreserved celler, er det viktig å holde tinetiden til et minimum for å redusere celle eksponering for DMSO. Celler kan feste og sprer med en lavere hastighet etter nedfrysing og tining i forhold til dyrking nylig isolerte celler.
For klinisk anvendelse kan det være ønskelig å dyrke celler for å øke celle tallet eller nedstrøms for karakterisering og / eller in vitro-manipulasjon. Leserne bør forstå hvordan deres spesifikke in vitro manipulasjon kan endre regulerings trasé involvert i klinisk anvendelse av disse cellene. Vi undersøkte at et animalsk produkt fritt kulturmedium, for eksempel EpiLife var egnet for vedlikehold og utvidelse av hAECs. Imidlertid er det nødvendig å optimalisere vekstfaktorkonsentrasjoner for å oppnå økt vekstrater for slike celletype. Spørsmålet om celle tilslutning under kultur ved anvendelse av en human kollagen-beleggmassen, øker pletteringseffektiviteten. Men etter langvarig eXposure til enzymatisk fordøyelse plating effektivitet vil være sub-optimal.
Oppsummert har denne protokollen blitt utviklet for å lette isolasjon og kultur av menneskelige amnion epitelceller (hAECs) ved hjelp av animalske produkt-free reagenser i samsvar med gjeldende Good Manufacturing Practices (cGMP) retningslinjer. Fordelen med denne metoden i forhold til alternative isoleringsmetoder, er at disse celler kan isoleres, karakteriseres, kryopreservert og dyrket uten risiko for å levere potensielt skadelige animalske patogener for mennesker, og samtidig opprettholde egnede celleutbytte, viabilities og vekstpotensial. For forskere flytter fra prekliniske dyrestudier til kliniske studier, vil disse metodene sterkt akselerere regulatorisk godkjenning, redusere risiko og forbedre kvaliteten på deres terapeutiske cellepopulasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
