Introduction
Celler som härrör från perinatala källor, såsom moderkakan, placenta membran, navelsträng och fostervatten har väckt uppmärksamhet från forskare och kliniker som en potentiell källa till celler för regenerativ medicin 1,2. Anledningen till detta intresse är att dessa celltyper alla besitter en viss grad av plasticitet och immunmodulerande förmåga 3, egenskaper som är grundläggande för deras potentiella terapeutiska tillämpningar.
hAECs är en heterogen epitelial befolkning som kan härledas från termin eller prematur amnion membran 4, ger en riklig potentiell källa till regenerativ cellmaterial. De egenskaper som gör hAECs talande som en cellulär terapi inkludera deras multipotens, låg immunogenicitet, och anti-inflammatoriska egenskaper. hAECs har visat sig vara mycket multi både in vitro och in vivo, förmåga att differentiera till mesodermala härstamningar (cardiomyocytes, myocyter, osteocyter, adipocyter), endodermala härstamningar (pankreasceller, leverceller, lungceller) och ektodermala härstamningar (hår, hud, neurala celler och astrocyter) 5-10.
Betryggande, trots deras multipotens hAECs inte verkar antingen bilda tumörer eller främjar tumörutveckling in vivo. Dessutom hAECs är också immuna privilegierade, som uttrycker låga nivåer av klass II humana leukocytantigener (HLA) 8. Denna fastighet ligger bakom sannolikt deras förmåga att undgå immunavstötning efter allogen och xenogent transplantation, som visats i studier med immunkompetenta apor, kaniner, marsvin, råttor och grisar 11-13. hAECs visa potent immunmoduler och immunosuppressiva egenskaper och därmed erbjuda betydande praktiska fördelar för potentiella kliniska tillämpningar inom autoimmun sjukdom terapi. hAECs tros utöva immunomodulerande funktioner på både medfödda och adaptiva immunsystem. Påe av de mekanismer som föreslås, är genom utsöndring av immunmodulerfaktorer 14.
Aktuella tillämpningar av hAECs i prekliniska djurmodeller inkludera behandling av stroke, multipel skleros, leversjukdom, diabetes och kroniska och akuta lungsjukdomar. Forskare har visat intresse för att använda hAECs att behandla post-stroke hjärninflammation på grund av deras unika egenskaper. Det finns bevis för att hAECs kan passera blod-hjärnbarriären, där de kan ympas, överleva i upp till 60 dagar, differentiera till neuroner, minskar inflammation och främjar regenerering av skadad vävnad från centrala nervsystemet i djurmodeller av neurologiska sjukdomar 15.
hAECs erbjuder möjligheten att rikta och vända flera patologiska vägar som bidrar till utveckling och progression av multipel skleros. Till exempel, är ett resultat av prekliniska djurstudier tyder på att hAECs är starkt immunsuppressiv ochkan potentiellt inducera perifer immuntolerans och vända pågående inflammatoriska reaktioner. hAECs har också visat sig ha kapacitet att differentiera till neurala celler in vivo och öka endogen neuroregeneration genom utsöndring av ett brett spektrum av neurotrofa faktorer 16.
Mänskliga och gnagare amnion epitelceller har redan visat sin terapeutiska effekt vid behandling av leversjukdom i djurmodeller. I en koltetraklorid skador induktion modell av leversjukdom, HÅEC transplantation leder till inympning av livskraftiga hAECs i levern, tillsammans med minskad hepatocyte apoptos, och minskad leverinflammation och fibros 17.
hAECs kan stimuleras till uttryckta pankreas faktorer, inklusive insulin och glukostransportörer. Flera studier har undersökt potentialen för hAECs att återställa blodglukosnivåer i diabetiska möss 18. I möss som fickhAECs, både djurens kroppsvikt och blodglukosnivåerna sjunkit till normala nivåer efter injektion av celler. Dessa studier presentera starka argument för att använda hAECs för behandling av diabetes mellitus.
hAECs har en erkänd roll i förebyggande och reparation av experimentell akut och kronisk lungskada både vuxna och neonatala modellerna 19. Dessa studier fann att hAECs differentierar in vitro till funktionellt lungepitelceller som uttrycker multipla lungassocierade proteiner, inklusive cystisk fibros transmembran (CFTR), jonkanalen som är muterad i patienter med cystisk fibros 20. Dessutom, när hAECs levereras till den skadade vuxna och neonatal lunga, de utövar sina reparativa effekter via modulering av värdimmunceller, minskar lung leukocyter rekrytering, inklusive neutrofiler, makrofager och lymfocyter 21-23.
Med tanke på deras överflöd,säkerhetsstatistik och beprövade kliniska tillämpningar för flera sjukdomar, kliniska prövningar med hAECs är oundvikligt. Med målet att påskynda överföringen av HÅEC terapier i klinisk-prövningar utvecklade vi metoder för att isolera, cryopreserve och kultur hAECs på ett sätt som lämpar sig för kliniska prövningar, med hjälp av animalieprodukter fria reagenser i enlighet med gällande god tillverkningssed (cGMP) riktlinjer .
Vi bygger detta protokoll en tidigare publicerad protokoll som vi använde framgångsrikt för att isolera hAECs använder animaliska reagenser 6. Vi ändrade det ursprungliga protokollet att ersätta animaliska produkter med animaliskt produktfria reagenser, och efterföljande optimering utfördes för att optimera cellutbyte, livskraft och renhet. Vårt mål var att utveckla ett protokoll som skulle uppfylla de rättsliga normer för cell tillverkning för kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: placentae bör samlas från Singleton friska graviditeter, med en förkärlek för långsiktiga valbara kejsarsnitt. Skrivet bör informerat samtycke ges för insamling av deras moderkakan. Din relevanta humana forskningsetisk kommitté bör godkännas all insamling och användning av mänskliga vävnader.
1. Isolering av amnion epitelceller
- Placera moderkakan på en steril yta inom en klass II biologiskt säkerhetsskåp.
- Använda sterila härvor balanserad saltlösning (HBSS), tvätta så mycket blod som möjligt från moderkakan ytan och membran.
- Med moderkakan placerad med navelsträngen vänd uppåt, mekaniskt separera den yttre kanten av amnion och chorion membran.
- När separerade, skala manuellt amnion membran från chorion membranet i moderkakan, som arbetar runt kanten på membranet, mot navelsträngen.
OBS: Var careful att avlägsna eventuella bitar av förorenande chorion membranet från amnion. - Använda steril sax, klippa amnion membranet ca 2 cm från basen av navelsträngen och placera det i en 500 ml förseglade behållare innehållande 250 ml HBSS.
- Tvätta grundligt genom att skaka den förseglade flaskan innehållande amnion membranet.
- Ta amnion membran från uppsamlingsbehållaren med hjälp steril pincett, och plats i en 15 cm petriskål.
- Skär amnion membran i bitar ca 5 cm långa (när den hålls vertikalt med pincett), kasta blodiga eller sönderrivna.
- Placera i en 500 ml förseglade behållare och tvätta med 250 ml HBSS ungefär 3-5 gånger eller tills amnion membranet blir genomskinlig utan förorenande blod.
OBS: Alla nuvarande blod kan minska effektiviteten i den enzymatiska smälta lösningen. - Överför alla bitar av amnion membran i en behållare som innehåller 50 ml av den enzymatiska smälta lösningen, var noga med attminimera överföring av HBSS.
- Inkubera amnion bitar i enzymatisk smälta lösningen i ett vattenbad eller varmt rum vid 37 ° C under 15 min med försiktig omrörning för att avlägsna eventuell kvarvarande blod.
- Ta bort de amnion membran bitar från den enzymatiska smälta lösningen och häll i en ny steril behållare.
- Lägg 100 ml färsk enzymuppslutningslösningen till amnion membranet och inkubera vid 37 ° C under 60 min i ett vattenbad eller varmt rum med försiktig skakning (första spjälkning).
- Ta bort amnion membran bitar och placera i nya container ta hand för att låta den enzymatiska smälta lösningen rinna ur varje del av membran.
NOTERA: Detta kan uppnås genom att dra amnion bitar längs insidan kanten på behållaren. - Tillsätt 100 ml rent enzymatisk smälta lösning på amnion membran bitar och inkubera 60 min i ett vattenbad eller varmt rum vid 37 ° C med försiktig skakning (andra matsmältningen).
- Passera cell suspensipå från steg 1,14 genom ett 70 pm filter och centrifugera vid 1000 xg under 10 min.
- Avlägsna och kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 4 ml HBSS innehållande 1 mg / ml sojabaserade enzymhämmare. Pipetten lätt upprepade gånger med en 1 ml pipett för att erhålla en enkelcellsuspension.
OBS: I det här skedet celler kan lämnas på is tills celler från andra sammandraget är i samma skede av bearbetningen. - Ta bort amnion membran bitar och placera i nya container ta hand för att låta den enzymatiska smälta lösningen rinna ur varje del av membran.
NOTERA: Detta kan uppnås genom att dra amnion bitar längs insidan kanten på behållaren. - Passera cellsuspensionen från steg 1,18 genom ett 70 pm filter och centrifugera vid 1000 xg under 10 min.
- Avlägsna och kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 4 ml HBSS innehållande 1 mg / ml sojabaserade enzymhämmare. Pipetten lätt upprepade gånger med en 1 ml pipette att erhålla en enkelcellsuspension.
- Pool celler från de två digere eller alternativt hålla celldigere separerade tills efter celltal.
OBS: Detta förhindrar blandning av potentiellt låga lönsamhets celler med hög lönsamhetsceller. - Lägg HBSS till en slutlig volym på 10-20 ml och utföra celltal använder trypanblå att mäta lönsamheten.
- Bekräfta epitelcellens fenotypen genom flödescytometri. Smink lämpliga drinkar antikropps använda anti-EpCAM-PE (1: 2 utspädning) anti-CD90-PeCy5 (1: 250) och anti-CD105-APC (1: 100) i HBSS.
- Resuspendera en delmängd av celler från en eller båda digere i antikropps cocktail i en koncentration av 25 x 10 6 celler / ml.
- För flödescytometri, bets 1 x 10 6 celler med cocktails antikropps innehåller isotypkontroller (t.ex.. IgG 1 isotypkontroll-PE + anti-CD90-PeCy5 + anti-CD105-APC). Håll ~ 1 x 10 6 celler ofärgade för flödescytometerns set-up.
- Inkubera cellerna i antikroppcocktails på 4 ° C under 60 min.
- Tvätta cellerna 3x i HBSS och återsuspendera vid 5 till 10 miljoner celler per ml för flödescytometri.
- Utför flödescytometri och notisresultat. Renheten av cellisolat (andelen EpCAM positiva och CD90 / CD105 negativa celler) förväntas vara 90-95% och <1% respektive.
- Ställ åt sidan ett lämpligt antal celler för att testa för lämpliga kvalitetskontroll eller släpp kriterier som bestäms av slutliga ansökan.
OBS: Detta kan innefatta sjukdom / virusscreening, eller annan säkerhet eller biologiska kriterier. - För de återstående cellerna, följ frysförvaring protokollet, eller alternativt placera direkt i kultur (direkt till kultur steg 3,6).
2. Kryokonservering av hAECs
- Bestäm antalet celler och livskraft använder flödescytometri data eller manuell räkning med trypanblåttuteslutning.
- Centrifugera vid 700 xg under 5 minuter.
- Resuspendera cells på 1-10 miljoner celler per ml i animalisk produkt fria frysförvaring medier.
- Pipettera en lämplig volym av celler in O-ringade kryobevarande ampuller och placera i en kontrollerad hastighet frysapparat där kylning inträffar vid ungefär 1 ° C / min tills -80 ° C uppnås.
- Överför flaskor i flytande kväve för långtidsförvaring.
3. Upptining och kultur Cyropreserved hAECs
- Ta bort frysförvaring flaskor från flytande kväve och placera på is.
OBS: För överföring endast - fortsätt snabbt till nästa steg. - Tina kryokonservering flaskorna snabbt vid 37 ° C tills endast en liten bit (~ 5 mm x 5 mm) av is återstår.
OBS: Det är viktigt att cellen lösningen inte värms för att reducera de toxiska effekterna av DMSO i kryokonservering media. - Späd kryobevarande media 10-faldigt med kall (~ 4 ° C) serumfritt medium, tillsatt droppvis i en lämplig storlekd rör eller behållare.
- Centrifugera vid 700 xg under 5 min vid RT.
- Resuspendera i serumfritt medium, till en ungefärlig koncentration av 1 miljon celler per ml. Bestäm antalet celler och livskraft använder automatiserad eller manuell räkning med trypanblåttuteslutning. Förväntad bärkraft efter upptining blir 5-10% mindre än före frysförvaring livskraft.
- Tavla celler på standard cellodling behandlade plastartiklar, eller alternativt använda typ I-kollagen för att belägga kulturytor.
- För typ I kollagen beläggning följa protokollet nedan
- Förbered syralösligt typ I kollagen från human placenta (15 mg kollagen med 25 ml avjoniserat vatten och 50 ^ il isättika).
- Täck bägaren med Parafilm och rör om försiktigt vid 37 ° C tills kollagensträngar är upplösta.
- Sterilfiltrera kollagenlösning med användning av ett 0,22 pm filter.
- Späd den filtrerade kollagen lager 1:10 med avjoniserat vatten. Denna utspädda lager är arbets concentration lösning för beläggning av plast och membranytorna.
- Kollagen coat plast, glas och membranytor för 2 h vid RT vid 37 ° C, eller O / N vid 2-8 ° C.
- Avlägsna överflödig vätska från den belagda ytan, och låt det torka O / N.
- Skölj med sterilt vävnadskultur grade vatten eller HBSS innan införa celler och medium.
- Plate hAECs vid en densitet av 25.000 celler / cm 2 i serumfritt medium och tillåta fastsättning inträffa för 72-96 timmar.
- Efter fastsättning, byta media genom att försiktigt aspirera och ersätts med en lämplig volym av serumfritt medium var 2-3 dagar.
- Passage celler använder protokollet nedan
- Aspirera cellodlingsmedia och tvätta med 1x volym sterilt HBSS
- Lägg 1x volym av enzymatisk smälta lösning och inkubera under 5-15 minuter, eller tills celler observeras loss från cellodlingsytan.
- Samla enzymatisk smälta lösning innehållande celler, säkerställer ceLLS lösgörs från cellodlingsytan genom att upprepade gånger pipettera den enzymatiska lösningen av spjälkat mot cellodlingsytan
- Centrifugera vid 700 xg under 5 minuter.
- Resuspendera cellpelleten i en lämplig volym av HBSS innehållande 1 mg / ml sojabaserad enzyminhibitor. Pipetten lätt upprepade gånger med en 1 ml pipett för att erhålla en enkelcellsuspension.
- Lägg serumfritt medium till en ungefärlig koncentration av 1000000 celler / ml. Bestäm antalet celler och livskraft använder automatiserad eller manuell räkning med trypanblåttuteslutning.
- Plate hAECs vid en densitet av 25.000 celler / cm 2 i serumfritt medium och fortsätta med standardodlingsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
När detta förfarande följs korrekt, bör förväntas en genomsnittlig avkastning på 120 miljoner hAECs, med ett typiskt intervall på 80-160 miljoner celler. Från dessa utbyten, kan förväntas en genomsnittlig viabilitet av 83 ± 4%. Den ökade genomsnittliga avkastningen och något lägre lönsamhet i den kliniska metoden kan bero på högre trypsinaktivitet än djur härledda produkten, och kanske också på grund av bristen på serumproteiner. Isolerade hAECs har en genomsnittlig cell ytprofil på 92% EpCAM-positiva celler med <1% CD90, CD105 mesenkymala markör-positiva celler. Dessa markörer valdes på grund av deras specificitet för epitelceller 24,25 och mesenkymala 26 härstamningar respektive. Denna process kan ta ca 4-5 timmar att slutföra (Figur 1).
Kryokonservering kräver 20-60 min beroende på antalet flaskor och slutlig cellutbyte. Vi har tidigare testat en rad frysförvaring medier och hittadeatt många djurproduktfria medier utför lämpligt, men den optimala DMSO-koncentrationen är ca 5-10%. Normalt kan man förvänta sig att lönsamheten efter upptining vara 5-10% mindre än före frysförvaring livskraft, och denna förlust kan vara betydligt större för den oerfarne användaren (Figur 2).
Cellodling kan utföras med hAECs att möjliggöra karaktärisering, differentiering, eller annan specifik in vitro förfaranden. Dessa celler fäster initialt till cellytor med en verkningsgrad på 50-80% (personlig observation). Detta ökar till 70-90% med påföljande passager. Attachment kan ökas med hjälp av ytbeläggningsmaterial såsom kollagen typ I, eller liknande produkter. hAECs behålla sin epitelial fenotyp i serumfritt odlingsmedier (Figur 3). Vi har funnit betydande förändringar i cellytmarkör profiler efter upprepad passage. Dessutom efter ungefär fem passager hAECs kan either når åldrande, eller gå igenom morfologiska förändringar som överensstämmer med epitelial till mesenkymala övergång. Efter upprepad passage, hAECs upprätthålla en normal karyotyp, långa telomerlängden och cellcykelfördelning. Dessa egenskaper indikerar en låg risk för transformation eller tumorigenicitet. Förutom att besitta immun reglerande och anti-inflammatoriska egenskaper, har hAECs visat sig vara mycket multi in vitro och in vivo, differentiera till cellinjer representativa för de tre primära groddblad (Figur 4).
Figur 1:. Förväntad cellutbyte, livskraft och renhet för klinisk isolering protokoll Liknande cellutbyten och livskraft kan uppnås med hjälp av djurprodukt fria reagens jämfört med standarddjurproduktinnehållande metoder. En typisk isolering bör vara> 90% EpCAM och <1% CD90 / CD105 positivaceller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:.. Post tö livskraft och metabolism för serum innehållande och serumfria frysförvaring media Jämfört med FBS innehållande 10% DMSO, kommersiellt tillgängliga animalieprodukter fria frysförvaring medier uppvisade liknande eller ökad efter upptining livskraft och metabolism Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: Typisk infästning och tillväxtprofilen av hAECs i serumfritt och seruminnehållande cell culTure medium. Animal produktfria odlingsmedier visade lämplig cellbindning, spridning och underhåll av epitelial fenotyp. Emellertid vidareutveckling av serumfria medier krävs för att uppnå likvärdiga resultat som seruminnehållande medier. Skalstrecken representerar 500 ^ m.
Figur 4:. Multipotenta differentiering av hAECs Vid tidig passage, har hAECs visats att differentiera till multipla cellinjer representativa för de tre primära groddblad. Dessa härstamningar innefattar, men är inte begränsat till; neuroner, hår och hudceller, lungepitel, cardiomyocytes, hepatocyter, pankreasceller, osteocyter och adipocyter. (Figur anpassad från 27)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera kritiska parametrar som kan ha en betydande inverkan på framgången för denna metod. Förvaring av moderkakan eller amnion för upp till 3 timmar före isolering av hAECs kan vara önskvärt för logistiska eller schemaläggning ändamål, men det rekommenderas att vävnaden behandlas så snart som möjligt. Om vävnaden skall lagras, rekommenderas att lagring utföras efter dissektion och tvättning av amnion membranet. Amnion kan lagras i sterila HBSS innehållande antibiotika vid 4 ° C, men cellviabiliteten kan minska med förlängd lagringstid. Vi, och andra har hittat variabilitet i cellutbyte och livskraft, och för att minimera denna variabilitet rekommenderas att moderkakan samlas in från friska sikt födslar, helst levereras av kejsarsnitt.
Vi fann att förorening av amnion membranet med blodceller kommer att resultera i hämning av enzymaktivitet och en minskning av cellutbyte. Därförett kritiskt steg i protokollet är noggrann tvättning av placenta och amnion membranet rekommenderas. Det rekommenderas att amnion vävnaden tvättas tills det visas vit / klar att undvika nedströms enzymhämning. Isolering av en relativt homogen population av epitelceller är viktig för testning karakterisering och kvalitetskontroll.
Om låg avkastning, livskraft eller kontamination av cellutbyte med mesenkymala celler sker det finns flera modifieringar som kan utföras för felsökning. Om cellutbyten är låga, är det troligt att enzymatisk aktivitet inhiberades på grund av blod eller serum kontaminering. Det kan lösas med mer noggranna och ytterligare tvättsteg och / eller kasta blodiga eller förorenade amnion bitar. Enzym inkubationstid kan också ökas, men detta kan vara skadligt för cellernas livskraft. Minskad livskraft eller kontaminering med mesenkymala celler kan undvikas genom minskning av digere tiden. Emellertid this kan också minska den totala avkastningen av celler. Tider som sträcker sig från 30 min till 2 tim kan användas för detta protokoll. Dessa tider måste optimeras för önskad cell renhet och totalavkastning / livskraft. En begränsning med denna teknik är att öka cell avkastning eller livskraft kan komma på bekostnad av varandra. Dessutom, serumfria komponenter är närvarande inte är lika effektiva för att upprätthålla cellviabilitet efter exponering för enzymatisk aktivitet.
Celler kan kryokonserveras utan någon större minskning i cellviabilitet eller förlust av metabolismen genom lagring i en temperaturkontrollerad flytande kvävesystem. Detta kan vara allt från en enkel isopropanol fylld frysförvaring enhet till en state-of-the-art kontrollerad hastighet fryssystemet. Såvitt vi vet har den optimala fryshastigheten för hAECs i detta system inte fastställts, men normalskattesatsen på 1 ° C / min resulterar i lämplig underhåll av cellernas livskraft och efter upptining metabolism. Under upptining of kryokonserverade celler, är viktigt att hålla upptining tiden till ett minimum för att minska cell exponering för DMSO. Celler kan fästa och föröka i en lägre takt efter frysförvaring och upptining jämfört med odling nyligen isolerade celler.
För klinisk tillämpning kan det vara önskvärt att odla celler för att öka cellantalet eller för nedströms karakterisering och / eller in vitro-manipulering. Läsare bör förstå hur deras specifika in vitro manipulation kan ändra de regulatoriska involverade i den kliniska tillämpningen av dessa celler. Vi undersökte om att en djurprodukt fritt odlingsmedium såsom EpiLife var lämplig för underhåll och utbyggnad av hAECs. Dock krävs det att optimera tillväxtfaktorkoncentrationer för att uppnå ökad tillväxttakt för sådant celltyp. Frågan om cellvidhäftning under odling genom användning av en human kollagen-beläggningsmatrisen, ökar utstrykningseffektivitet. Men efter långvarig eXposure till enzymatisk spjälkning bordläggning effektiviteten blir suboptimal.
Sammanfattningsvis har detta protokoll tagits fram för att underlätta isolering och odling av humana amnion epitelceller (hAECs) med animalieprodukter fria reagenser i enlighet med gällande god tillverkningssed (cGMP) riktlinjer. Fördelen med denna metod jämfört med alternativa isoleringsmetoder, är att dessa celler kan isoleras, kännetecknad, kryokonserverades och odlades utan risk för att leverera potentiellt skadliga djurpatogener för människor, samtidigt upprätthålla lämpliga cellutbyten, viabilitet och tillväxtpotential. För forskare som flyttar från prekliniska djurstudier till kliniska prövningar, kommer dessa metoder kraftigt påskynda myndigheternas godkännande, minska riskerna och förbättra kvaliteten på deras terapeutiska cellpopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13 cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors - Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel | |||
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean (animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| Anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 - 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| Anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| Anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5 ml graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15 ml falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15 cm Petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70 μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22 μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1 ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200 μl Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20 ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
References
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G. Stem Cells and Regenerative Medicine. Appasani, K. 1, Springer Science and Business Media. 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , John Wiley & Sons, Inc. 119-137 (2013).
