الفسيولوجية تسجيلات وRNA تسلسل الزوائد ذوقي من البعوض الحمى الصفراء<em> الزاعجة المصرية</em
Summary
باستخدام طريقتين لتقدير التعبير الجيني في الزوائد الذوقية الرئيسية للبعوض Aedes aegypti، حددنا مجموعة من الجينات مزعومة الكامنة وراء الاستجابة العصبية لمركبات المريرة ومثير للاشمئزاز، على النحو الذي يحدده الفحص الكهربية.
Abstract
Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.
Introduction
وقد أظهرت مركبات مثل DEET، Picaridin، Citronellal وIR3535 لصد البعوض بشكل فعال، بما في ذلك ناقلات الأمراض المهم الزاعجة المصرية 1،2. نسجل إمكانات العمل من الخلايا العصبية الحسية المرتبطة sensilla الذوقية محددة لتحديد الخلايا المشاركة مع البعوض صد. إلى جانب التسلسل المصب من الجينات التي أعرب عنها في هذه الأنسجة، ونحن قد التعرف على الجينات على الأرجح التوسط في ردود هذه الخلايا من أجل فحص مركبات جديدة لتحسين قدرات صد.
RNA وما يليها هو أداة قوية، لتصبح بسرعة قياسية لتتبع التغيرات الزمانية والمكانية في التعبير الجيني. يحلل RNA وما يليها من الزوائد حسي كيميائي الحشرات واستخدمت أجهزة للكشف عن مستقبلات الجزيئية في العديد من أنواع الحشرات 3-5، وتحسين كبير على التقليدي القائم على PCR البحث الجين بواسطة الجينات 6. الحشرات تمثل الطبقة الحيوان الأكثر تنوعا، قبلsenting العديد من الفرص لدراسة العلاقة بين الجينات والظواهر فريدة من نوعها. ويمكن استخدام تكنولوجيا RNA وما يليها على أي نوع من الأنسجة الحشرات الحية. وبالمثل، تسجيل الكهربية من الخلايا الحسية داخل sensilla الذوقية uniporous لا يمكن أن يتحقق في كثير من أنواع الحشرات المختلفة. الاقتران من هذه التقنيات اثنين يسمح للباحثين لتضييق الجينات مجموعة تشارك في النمط الظاهري حسي كيميائي لوحظ. سوف الأنواع المختلفة تشكل تحديات محددة، ولكن قد تبلغ العلاقة بين جينات مستقبلة حسي كيميائي والتكيف حسي كيميائي. حجم ومورفولوجية حسي كيميائي sensilla هو متغير واستكشاف الأخطاء وإصلاحها قد تتطلب واسعة النطاق عند تسجيل إمكانات العمل للحد من الضوضاء وتحديد إشارات متكررة. تشريح أجهزة حسي كيميائي قد تكون تافهة أو حساسة تستغرق وقتا طويلا، اعتمادا على التشكل وحجم الحشرة. انتعاش عالية الجودة RNA قد تتطلب بعض استكشاف الأخطاء وإصلاحها كذلك، مثل تجنب بعض أصباغ خلالجمع الأنسجة.
بينما يدل على آثار مركبات مضادة للمن خلال التجارب السلوكية غير المباشر والمفيد، وهذا النهج هو الوقت مكثفة واسعة فيما يتعلق بآلية العمل. الكهربية إلى جانب RNA-يليها تسمح للتحليلات أكثر تحديدا من ما يدفع السلوكيات تجنب في الحشرات. مرة واحدة وقد تم التعرف على "أدوات" التمييز الكيميائية في أنواع الحشرات، ومحاولات أكثر تحديدا لتحسين على المواد الطاردة للتعرف ممكنة. ويمكن التعبير عن مستقبلات والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحسية المسؤولة عن هذه السلوكيات heterologously للفحص الكيميائي المباشر. وعلاوة على ذلك، يمكن النمذجة الجزيئية ويتوقع المواد الكيميائية والتي سوف تثير ردود قوية من هذه المستقبلات 7.
قد تكون لقطة من جميع الجينات النشطة في مجموعة ضيقة من الأنسجة حسي كيميائي مفيد أيضا في تحديد جينات مشابهة في الأنواع الأخرى. عن طريق التماثل تسلسل والتعبير سيmilarities، قد شكل الباحثون مجموعة من المستقبلات الجزيئية الأرجح التوسط الردود على المواد الطاردة التي هي فعالة على نطاق واسع على الحشرات. نقدم بروتوكول التالية لمساعدة الباحثين في تفكيك مسارات حسي كيميائي الحشرات وإقناع أكثر الخوض في neuroethology عدم نموذج والحشرات الهامة اقتصاديا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجانب الأكثر تحديا من إمكانات العمل تسجيل من sensilla ذوقي هو الذي يقرر الردود هي "طبيعية"، وعندما تستخدم Sensillum واحدة الذوقية غيض تسجيل أول مرة لأنواع الحشرات معين، فإن العدد الإجمالي والحساسيات من الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية (GRNs) هي غير معروف على الأرجح. ويط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5mL collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
References
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig, , et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
