Introduction
وقد تم تطوير نماذج proteinopathy الخميرة للاضطرابات misfolding البروتين بما في ذلك التصلب الضموري الجانبي (ALS) ومرض باركنسون (PD) 1-3. التعبير عن البروتينات TDP-43 والفتح الرباطي، الذي misfold في مرضى ALS، هي سامة وmislocalize لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 1،2. وبالمثل، فإن التعبير عن α-synuclein (α-SYN)، والذي تورط في PD، غير سامة وmislocalizes لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 3. هذه الميزات ألخص الظواهر في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات 4،5. وبالتالي، نماذج الخميرة توفر منبرا مفيدا لفحص للبروتينات أو الجزيئات الصغيرة التي منع أو عكس هذه الظواهر 2،6-13. ونحن مهتمون في تطوير بروتينات قادرة على عكس التجميع وسمية بسبب TDP-43، الفتح، وα-SYN. ونحن نركز على Hsp104، وهو AAA + البروتين من الخميرة قادرة فريد من تجزئة البروتينات سواء الابالمجاميع غير متبلور أوم واميلويد في الخميرة، إلا أنه لا يوجد لديه نديد البشري 14،15. يتم ضبطها بدقة Hsp104 إلى تفصيل البريونات الخميرة الذاتية وليس لديها سوى قدرة محدودة على تفصيل ركائز المتورطين في أمراض الاعصاب الإنسان، وهو ما لم يصادف عادة 16،17. وبالتالي، فإننا نهدف إلى مهندس إصدارات محسنة من Hsp104 التي تكون قادرة على تفصيل هذه ركائز الإنسان بشكل فعال. للقيام بذلك، ونحن بناء مكتبات كبيرة من Hsp104 المتغيرات باستخدام عرضة للخطأ PCR. هذه المكتبات يمكن عرضه باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy 17. اعتمدنا نهجا المستهدفة المجال إلى بناء وفحص والمكتبات، كما Hsp104 هي كبيرة جدا 17. ركزنا في البداية على المجال المتوسط (MD) من Hsp104 17، على الرغم من نهج مماثلة يمكن استخدامها لفحص المجالات الأخرى. هذه النماذج تمكين الكشف عن النشاط disaggregase مباشرة، بدلا من تقنيات بديلة مثل سطح الشاشة، والتي هي بقيةricted لاستخدامها لمراقبة ملزمة 18.
ويستند بروتوكول لدينا على خطوتين الفرز (الشكل 1). أولا، يتم اختيار المتغيرات Hsp104 التي تقمع سمية الركيزة المرض في الخميرة. للقيام بذلك، وHsp104 المتغيرات وcotransformed من الأمراض المرتبطة الركيزة في Δ hsp104 الخميرة. نحن توظيف Δ hsp104 الخميرة لاستكشاف الفضاء تسلسل Hsp104 في غياب البرية من نوع (WT) Hsp104 17. الأهم من ذلك، حذف Hsp104 لا يؤثر α-SYN، الفتح، أو TDP-43 سمية في الخميرة، والتعبير عن Hsp104 WT يوفر الحد الأدنى الإنقاذ 1،13،17. ثم يتم مطلي الخميرة على حمل وسائل الإعلام للحث على التعبير عن كل من البروتينات. الخميرة إيواء Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية النمو الركيزة تتداول المرتبط المرض للمستعمرة. ويتم اختيار هذه المتغيرات لمزيد من التحليل، في حين أن المستعمرات الحفاظ على المتغيرات التي لا قمع سمية يموت. ومع ذلك،ايجابيات كاذبة هي مشكلة كبيرة في هذه الشاشة. التعبير عن TDP-43، الفتح، وα-SYN شديدة السمية، مما يخلق ضغط انتقائي قوي لظهور المكثفات الوراثية عفوية سمية لا علاقة لها البديل Hsp104 يجري التعبير عنها. وبالتالي، فإننا قد استخدمت شاشة الثانوية التي هي أيضا إنتاجية عالية نسبيا للقضاء على هذه المكثفات سمية غير محددة 17. في هذه الشاشة الثانوية، ويتم التعامل مع الخميرة اختيار 5-Fluorootic حمض (5 FOA) لمواجهة حدد لالبلازميد Hsp104 19. ثم يتم تقييم السلالات لالركيزة (TDP-43، الفتح، أو α-SYN) سمية عن طريق اكتشاف فحص للتأكد من أن يتم استعادة سمية الركيزة بعد فقدان البلازميد Hsp104. وبالتالي، الخميرة التي يتم استعادة سمية في هذه شاشة عرض ثانوية يفترض أصلا سمية قمع بسبب وجود البديل Hsp104. وتتم تسمية هذه الخميرة باسم 'يضرب' ويجب أن يكون البلازميد ثم Hsp104تعافى والتسلسل لتحديد الطفرات في الجين Hsp104 17 (الشكل 1). وينبغي بعد ذلك إعادة تأكيد أي إصابات عن طريق بناء الطفرة بشكل مستقل باستخدام الطفرات موقع الموجه ثم إعادة الاختبار لقمع سمية. التطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول واسعة. باستخدام هذه الأساليب، يمكن فرزهم المكتبات من أي نوع من البروتين للمتغيرات التي تقمع سمية من أي بروتين الركيزة التي هي سامة في الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. مكتبة الجيل
- لبناء مكتبات Hsp104 باستخدام نطاق محدد عرضة للخطأ PCR، أولا تضخيم مجال الاهتمام مع وجود خطأ DNA عرضة البلمرة 20.
- تنقية المنتج PCR عن طريق استخراج الهلام.
- إجراء خطوة التمديد megaprimer باستخدام بروتوكول الطفرات موقع الموجه القياسية: الجمع بين 50 نانوغرام قالب البلازميد، 250 نانوغرام megaprimer، 200 ميكرومتر dNTPs، وعالية الدقة البلمرة DNA العازلة في PCR، وتمييع إلى 50 ميكرولتر الحجم الكلي مع PCR الصف المياه 20 . تشغيل برنامج PCR القياسية.
ملاحظة: الاشعال المحددة المستخدمة سوف تختلف بناء على منطقة معينة من الجين الذي سيتم تضخيمها.- بعد PCR، هضم الحمض النووي قالب الوالدين مع 1 ميكرولتر DPN أنا انزيم التقييد لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
- تحويل مكتبة بواسطة الصعق الكهربائي أو غيرها من الوسائل في ultracompetent E. القولونية وتنقية من قبل miniprep.
ملاحظة: الجيل المكتبةيختلف تستند إلى حد كبير على أهداف تجربة معينة. Hsp104 هو بروتين كبير جدا، لذلك هو غير عملي بطريقة عشوائية الجين بأكمله، وهو ما يدفعنا إلى الاستفادة من الخطأ نطاق محدد عرضة PCR. بالإضافة إلى ذلك، فإن هيكل Hsp104 تزال غير مفهومة تماما، مما يجعل من تصميم المكتبات موجها تحدي 21. المكتبات يمكن بناؤها باستخدام نهج موجهة أو عشوائية لالطفرات، مع التقييد الوحيد هو أن القالب البلازميد العمود الفقري يجب أن يحتوي على الجين URA3 للسماح لمدة 5-FOA مكافحة الاختيار على وسائل الإعلام الدكستروز.
2. التحول من مكتبة Hsp104
- دمج الركيزة المصاحبة للمرض في W303aΔ hsp104 الخميرة باستخدام خلات الليثيوم القياسية / PEG التحول بروتوكول 22. حدد المستعمرات واحد وفحص لهم لسمية لعزل سلالة مع سمية عالية للمرض الركيزة 23 المرتبطة بها.
ملاحظة: استخدم سلالة وايزولا متكاملةالشركة المصرية للاتصالات مستعمرة واحدة لضمان التعبير على قدم المساواة في جميع الخلايا. استنساخ الركيزة المرض إلى البلازميد السماح دمج الجين تحت أي علامة أخرى من اليوراسيل (نستخدم الحامض الاميني) ومكتبة Hsp104 في البلازميد pAG416GAL (اليوراسيل علامة) 24. للسماح لمدة 5-FOA counterselection، وضمان أن يتم التعبير عن مكتبة من البلازميد مع علامة اليوراسيل. ويمكن أيضا أن تستخدم سلالات الخميرة الأخرى. لاحظنا مماثل النمط الظاهري سمية قمع باستخدام W303a وBY4741 سلالات الخميرة في كل وزن وΔ الخلفيات hsp104 (MEJ وشبيبة، والملاحظات غير منشورة). - تحويل مكتبة Hsp104 إلى هذه السلالة باستخدام نفس الليثيوم خلات / PEG التحول بروتوكول 22. توسيع نطاق التحول مناسب للحفاظ على الفضاء تسلسل المكتبة والحفاظ على حجم مكتبة المتوقعة.
- لوحة الخليط التحول إلى noninducing، لوحات منتقاة (مثل SD-صاحب-أورا) باستخدام لوحات كافية لضمان نمو عدد كبير من المستعمرات. استخدام أطباق بتري كبير (150 ملم) للحد من عدد من لوحات الحاجة. يتعافى transformants يسمح باستخدام لوحات كفاءة التحول ليتم تقييمها.
- تحويل Hsp104 WT والضوابط السلبية ناقلات بالتوازي.
3. فحص لقمع Proteotoxicity
- غسل المستعمرات من لوحات باستخدام رافينوز تستكمل وسائل الاعلام التسرب (مثل SRaff-صاحب-أورا). استخدام ماصة المصلية وتطبيقها خشبية معقمة لتخفيف المستعمرات من لوحات. نقل يغسل السائل إلى 50 مل أنبوب مخروطي ودوامة تماما لفصل أي كتل من الخلايا. تمييع إلى ثقافة غائم قليلا، OD 600 ~ 0.025.
ملاحظة: هنا يخدم رافينوز لتخفيف الخلايا من القمع بوساطة الجلوكوز من الاستقراء، وبالتالي فتيلة الخلايا للبوساطة الحث الجلاكتوز. - تنمو ثقافة المخفف بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام التسرب رافينوز مع اهتزاز عند 30 درجة مئوية. نمو Hsp104 WT والضوابط ناقلات بالتوازي.
- في صباح اليوم التالي، لوحة مجموعة من تركيزات على اللبن الفردية (مثل SGal-صاحب-أورا) لوحات (1 ميكرولتر إلى 2 مل تتركز ثقافة في 400 ميكرولتر إجمالي حجم). سوف تصفيح مجموعة واسعة من تركيزات ضمان أن طبق سيكون لها مستعمرات واحدة. التركيز الفعلي المطلوب يعتمد على سمية الركيزة المرض من الاهتمام.
- تطبيع ناقلات والثقافات Hsp104 WT إلى OD 600 من مكتبة ولوحة أحجام متساوية لمقارنة نمو مكتبة نسبة إلى الضوابط.
- لتقييم اختيار صرامة، لوحة المكتبة على الجلوكوز (قمع) وسائل الاعلام. احتضان لوحات لمدة 2-3 أيام عند 30 درجة مئوية، حتى تظهر مستعمرات (الشكل 2). تقييم المستعمرات الناتجة عنها، ومقارنتها مع الضوابط.
ملاحظة: غالبا ما يتم الحصول على كل من المستعمرات الكبيرة والصغيرة، ولكن لا علاقة بين حجم مستعمرة والعملويلاحظ ivity. فحص هذه الضربات المحتملة باستخدام تقنية مكافحة اختيار 5-FOA (الخطوة 4) للحد من ايجابيات كاذبة ترحيلها إلى التسلسل.
4. 5-FOA Counterselection والإكتشاف للقضاء على ايجابيات كاذبة
- مسحة من المستعمرات واحدة من نسختين على مزدوج واحد وسائل الاعلام التسرب (مثل SD-صاحب-SD-أورا وصاحب لوحات) وتنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. كرر مع النواقل وHsp104 WT الضوابط. طلي على SD-صاحب قبل 5 FOA يزيد من كفاءة الخطوة 5 FOA عن طريق زيادة احتمال أن الخلايا ستكون قد فقدت البلازميد Hsp104 عندما ومطلي انهم على 5 FOA.
- للحيلولة دون لوحات من الجفاف، والتفاف على لوحات في بارافيلم صاحب أورا-SD-وتخزينها في 4 درجات مئوية أثناء أداء الشاشة 5-FOA. في نهاية المطاف يمكن استخدام هذه اللوحات لتسلسل.
- خط المستعمرات من لوحات لالمستعمرات واحد على لوحات 5 FOA (YPD وسائل الاعلام + 1G / L 5-FOA)، واحتضان لمدة 1-2 أيام في 30 و صاحب SD-# 186؛ C حتى تظهر المستعمرات واحد. هنا، يتم تحويل 5 FOA إلى منتج سام (5 fluorodeoxyuridine) في الخلايا التي تحتوي على الجين URA3. وبالتالي، فإن أي خلايا لا تزال تؤوي البلازميد Hsp104 يموت.
- خط المستعمرات واحدة من لوحات 5 FOA في نسختين على SD-SD-أورا وصاحب لوحات. بلغت اختبار 3 مستعمرات لكل لزيادة احتمال أن مستعمرة واحدة على الأقل لكل ضرب سيكون قد خسر البلازميد Hsp104. احتضان لمدة 1-2 أيام عند 30 درجة مئوية. المستعمرات التي فقدت البلازميد Hsp104 سوف تنمو على SD-صاحب لوحات ولكن ليس SD-أورا لوحات.
- زراعة السلالات التي فقدت البلازميدات Hsp104 لاكتشاف المقايسات. زراعة سلالات من التشبع في رافينوز التسرب وسائل الإعلام (على سبيل المثال، صاحب SRaff) في 96 DeepWell 2 مل لوحات بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز. تأكد من تضمين سلالات السيطرة 5-FOA المعالجة.
- إعداد لوحات لاكتشاف الفحص. باستخدام ماصة الأقنية، قسامة 200 ميكرولتر رافينوز التسرب وسائل الإعلام (على سبيل المثال، صاحب SRaff) للبئر من 96 لوحة جيدا، حجز الأعمدة 1 و 7 للثقافات أنيق. قسامة 250 ميكرولتر من كل واحد من 16 الثقافات المشبعة في الأعمدة 1 و 7 من لوحة.
- متسلسل تمييع الثقافات 5 أضعاف في كل عمود من لوحة، والخلط تماما مع ماصة الأقنية. إزالة 50 ميكرولتر من ثقافة المخفف من أعمدة 6 و 12 لضمان الحجم النهائي من كل بئر 200 ميكرولتر. هذا أمر ضروري لضمان حتى بقع دم.
- باستخدام أداة المكرر 96-الترباس (FROGGER)، بقعة الثقافات في نسختين على SD-صاحب وSGal-صاحب وحات. احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
- لتحديد تسلسل السلالات التي تظهر سمية على SGal-صاحب لوحات مماثلة لتلك الضوابط. تجاهل ايجابيات كاذبة سلالات كما أن ليست كما سامة مثل الضوابط. 5-FOA هي أيضا في كثير من الأحيان السامة من تلقاء نفسها، لذلك تجاهل السلالات التي تظهر وجود خلل في النمو SD-صاحب لوحات أو أن المعرض أكبر بكثير من سمية الركيزة المرض وحده (
5. تسلسل Hsp104 المتغيرات التي كتبها مستعمرة PCR
- كشط ~ 10 ميكرولتر من الخميرة لوحات SD-صاحب-أورا في 3 ميكرولتر 20 ملي هيدروكسيد الصوديوم في أنابيب الشريط PCR وليز الخلايا عن طريق تجميد ذوبان الجليد. وضع أنابيب الشريط في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو في النيتروجين السائل، ثم احتضان عند 99 درجة مئوية في thermocycler لمدة 10 دقيقة. تخفيف الضغوط على 100 ميكرولتر مع PCR المياه الصف.
- إعداد ردود الفعل PCR: قالب PCR 5 ميكرولتر 0.5 ميكرولتر من 100 ميكرومتر لكل التمهيدي، 0.5 ميكرولتر dNTPs 10MM، 0.25 البلمرة DNA ميكرولتر العازلة في PCR، وجعل ما يصل إلى 25 ميكرولتر الحجم الكلي مع PCR المياه الصف. تصميم الاشعال لتضخيم المنطقة العشوائية بالإضافة إلى ما يقرب من 100 شركة بريتيش بتروليوم على حد سواء. تقليل حجم المنطقة تضخيمها إلى زيادة احتمالات التضخيم ناجحة. تشغيل برنامج PCR القياسية.
- تحليل العينات بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام لتأكيد التضخيم للمنتج PCR من الاحجام المناسبةه. تكرار PCR إذا أي منتج موجود.
ملاحظة: فشل PCR هو عادة بسبب الكثير من الخميرة المستخدمة في الخطوة 5.1. - تحضير عينات للتسلسل الحمض النووي. إزالة الاشعال PCR إما عن طريق PCR تنقية أو استخدام منتج PCR تنظيف كاشف مثل نوكلياز خارجية الأول والروبيان إنزيم الفوسفاتيز القلوية (ExoSAP-IT) للحط من الحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل. هذا كاشف يحط إنزيمي الاشعال الفردية وdNTPs، والسماح لأعلى إنتاجية.
- تسلسل المنتجات PCR. تأكد من تحليل دقيق الاستشرابية تسلسل للطفرات. يمكن ملاحظة تحولات على شكل مزيج من اثنين من النيوكليوتيدات في موقع معين (الشكل 4)، والخميرة غالبا ما تؤوي البلازميدات متعددة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لقد شيدت مكتبة من المتغيرات العشوائية Hsp104 في المجال المتوسط وذلك لفحص قمع TDP-43 سمية. تحولت المكتبة ومطلي على الجلوكوز والجلاكتوز لوحات (الشكل 2) لتقييم صرامة من الشاشة. وقد تم اختيار المستعمرات واحد وتم اختيار السلالات مضادة باستخدام 5-FOA للقضاء على البلازميد Hsp104. ثم تم تقييم هذه السلالات لتأكيد أن سمية كان من المقرر أن TDP-43 وحدها، من دون متغيرات Hsp104. وأظهرت فحوصات اكتشاف مجموعة فرعية من المتغيرات المختارة في الشاشة الأولية التي من المستعمرات 4 المختارة، 2 عرض Hsp104 بوساطة قمع TDP-43 سمية (1)، كانت كاذبة إيجابي، وعرض 1 تعزيز سمية بعد العلاج 5-FOA (الشكل 3). وكان 2 ثم يضرب الحقيقية متسلسلة من قبل مستعمرة PCR لتحديد الطفرات النطاق المتوسط (الشكل 4). مرة واحدة وقد تم تحديد هذه الطفرات، شيد الطفرة Hsp104 من جديد في البلازميد Hsp104 الوالدين من قبل الطفرات موقع الموجه لتأكيد سمية قمع. وقد أكد المتغيرات المحدد باستخدام هذه الأساليب في وقت لاحق لقمع تجميع في الخميرة، واضحة في المجاميع بريفورميد فحوصات البيوكيميائية، وقمع التنكس العصبي الدوبامين في C. ايليجانس نموذج PD 17.
الشكل 1: تدفق البياني لعزل المتغيرات Hsp104 potentiated المكتبات Hsp104 (علامة URA3، GAL1 المروج) تتحول في الخميرة تحتوي على ركائز المرض (علامة HIS3، GAL1 المروج) وفحص المكثفات لسمية بواسطة الطلاء على وسائل الإعلام تحريض. ثم يتم فحص ضربات محتملة مرة أخرى باستخدام خطوة counterselection 5 FOA للقضاء على المكثفات سمية غير محددة. المتغيرات المختارة في هذه الخطوة الثانية بعد ذلك التسلسل من قبل مستعمرة PCR. أ href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغا"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم مطلي الكشف عن المكثفات سمية الخميرة cotransformed مع pAG303GAL-TDP-43 والمكتبة pAG416GAL-Hsp104 على الجلوكوز (قمع) أو اللبن (تحملها) وسائل الإعلام: الرقم 2. TDP-43 هو شديدة السمية، لذلك قليل جدا من المتغيرات Hsp104 قادرة على قمع هذه السمية، وهذه الشاشة هي صارمة جدا. ويتم اختيار المستعمرات واحدة كما يضرب من لوحة اللبن الثانوية للشاشة 5-FOA. كلاهما عادة الحصول على المستعمرات الكبيرة والصغيرة، لكننا لم يلاحظ أي الاتجاهات التي تملي كيف حجم مستعمرة يرتبط النشاط.
s.jpg و"/>
الرقم 3: 5 FOA الشاشة الثانوية الخميرة تعامل مع 5-FOA لمواجهة حدد لالبلازميد Hsp104 تم تقييمها من قبل اكتشاف الفحص. كانت تزرع سلالات في SRaff-صاحب وسائل الإعلام، المخفف متسلسل 5 أضعاف، ورصدت في نسختين على SD-صاحب وSGal-صاحب وحات. Hsp104 A503V هو ضرب صحيح أننا قد تحققت سابقا وتظهر هنا كعنصر تحكم مع ناقلات وحدها 17. الصفوف 3 و 4 هي ضربات المكتبة التي تحتفظ TDP-43 سمية فقدان التالية من القامع Hsp104. الصف 5 يظهر إيجابية كاذبة، حيث TDP-43 لم تعد سامة، ولذلك فإن سمية القامع غير محدد موجودا. الصف 6 يظهر السلالة التي هي أكثر سمية من TDP-43 هو عادة، وربما يعود ذلك إلى 5 FOA سمية. لا يزال من الممكن التسلسل هذه السلالة ولكن قد لا تكون ضربة صالح.
الرقم 4. شرجيyzing النتائج التسلسل. وغالبا ما يحتوي على الخميرة مختارة البلازميدات متعددة. لذا، وبعد تسلسل المنتجات PCR مستعمرة، يجب توخي الحذر لضمان عدم التغاضي أي طفرات في الاستشرابية. في هذا اللوني، يمكن التغاضي اثنين من الطفرات المحتملة (الرمز بواسطة *). في المقام الأول، هناك خليط من A و T و في الثانية، وهي مزيج من T و C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم نهجنا لعزل potentiated Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية ركائز المرتبط المرض باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy. باستخدام هذا النهج، مكتبات كبيرة من المتغيرات يمكن عرضه في إنتاجية عالية، والحد الوحيد هو في عدد من المتغيرات التي تمر على الشاشة الثانوية 5-FOA. قبل تنفيذ هذه الخطوات في 96 شكل جيد، ونحن فحص روتيني ما يصل الى 200 ضربات في وقت في الخطوة 5-FOA على مدى 1-2 أسابيع. وعدد الزيارات التي تم الحصول عليها أثناء الفحص خطوة أولية تختلف اعتمادا إلى حد كبير على سمية الركيزة وماكياج من كل مكتبة معينة. عندما تسلسل الضربات، فمن الضروري أن نحلل بعناية كل الاستشرابية التسلسل منذ خليط من البلازميدات وعادة ما تكون موجودة في كل خلية.
لاحظنا في بعض الأحيان نسبة كبيرة من Hsp104 WT يجري عزل باسم 'يضرب'. هذا هو الأرجح بسبب وجود عفوية الوراثيةالمكثفات أو نشاط ضعيف جدا. للتحايل على هذه المشكلة، وجدنا أن الفحص في درجات حرارة مرتفعة (على سبيل المثال 34 درجة مئوية) يمكن أن تقلل من نسبة "الزيارات" التي هي Hsp104 WT. ومن الضروري أيضا إعادة استنساخ، أي ضربات متسلسلة لتقييم مستقل لنشاط من أي متغيرات جديدة وضمان بلازميد النقاء. مرة واحدة يتم تحديد الزيارات جديدة، فإنها يمكن تقييم لقمع تجميع في الخميرة ويتميز كيميائيا.
وقد استخدمنا هذه الطرق لعزل potentiated Hsp104 المتغيرات ضد TDP-43، الفتح، وα-synuclein والتحقق منها نشاطهم باستخدام البروتين النقي فحوصات الكيمياء الحيوية 17. في نهاية المطاف، ويمكن استخدام هذه الطرق لفحص البروتين المكتبات ضد أي ركيزة من الفائدة التي هي سامة في الخميرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
