Introduction
Lievito proteinopathy modelli sono stati sviluppati per i disordini di proteine misfolding tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia (PD) 1-3 di Parkinson. L'espressione delle proteine TDP-43 e FUS, che misfold nei pazienti con SLA, sono tossici e mislocalize a formare aggregati citoplasmatici in lievito 1,2. Analogamente, l'espressione di α-sinucleina (α-syn), che è implicato nel PD, è tossico e mislocalizes formare aggregati citoplasmatici in lievito 3. Queste caratteristiche ricapitolano fenotipi in pazienti con questi disturbi 4,5. Così, i modelli di lievito forniscono una piattaforma utile per lo screening di proteine o piccole molecole che impediscono o invertire questi fenotipi 2,6-13. Ci interessa lo sviluppo di proteine che sono in grado di invertire aggregazione e tossicità dovuta al TDP-43, FUS, e α-syn. Ci concentriamo su Hsp104, un AAA + proteine da lievito che è l'unica in grado di disaggregare proteine sia fraggregati amorfi OM e amiloide nel lievito, eppure non ha l'omologo umano 14,15. Hsp104 è finemente sintonizzato per disaggregare i prioni di lievito endogene e ha solo limitata capacità di disaggregare substrati implicati nelle malattie neurodegenerative umane, che non ha mai incontra ordinariamente 16,17. Così, ci proponiamo di progettare versioni avanzate di Hsp104 in grado di disaggregare efficacemente questi substrati umani. A tale scopo, costruiamo grandi biblioteche di Hsp104 varianti mediante PCR soggetto a errori; queste librerie possono essere sottoposti a screening utilizzando i modelli di lievito proteinopathy 17. Abbiamo adottato un approccio dominio mirato alla costruzione di screening e biblioteche, come Hsp104 è molto grande 17. Inizialmente concentrati sul dominio centrale (MD) di Hsp104 17, anche se gli approcci simili possono essere impiegati per lo screening altri domini. Questi modelli consentono lo screening per l'attività disaggregase direttamente, al contrario di tecniche alternative come la visualizzazione di superficie, che è riposoricted da utilizzare per il monitoraggio vincolante 18.
Il nostro protocollo si basa su due fasi di screening (Figura 1). In primo luogo, vengono selezionati varianti Hsp104 che sopprimono la tossicità del substrato malattia in lievito. Per fare ciò, il Hsp104 varianti e le malattie associate substrato sono cotransformed in lieviti Δ Hsp104. Ci avvaliamo di lievito Hsp104 Δ per esplorare Hsp104 sequenza spazio in assenza di wild-type (WT) Hsp104 17. È importante sottolineare che l'eliminazione di Hsp104 non influisce α-syn, FUS, o TDP-43 della tossicità in lievito, e l'espressione di Hsp104 WT fornisce il minimo soccorso 1,13,17. Il lievito viene poi placcato sulla indurre media per indurre l'espressione di entrambe le proteine. Lievito ospitare varianti Hsp104 che sopprimono la tossicità della crescita substrato conferiscono associata a malattia della colonia. Queste varianti sono state selezionate per ulteriori analisi, mentre le colonie mantenendo le varianti che non sopprimono la tossicità die. Tuttavia,falsi positivi sono un problema sostanziale in questa schermata. Espressione di TDP-43, FUS, e α-syn sono altamente tossici, che crea una forte pressione selettiva per la comparsa di soppressori genetiche spontanee di tossicità correlato alla variante Hsp104 espressi. Così, abbiamo utilizzato uno schermo secondario che è anche relativamente ad alto throughput per eliminare questi soppressori di tossicità non specifici 17. In questa schermata secondaria, lieviti selezionati sono trattati con 5-Fluorootic Acid (5-FOA) per contrastare selezione per il plasmide Hsp104 19. I ceppi sono poi valutati per substrato (TDP-43, FUS o α-syn) tossicità tramite individuazione test per garantire che la tossicità del substrato viene ripristinata dopo la perdita del plasmide Hsp104. Così, lievito in cui tossicità è ripristinato in questa schermata secondaria visualizzata presumibilmente originariamente soppressione tossicità dovuta alla presenza della variante Hsp104. Questi lieviti sono designati come "hit" e il plasmide Hsp104 dovrebbe quindi essererecuperato e sequenziato per identificare le mutazioni nel gene Hsp104 17 (Figura 1). Tutti i colpi devono poi essere riconfermati costruendo la mutazione indipendente utilizzando mutagenesi sito-diretta e poi ripetere il test per la soppressione tossicità. Le potenziali applicazioni di questo protocollo sono ampi. Usando questi metodi, librerie di qualsiasi tipo di proteina potrebbero essere sottoposti a screening per le varianti che sopprimono tossicità di qualsiasi proteina substrato che è tossica in lievito.
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Protocol
1. Biblioteca Generation
- Per costruire librerie di Hsp104 utilizzando soggetto a errori PCR specifico del dominio, prima amplificare il dominio di interesse con un errore DNA polimerasi inclini 20.
- Purificare il prodotto di PCR mediante estrazione gel.
- Eseguire un passo estensione megaprimer utilizzando un protocollo standard di mutagenesi sito-diretta: unire 50 ng modello plasmide, 250 ng megaprimer, 200 mM dNTP, e ad alta fedeltà polimerasi DNA in tampone PCR, e portare a 50 ml volume totale di acqua di grado PCR 20 . Eseguire un programma standard di PCR.
NOTA: primer specifici usati varieranno in base alla particolare regione del gene che deve essere amplificato.- A seguito di PCR, digerire il DNA dei genitori modello con 1 ml Dpn I restriction enzyme per 2 ore a 37 ° C.
- Trasforma la libreria di elettroporazione o altri mezzi a ultracompetent E. coli e purificarlo da miniprep.
NOTA: generazione Bibliotecavariabile in base sostanzialmente sugli obiettivi di un dato esperimento. Hsp104 è una grande proteina, quindi non è pratico di randomizzare l'intero gene, che è per questo che utilizziamo errore specifico del dominio incline PCR. Inoltre, la struttura di Hsp104 rimane poco compresa, rendendo la progettazione di librerie diretti impegnativi 21. Le librerie possono essere costruiti utilizzando approcci dirette o casuali per mutagenesi, con l'unica limitazione è che il plasmide ossatura modello deve contenere il gene URA3 per consentire 5-FOA contatore scelta su supporti destrosio.
2. Trasformazione della Biblioteca Hsp104
- Integrare il substrato associata a malattia in lievito Hsp104 W303aΔ con un acetato di litio standard di / PEG protocollo di trasformazione 22. Selezionare singole colonie e lo screening per la tossicità per isolare un ceppo con elevata tossicità della malattia substrato 23 associati.
NOTA: Utilizzare un ceppo integrato e isolaTé una singola colonia per garantire la parità di espressione in tutte le cellule. Clone substrato malattia in un plasmide permette l'integrazione del gene sotto qualsiasi marcatore diverso uracile (usiamo istidina) e la libreria Hsp104 nel plasmide pAG416GAL (marcatore uracile) 24. Per consentire 5-FOA counterselection, assicurarsi che la libreria è espresso da un plasmide con il marcatore uracile. Altri ceppi di lievito possono anche essere impiegati. Abbiamo notato un simile fenotipo soppressione di tossicità utilizzando W303a e BY4741 ceppi di lievito in entrambi gli sfondi Hsp104 WT e Δ (MEJ e JS, osservazioni non pubblicate). - Trasforma la libreria Hsp104 in questo ceppo utilizzando lo stesso acetato di litio / PEG protocollo di trasformazione 22. Scale la trasformazione appropriato per mantenere la sequenza spazio della biblioteca e di preservare la dimensione biblioteca predetto.
- Piatto il composto trasformazione su noninducing, piastre selettive (ad esempio, SD-His-Ura) con un numero sufficiente di piastre aassicurare la crescita di un gran numero di colonie. Utilizzare grandi piastre di Petri (150 mm) per ridurre al minimo il numero di piatti necessari. Recupero trasformanti che utilizzano piastre permette l'efficienza di trasformazione da valutare.
- Trasforma Hsp104 WT e controlli negativi vettoriali in parallelo.
3. Screening per la repressione del proteotoxicity
- Lavare le colonie al largo delle piastre con raffinosio integrato dei media di abbandono (ad esempio SRaff-His-Ura). Utilizzare una pipetta sierologica e applicatori in legno sterili per allentare le colonie dalle piastre. Trasferire i lavaggi liquido in una provetta da 50 ml e agitare accuratamente per separare eventuali grumi di cellule. Diluire a una cultura un po 'nuvoloso, OD 600 ~ 0.025.
NOTA: Qui serve raffinosio per alleviare le cellule della repressione di glucosio-mediata di induzione, adescamento in tal modo le cellule per l'induzione galattosio-mediata. - Far crescere la coltura diluita durante la notte nei mezzi di abbandono raffinosio con agitazione a 30 ° C. Far crescere la Hsp104 WT e controlli vettoriali in parallelo.
- La mattina seguente, piatto una serie di concentrazioni su galattosio individuale (ad esempio SGal-His-Ura) piastre (1 ml a 2 ml cultura concentrate in 400 ml di volume totale). Placcatura una vasta gamma di concentrazioni garantirà che un piatto avrà singole colonie. La concentrazione effettiva richiesta dipende dalla tossicità del substrato patologia di interesse.
- Normalizza il vettore e culture Hsp104 WT al diametro esterno 600 della biblioteca e piastra volumi uguali di confrontare la crescita della biblioteca rispetto ai controlli.
- Per valutare selezione rigore, piatto biblioteca in glucosio (repressione) dei media. Incubare le piastre per 2-3 giorni a 30 ° C, fino a quando le colonie appaiono (Figura 2). Valutare le colonie risultanti e confrontare ai controlli.
NOTA: Spesso entrambe le colonie grandi e piccole si ottengono, ma nessuna correlazione tra le dimensioni delle colonie e di agireivity si osserva. Schermo questi potenziali colpi utilizzando una tecnica di selezione contatore 5-FOA (Fase 4) per ridurre al minimo i falsi positivi riportati al sequenziamento.
4. 5-FOA Counterselection e Spotting per eliminare i falsi positivi
- Streak le singole colonie in duplice copia su supporto matrimoniale e letto singolo caduta di tensione (ad esempio, SD-suo-Ura e SD-I suoi piatti) e crescere una notte a 30 ° C. Ripetere con controlli vettoriali e Hsp104 WT. Placcatura su SD-His prima 5-FOA aumenta l'efficienza della fase 5-FOA aumentando la probabilità che le cellule avranno perso il plasmide Hsp104 quando vengono piastrate su 5-FOA.
- Per evitare che le piastre si secchi, avvolgere le piastre in parafilm suoi Ura-SD-e conservare a 4 ° C durante l'esecuzione dello schermo 5-FOA. Queste piastre saranno eventualmente utilizzati per il sequenziamento.
- Streak le colonie dalla SD-I suoi piatti a singole colonie su piastre 5-FOA (YPD supporti + 1 g / L 5-FOA) e incubare per 1-2 giorni a 30 &# 186; C fino singole colonie appaiono. Qui, 5-FOA viene convertito in un prodotto tossico (5-fluorodeossiuridina) in cellule che contengono il gene URA3. Pertanto, eventuali cellule ancora ospitano il plasmide Hsp104 moriranno.
- Streak le singole colonie dalle piastre 5-FOA in duplicato su SD-Ura e SD-I suoi piatti. Test 3 colonie per ogni hit per aumentare la probabilità che almeno una colonia per ogni colpo avrà perso il plasmide Hsp104. Incubare per 1-2 giorni a 30 ° C. Le colonie che hanno perso il plasmide Hsp104 si svilupperà su SD-I suoi piatti, ma non piatti SD-Ura.
- Far crescere le tensioni che hanno perso i plasmidi Hsp104 per individuare saggi. Crescere i ceppi di saturazione in raffinosio abbandono dei media (ad esempio SRaff-His) in 96 Deepwell 2 piastre ml notte a 30 ° C con agitazione. Assicurati di includere i ceppi di controllo 5-FOA trattati.
- Preparare piastre per individuare test. Utilizzando una pipetta multicanale, un'aliquota raffinosio 200 microlitri mezzi di abbandono (ad esempio SRaff-His) perpozzetto di una piastra da 96 pozzetti, riservando colonne 1 e 7 per le culture pulito. Aliquotare 250 ml di ciascuno dei 16 culture saturi nelle colonne 1 e 7 della piastra.
- Serialmente diluire le culture 5 volte in ogni colonna della piastra, mescolando accuratamente con una pipetta multicanale. Rimuovere 50 ml di coltura diluita dalle colonne 6 e 12 per garantire il volume finale di ciascun pozzetto a 200 microlitri. Questo è essenziale per garantire anche spotting.
- Utilizzando uno strumento replicatore 96-bullone (Frogger), individuare le culture in duplicato su SD-Sue e-SGal suoi piatti. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 giorni.
- Seleziona per sequenziamento ceppi che presentano tossicità sui SGal-sue piastre simile a quella dei controlli. Eliminare positivi come falsi ceppi che non sono tossici come i controlli. 5-FOA è anche spesso tossici propria, così scartare ceppi che presentano un difetto di crescita su SD-sue piastre o che mostrano sostanzialmente maggiore tossicità rispetto al substrato malattie sola (
5. Il sequenziamento del Hsp104 Varianti di Colony PCR
- Raschiare ~ 10 microlitri lievito dalle piastre SD-His-Ura in NaOH 3 ml 20 mM in tubi strip PCR e lisare le cellule di gelo-disgelo. Porre i tubi striscia in un congelatore -80 ° C per 10 min o in azoto liquido, poi incubare a 99 ° C in un termociclatore per 10 min. Diluire i ceppi a 100 ml con acqua di grado PCR.
- Preparare le reazioni PCR: 5 ml modello PCR, 0,5 microlitri 100 mM di ciascun primer, 0,5 ml 10mM dNTP, 0,25 ml polimerasi del DNA in tampone PCR, e portare a 25 ml volume totale di acqua di grado PCR. Primer design per amplificare la regione randomizzato più di circa 100 bp su entrambe le estremità. Minimizzare la dimensione della regione amplificata per aumentare la probabilità di successo di amplificazione. Eseguire un programma standard di PCR.
- Analizzare i campioni mediante elettroforesi su gel di agarosio per confermare l'amplificazione di un prodotto di PCR del siz appropriatae. Ripetere PCR se nessun prodotto è presente.
NOTA: il fallimento PCR è in genere a causa di troppo lievito utilizzato nella fase 5.1. - Preparare i campioni per il sequenziamento del DNA. Rimuovere primer PCR sia mediante PCR di depurazione o uso di un prodotto di PCR pulizia reattivo come esonucleasi I e gamberetti fosfatasi alcalina (ExoSAP-IT) per degradare DNA a singolo filamento. Questo reagente degrada enzimaticamente primer non incorporati e dNTP, consentendo un throughput più elevato.
- Sequenziare i prodotti di PCR. Assicurati di analizzare a fondo cromatogrammi sequenziamento di mutazioni. Le mutazioni possono essere osservati come una miscela di due nucleotidi in un determinato sito (figura 4), come lievito spesso porto più plasmidi.
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Representative Results
Abbiamo costruito una libreria di varianti Hsp104 randomizzati nel dominio centrale e proiettato per la soppressione di TDP-43 tossicità. La biblioteca è stata trasformata e placcato su glucosio e galattosio piastre (Figura 2) per valutare la severità dello schermo. Singole colonie sono stati selezionati e ceppi sono stati selezionati contatore utilizzando 5-FOA per eliminare il plasmide Hsp104. Questi ceppi sono stati poi valutati per confermare che la tossicità era dovuta al TDP-43 da solo, senza le varianti Hsp104. Spotting analisi di un sottoinsieme delle varianti selezionate nella schermata iniziale hanno mostrato che delle 4 colonie selezionate, 2 visualizzati soppressione TDP-43 tossicità Hsp104-mediata, 1 era un falso positivo, e 1 visualizzati maggiore tossicità in seguito al trattamento 5-FOA (Figura 3). Le 2 veri risultati sono stati poi sequenziati dalla colonia PCR per identificare mutazioni dominio centrale (Figura 4). Una volta che sono stati identificati queste mutazioni, la mutazione Hsp104 è stato costruito di nuovo nel genitoriale Hsp104 plasmide mediante mutagenesi sito-diretta per confermare la soppressione tossicità. Varianti selezionati con questi metodi sono stati successivamente confermati per sopprimere l'aggregazione in lievito, chiare aggregati preformati in saggi biochimici, e sopprimere dopaminergica neurodegenerazione in C. elegans modello del PD 17.
Figura 1:. Flow-chart per isolare le varianti Hsp104 potenziati librerie Hsp104 (marcatori URA3, GAL1 promotore) si trasformano nel lievito contenente i substrati patologici (marcatori HIS3, GAL1 promotore) e sottoposti a screening per soppressori di tossicità per placcatura su supporti che inducono. I potenziali colpi vengono poi proiettati di nuovo con un passo counterselection 5-FOA per eliminare soppressori di tossicità non specifici. Varianti selezionati in questa seconda fase vengono sequenziati dalla colonia PCR. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Lo screening per soppressori di tossicità lievito cotransformed con pAG303GAL-TDP-43 e la libreria pAG416GAL-Hsp104 sono stati piastrati su glucosio (reprimere) o galattosio (che inducono) i media. TDP-43 è altamente tossico, quindi pochissime varianti Hsp104 sono in grado di sopprimere questa tossicità, e questo schermo è molto rigoroso. Colonie singole sono selezionati come colpisce dalla piastra galattosio per lo schermo secondario 5-FOA. Sia colonie grandi e piccole sono in genere ottenuti, ma non hanno osservato alcun tendenze che dettano come le dimensioni delle colonie correla con l'attività.
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Figura 3:. 5-FOA schermo secondario lievito trattato con 5-FOA per contrastare selezione per il plasmide Hsp104 sono state valutate individuando test. I ceppi sono stati coltivati in SRaff-suoi mezzi, diluito serialmente 5 volte, e macchiato in duplice copia su SD-Sue e-SGal suoi piatti. Hsp104 A503V è un vero e proprio successo che abbiamo precedentemente verificato e mostrare qui come un controllo con solo 17 vettoriale. Le righe 3 e 4 sono risultati biblioteche che conservano TDP-43 della tossicità in seguito alla perdita del soppressore Hsp104. Riga 5 mostra un falso positivo, dove TDP-43 non è tossico, quindi un soppressore di tossicità aspecifica è presente. Riga 6 mostra un ceppo che è più tossico del TDP-43 in genere è, forse a causa di tossicità 5-FOA. Questo ceppo potrebbe ancora essere sequenziato, ma non può essere un colpo valido.
Figura 4. analeyzing risultati di sequenziamento. Lievito selezionato contiene spesso più plasmidi. Pertanto, a seguito sequenziamento dei prodotti di PCR colonia, è necessario prestare attenzione al fine di garantire tutte le mutazioni non sono trascurati nei cromatogrammi. In questo cromatogramma, due potenziali mutazioni (indicati con *) potrebbero essere trascurati. In primo luogo, vi è una miscela di A e T e nel secondo, una miscela di T e C.
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Discussion
Qui vi presentiamo il nostro approccio per isolare le varianti Hsp104 potenziati che sopprimono la tossicità di substrati associate alla malattia che utilizzano modelli di lievito proteinopathy. Usando questo approccio, grandi librerie di varianti possono essere proiettati in alta velocità, con l'unica limitazione è il numero di varianti che passano schermo secondario 5-FOA. Per eseguire le operazioni descritte in 96 formati bene, abbiamo regolarmente dello schermo fino a 200 colpi alla volta nella fase 5-FOA nel corso di 1-2 settimane. Il numero di successi ottenuti durante la fase di screening iniziale varia ampiamente a seconda della tossicità del substrato e la composizione di ogni singola biblioteca. Durante la sequenziazione risultati, è essenziale analizzare attentamente tutti i cromatogrammi sequenziamento dal miscele di plasmidi sono tipicamente presenti in ciascuna cella.
Abbiamo a volte notato una grande percentuale di Hsp104 WT essere isolato come "hit". Ciò è probabilmente dovuto alla presenza di spontanea geneticasoppressori o attività molto debole. Per aggirare questo problema, abbiamo trovato che lo screening a temperature elevate (ad esempio 34 ° C) può ridurre la percentuale di "hit" che sono Hsp104 WT. E 'anche essenziale per ri-clone di eventuali colpi in sequenza per valutare in modo indipendente l'attività di eventuali nuove varianti e per garantire plasmide purezza. Una volta che nuovi successi sono identificati, possono essere valutati per la soppressione di aggregazione nel lievito e caratterizzate biochimicamente.
Abbiamo usato questi metodi per isolare potenziato Hsp104 varianti contro TDP-43, FUS, e α-sinucleina e verificata la loro attività utilizzando proteina pura biochimica test 17. In definitiva, questi metodi possono essere utilizzati per lo screening librerie di proteine contro qualsiasi substrato di interesse che è tossica in lievito.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
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