Introduction
Der er blevet udviklet gær proteinopathy modeller for protein-misfoldning lidelser, herunder amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sygdom (PD) 1-3. Ekspressionen af proteinerne TDP-43 og FUS, som fejlfolde i ALS-patienter, er giftige og mislocalize til dannelse af cytoplasmiske aggregater i gær 1,2. Tilsvarende ekspression af α-synuclein (α-syn), som er impliceret i PD, er giftigt og mislocalizes til dannelse af cytoplasmiske aggregater i gær 3. Disse funktioner rekapitulere fænotyper hos patienter med disse lidelser 4,5. Således gær modeller giver en nyttig platform for screening for proteiner eller små molekyler, forebygge eller reversere disse fænotyper 2,6-13. Vi er interesseret i udvikling af proteiner, som er i stand til at vende aggregering og toksicitet på grund af TDP-43, FUS og α-syn. Vi fokuserer på Hsp104, en AAA + protein fra gær, der er entydigt stand disaggregere proteiner både frOM amorfe aggregater og amyloid i gær, men det har ingen menneskelig homolog 14,15. Hsp104 er fintunet til disaggregere endogene gær prioner og har kun begrænset mulighed for at disaggregere substrater impliceret i humane neurodegenerative sygdomme, som den aldrig normalt møder 16,17. Derfor tilstræber vi at konstruere forbedrede versioner af Hsp104 der er i stand til efficaciously disaggregere disse menneskelige substrater. At gøre det, vi konstruere store biblioteker af Hsp104 varianter hjælp fejltilbøjelig PCR; disse biblioteker kan screenes ved hjælp af gær proteinopathy modeller 17. Vi har vedtaget et domæne målrettet tilgang til at konstruere og screening af biblioteker, som Hsp104 er meget stor 17. Vi oprindeligt fokuserede på den midterste domæne (MD) i Hsp104 17, selv om lignende tiltag kan anvendes til at screene andre domæner. Disse modeller muliggør screening for disaggregase aktivitet direkte i modsætning til alternative teknikker, såsom overflade display, som er hvilericted at bruge til overvågning af binding 18.
Vores protokol er baseret på to screening trin (figur 1). Først Hsp104 varianter, der undertrykker toksicitet af sygdommen substrat i gær valgt. For at gøre dette, det Hsp104 varianter og sygdom-associeret substrat cotransformeres i Δ hsp104 gær. Vi beskæftiger Δ hsp104 gær at udforske Hsp104 sekvens plads i fravær af vildtype (WT) Hsp104 17. Vigtigere, er sletning af Hsp104 ikke påvirke α-syn, FUS eller TDP-43 toksicitet i gær, og ekspressionen af Hsp104 WT giver minimal redning 1,13,17. Gæren udplades derefter på inducerende medier at inducere ekspression af begge proteiner. Gær huser Hsp104 varianter, der undertrykker toksicitet af sygdommen associeret substrat tillægger vækst af kolonien. Disse varianter er udvalgt til yderligere analyse, mens kolonier opretholde varianter, der ikke undertrykker toksicitet dø. Menfalske positiver er et væsentligt problem i denne skærm. Ekspression af TDP-43, FUS og α-syn er meget giftige, hvilket skaber et stærkt selektivt tryk for fremkomsten af spontane genetiske suppressorer af toksicitet relateret til Hsp104 variant, der udtrykkes. Således har vi anvendt en sekundær skærm, er også relativt højt gennemløb for at fjerne disse uspecifikke toksicitet suppressorer 17. I denne sekundære skærm er valgt gær behandlet med 5-Fluorootic Acid (5-FOA) for at imødegå vælge for Hsp104 plasmidet 19. Stammerne vurderes derefter for substrat (TDP-43, FUS eller α-syn) toksicitet via spotting assay for at sikre, at toksiciteten af substratet er genoprettet efter tab af Hsp104 plasmid. Således, gær, hvor toksicitet er genoprettet i denne sekundære skærm formentlig oprindeligt viste toksicitet undertrykkelse på grund af tilstedeværelsen af Hsp104 variant. Disse gær betegnes som »hits« og Hsp104 plasmidet skal da væreudvindes og sekventeret for at identificere mutationerne i Hsp104-gen 17 (figur 1). Nogen hits skal derefter bekræftes af konstruere mutationen selvstændigt anvendelse af site-directed mutagenese og derefter gentest for toksicitet undertrykkelse. De potentielle anvendelsesmuligheder for denne protokol er brede. Ved hjælp af disse metoder, kan biblioteker af enhver type protein screenes for varianter, der undertrykker toksicitet helst substrat protein, som er toksisk i gær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bibliotek Generation
- At konstruere biblioteker af Hsp104 bruger Domain-specifikke fejlbehæftet PCR, først forstærke domæne af interesse med en fejl tilbøjelige DNA-polymerase 20.
- Oprense PCR-produktet ved gel ekstraktion.
- Udfør en megaprimer udvidelse trin ved anvendelse af en standard site-directed mutagenese protokol: kombinere 50 ng template plasmid, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP'er, og high-fidelity DNA-polymerase i PCR-buffer og fortyndes til 50 ul totalvolumen med PCR-kvalitet vand 20 . Køre en standard-PCR-program.
BEMÆRK: Specifikke primere, der anvendes, vil variere baseret på den bestemte region af genet, som skal forstærkes.- Efter PCR fordøje forældrenes template-DNA med Dpnl restriktionsenzym 1 pi for 2 timer ved 37 ° C.
- Omdan biblioteket ved elektroporation eller andre midler i ultracompetent E. coli og rense det ved miniprep.
BEMÆRK: Library generationvarierer betydeligt baseret på målene for et givet eksperiment. Hsp104 er et meget stort protein, så det er upraktisk at randomisere hele genet, hvilket er grunden til vi udnytter domæne-specifik fejl tilbøjelig PCR. Desuden forbliver strukturen af Hsp104 dårligt forstået, at udformningen af rettet biblioteker udfordrende 21. Biblioteker kan konstrueres under anvendelse rettet eller tilfældige metoder til mutagenese, med den eneste begrænsning er, at skabelonen plasmidskelet bør indeholde URA3-genet for at muliggøre for 5-FOA counter udvælgelse på dextrose medier.
2. Omdannelse af Hsp104 Bibliotek
- Integrer sygdoms-associeret substrat i W303aΔ hsp104 gær ved hjælp af et standard lithium acetat / PEG transformationsprotokol 22. Vælge enkelte kolonier og screene dem for toksicitet til at isolere en stamme med høj toksicitet af sygdommen associeret substrat 23.
BEMÆRK: Brug en integreret stamme og isolaTE en enkelt koloni at sikre lige udtryk i alle celler. Klone sygdom substrat i et plasmid tillader integration af genet under en anden end uracil markør (vi bruger histidin) og Hsp104 bibliotek i pAG416GAL plasmid (uracil markør) 24. At tillade for 5-FOA modselektion sikre, at biblioteket er udtrykt fra et plasmid med uracil markør. Andre gærstammer kan også anvendes. Vi har noteret en lignende toksicitet undertrykkelse fænotype hjælp W303a og BY4741 gærstammer i både WT og Δ hsp104 baggrunde (MEJ og JS, upublicerede observationer). - Transformer Hsp104 biblioteket ind i denne stamme ved hjælp af den samme lithiumacetat / PEG transformationsprotokol 22. Opskalere transformation hensigtsmæssigt at opretholde sekvens plads af biblioteket og bevare den forudsagte bibliotek størrelse.
- Plate transformation blandingen på noninducing, selektive plader (f.eks SD-His-Ura) ved hjælp af nok plader tilsikre vækst af et stort antal kolonier. Bruger store petriskåle (150 mm) for at minimere det antal plader, der er nødvendige. Gendannelse transformanter anvender plader tillader transformation effektivitet skal vurderes.
- Transform Hsp104 WT og vektor negative kontroller parallelt.
3. Screening for Undertrykkelse af Proteotoxicity
- Vask kolonierne af pladerne ved hjælp af raffinose suppleret frafaldsprocenter medier (f.eks sraff-His-Ura). Brug en serologisk pipette og sterile træ applikatorer at løsne kolonierne fra pladerne. Overføre flydende vaske til et 50 ml konisk rør og vortex grundigt at adskille eventuelle klumper af celler. Fortynd til en lidt uklar kultur, OD 600 ~ 0,025.
BEMÆRK: Her raffinose tjener til at lindre celler af glucose-repression af induktion, således at prime celler for galactose-medieret induktion. - Grow den fortyndede kultur natten over i raffinose frafald medier med rystning ved 30 ºC. Grow Hsp104 WT og vektor kontrol parallelt.
- Den følgende morgen, plade en række koncentrationer onto individuel galactose (f.eks SGal-His-Ura) plader (1 pi til 2 ml koncentreret kultur i 400 pi samlede mængde). Plating en bred vifte af koncentrationer vil sikre, at en plade vil have enkelte kolonier. Den faktiske koncentration, der kræves afhænger af toksicitet af sygdommen substrat af interesse.
- Normalisere vektoren og Hsp104 WT kulturer OD600 af biblioteket og pladen lige store volumener til at sammenligne væksten af biblioteket i forhold til kontrollerne.
- For at vurdere udvælgelse stringens, Plate biblioteket på glucose (undertrykke) medier. Pladerne inkuberes i 2-3 dage ved 30 ºC, indtil kolonier vises (Figur 2). Vurdere de resulterende kolonier og sammenlign kontrollen.
BEMÆRK: Ofte opnås både store og små kolonier, men ingen sammenhæng mellem koloni størrelse og handleske sammenhæng overholdes. Screen disse potentielle hits ved hjælp af en 5-FOA counter udvælgelse teknik (trin 4) for at minimere falske positiver fremført til sekventering.
4. 5-FOA modselektion og spotting at eliminere falske positiver
- Streak af enkeltskrogede kolonier i to eksemplarer onto dobbelt og enkelt dropout medier (f.eks SD-His-Ura og SD-Hans plader) og vokse natten over ved 30 ºC. Gentag med vektor og Hsp104 WT kontroller. Udpladning på SD-His før 5-FOA øger effektiviteten af 5-FOA trin ved at øge sandsynligheden for, at celler vil have tabt Hsp104 plasmid, når de udplades på 5-FOA.
- For at forhindre pladerne i at tørre ud, pak SD-Hans-Ura plader i parafilm og opbevares ved 4 ºC, mens de udfører skærm 5-FOA. Disse plader i sidste ende vil blive anvendt til sekventering.
- Streak kolonierne fra SD-Hans plader til enlige kolonier på 5-FOA-plader (YPD medier + 1g / l 5-FOA) og inkuberes i 1-2 dage ved 30 &# 186; C, indtil enkelte kolonier vises. Her er 5-FOA omdannet til et toksisk produkt (5-fluordeoxyuridin) i celler, som indeholder URA3-genet. Derfor vil alle celler stadig huser Hsp104 plasmid dø.
- Streak de enkelte kolonier fra 5-FOA-plader i to eksemplarer onto SD-Ura og SD-Hans plader. Test 3 kolonier for hver ramme for at øge sandsynligheden for, at mindst én koloni for hver hit vil have mistet det Hsp104 plasmid. Inkuber i 1-2 dage ved 30 ° C. Kolonier, der har mistet Hsp104 plasmid vil vokse på SD-His-plader, men ikke SD-Ura plader.
- Dyrke stammer, som har tabt de Hsp104 plasmider for spotting assays. Grow stammerne til mætning i raffinose dropout medier (f.eks sraff-His) i 96 Deepwell 2 ml plader natten over ved 30 ºC under omrystning. Vær sikker på at inkludere de 5-FOA behandlet kontrol stammer.
- Forberede plader til spotting assay. Ved hjælp af en multikanal pipette portion 200 pi raffinose dropout medier (f.eks sraff-His) prbrønd i en plade med 96 brønde, reservere kolonne 1 og 7 til de nydelige kulturer. Aliquot 250 ul af hver af de 16 mættede kulturer i kolonne 1 og 7 i pladen.
- Serielt fortynde kulturerne 5 gange i hver kolonne af pladen, blande grundigt med en multikanalpipette. Fjern 50 pi af den fortyndede kultur fra kolonne 6 og 12 for at sikre det endelige volumen af hver brønd er 200 pi. Dette er vigtigt for at sikre en jævn spotting.
- Ved hjælp af en 96-bolt portreplikator værktøj (Frogger), spot kulturer i to eksemplarer på SD-Hans og SGal-Hans plader. Pladerne inkuberes ved 30 ºC i 2-3 dage.
- Vælg til sekventering stammer, der udviser toksicitet på SGal-Hans plader svarende til det af kontrollerne. Kassér som falske positiver stammer, der ikke er så giftige som kontrollerne. 5-FOA er også ofte giftige i sig selv, så kassere stammer, der udviser en vækstdefekt på SD-His plader eller som udviser væsentligt større toksicitet end sygdommen substrat alene (
5. sekvensering af Hsp104 Varianter af Colony PCR
- Skrabning ~ 10 pi gær fra SD-His-Ura plader i 3 pi 20 mM NaOH i PCR bånd rør og lysere cellerne ved frysning-optøning. Placer striben rør i en -80 ° C fryser i 10 minutter eller i flydende nitrogen, og derefter inkuberes ved 99 ºC i en thermocycler i 10 min. Fortynd stammerne til 100 pi med PCR-kvalitet vand.
- Forbered PCR reaktioner: 5 pi PCR skabelon, 0,5 pi 100 um hver primer, 0,5 pi 10 mM dNTP'er, 0,25 pi DNA-polymerase i PCR-buffer, og der fyldes op til 25 pi samlet volumen med PCR-kvalitet vand. Design af primere til at opformere den randomiserede region plus ca. 100 bp på begge ender. Minimere størrelsen af det amplificerede region for at øge sandsynligheden for en vellykket amplifikation. Køre en standard-PCR-program.
- Analysere prøver ved agarosegelelektroforese for at bekræfte amplifikation af et PCR-produkt af passende size. Gentag PCR hvis intet produkt er til stede.
BEMÆRK: PCR fejl skyldes typisk for meget gær, der anvendes i trin 5.1. - Fremstille prøver til DNA-sekventering. Fjerne PCR-primere, enten ved PCR oprensning eller ved hjælp af et PCR-produkt oprydning reagens, såsom Exonuclease I og Shrimp Alkaline Phosphatase enzym (ExoSAP-IT) til at nedbryde enkeltstrenget DNA. Dette reagens enzymatisk nedbryder inkorporerede primere og dNTP'er, giver mulighed for højere gennemløb.
- Sekventere PCR-produkter. Vær sikker på at grundigt analysere sekventering kromatogrammer for mutationer. Mutationer kan observeres som en blanding af to nukleotider ved et givet sted (figur 4), som gær ofte huser flere plasmider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har konstrueret et bibliotek af Hsp104 varianter randomiseret i midten domæne og screenet det til undertrykkelse af TDP-43 toksicitet. Biblioteket blev transformeret og udpladet på glucose og galactose plader (figur 2) at vurdere stringensen af skærmen. Enkelte kolonier blev udvalgt og stammerne counter udvalgt under anvendelse af 5-FOA at fjerne Hsp104 plasmid. Disse stammer blev derefter vurderet til at bekræfte, at toksicitet skyldes TDP-43 alene uden Hsp104 varianter. Spotting assays af en delmængde af de udvalgte i det første skærmbillede varianter viste, at af de 4 kolonier udvalgt, 2 viste Hsp104-medieret TDP-43 toksicitet undertrykkelse, 1 var en falsk positiv, og 1 viste øget toksicitet følgende 5-FOA behandling (figur 3). 2 sande hits blev derefter sekventeret ved koloni-PCR for at identificere de midterste domæne mutationer (figur 4). Når blev identificeret disse mutationer, blev Hsp104 mutation konstrueret ny i forældrenes Hsp104 plasmidet ved site-directed mutagenese for at bekræfte toksicitet undertrykkelse. Varianter udvalgte ved hjælp af disse metoder blev senere bekræftet at undertrykke aggregering i gær, klare præfabrikerede aggregater i biokemiske assays og undertrykke dopaminerge neurodegeneration i en C. elegans model af PD 17.
Figur 1:. Flow-chart til isolering potentierede Hsp104 varianter Hsp104 biblioteker (URA3 markør, GAL1 promotor) omdannes i gær indeholdende sygdommen substrater (HIS3 markør, GAL1 promotor) og screenet for toksicitet undertrykkere ved udpladning på inducerende medier. Potentielle hits screenes derefter igen med en 5-FOA modselektion skridt til at fjerne ikke-specifikke toksicitet undertrykkere. Varianter udvalgt i dette andet trin er derefter sekventeret ved koloni-PCR. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Screening for toksicitet undertrykkere Gær cotransformeret med pAG303GAL-TDP-43 og den pAG416GAL-Hsp104 biblioteket blev udpladet på glucose (represserende) eller galactose (inducerer) medier. TDP-43 er stærkt toksisk, så meget få Hsp104 varianter er i stand til at undertrykke denne toksicitet, og denne skærm er meget strenge. Enkelte kolonier udvælges som rammer fra galactose plade for 5-FOA sekundær skærm. Både store og små kolonier opnås typisk, men vi har ikke observeret nogen tendenser, der dikterer, hvordan koloni størrelse korrelerer med aktiviteten.
s.jpg "/>
Figur 3:. 5-FOA sekundær skærm Gær behandlet med 5-FOA at imødegå vælge for Hsp104 plasmidet blev vurderet ved spotting assay. Stammer blev dyrket i sraff-Hans medier, serielt fortyndet 5 gange, og plettet i to eksemplarer på SD-Hans og SGal-Hans plader. Hsp104 A503V er et sandt hit, som vi tidligere har kontrolleret og viser her, som en kontrol sammen med vektor alene 17. Rækker 3 og 4 er bibliotekets hits, der bevarer TDP-43 toksicitet efter tab af Hsp104 lyddæmper. Række 5 viser en falsk positiv, hvor TDP-43 ikke længere er toksisk, så en ikke-specifik toksicitet suppressor er til stede. Række 6 viser en stamme, der er mere toksisk end TDP-43 er typisk, muligvis på grund af 5-FOA toksicitet. Denne stamme kan stadig sekventeret, men kan ikke være en gyldig hit.
Figur 4. Analyzing sekventeringsresultaterne. Udvalgte gær indeholder ofte flere plasmider. Derfor efter sekventering af koloni PCR-produkter, skal der drages omsorg for at sikre, at eventuelle mutationer er ikke overset i kromatogrammerne. I denne kromatogrammet, kunne to potentielle mutationer (markeret med *) blive overset. I det første tilfælde, der er en blanding af A og T og i det andet en blanding af T og C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her præsenterer vi vores tilgang til at isolere potentierede Hsp104 varianter, der undertrykker toksicitet sygdomsassocierede substrater ved hjælp af gær proteinopathy modeller. Med denne fremgangsmåde kan store biblioteker af varianter screenes i high throughput, med den eneste begrænsning er antallet af varianter, der passerer 5-FOA sekundær skærm. Ved at udføre disse trin i 96-brønds format, vi rutinemæssigt screene op til 200 hits på et tidspunkt i 5-FOA trin i løbet af 1-2 uger. Antallet af hits opnået under den indledende screening skridt vil variere i vid udstrækning afhængig af underlaget toksicitet og makeup af hvert enkelt bibliotek. Når sekventering af hits, er det vigtigt nøje at analysere alle sekventering kromatogrammer eftersom blandinger af plasmider er typisk til stede i hver celle.
Vi har nogle gange bemærket en stor procentdel af Hsp104 WT blive isoleret som "hits". Dette er sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af spontan genetiskundertrykkere eller meget svag aktivitet. For at omgå dette problem har vi fundet, at screening ved forhøjede temperaturer (f.eks 34 ° C) kan sænke den procentdel af "hits", der er Hsp104 WT. Det er også vigtigt at re-klon eventuelle kædede hits til selvstændigt at vurdere aktiviteten af eventuelle nye varianter og sikre plasmid renhed. Når nye hits er identificeret, kan de vurderes til undertrykkelse af aggregering i gær og karakteriseret biokemisk.
Vi har brugt disse metoder til at isolere forstærkes Hsp104 varianter imod TDP-43, FUS, og α-synuclein og verificeret deres aktivitet ved hjælp af ren proteinbiokemi assays 17. I sidste ende kan disse metoder anvendes til at screene biblioteker protein mod hvilket som helst substrat af interesse, der er toksisk i gær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
