Introduction
המודלים proteinopathy השמרים פותחו לטיפול בהפרעות misfolding חלבון כוללים מחלת ניוון (ALS) ופרקינסון (PD) 1-3. ביטוי של החלבונים TDP-43 וFUS, שmisfold בחולי ALS, הם רעיל וmislocalize כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 1,2. בדומה לכך, הביטוי של α-סינוקלאין (α-SYN), אשר היה מעורב בPD, הוא רעיל וmislocalizes כדי ליצור אגרגטים cytoplasmic בשמרים 3. תכונות אלה לשחזר פנוטיפים בחולים עם הפרעות אלה 4,5. כך, שמרי מודלים לספק פלטפורמה שימושית עבור בדיקות סקר לאיתור חלבונים או מולקולות קטנות המונעים או הפוך פנוטיפים אלה 2,6-13. אנו מעוניינים בפיתוח של חלבונים המסוגלים היפוך צבירה ורעילות בשל TDP-43, FUS, וα-syn. אנו מתמקדים בHsp104, AAA + חלבון משמרים כי הוא מסוגל ריסוק חלבונים ייחודי הן frאגרגטים אום אמורפי ועמילואיד בשמרים, אך אין לה homologue אדם 14,15. Hsp104 רגיש ועדין לdisaggregate פריונים שמרי אנדוגני ויש לו רק יכולת מוגבלת disaggregate מצעים המעורבים במחלות ניווניות אנושיות, שזה אף פעם לא נתקל בדרך 16,17. כך, אנו שואפים להנדס גרסאות משופרות של Hsp104 כי הם מסוגלים disaggregate efficaciously מצעים האנושיים אלה. לשם כך, אנו בונים ספריות גדולות של Hsp104 גרסאות באמצעות PCR ומועד לשגיאות; יכולות להיות מוקרנת ספריות אלה באמצעות המודלים השמרים proteinopathy 17. אנחנו אימצנו גישה ממוקדת-תחום לבניית וסינון ספריות, כHsp104 הוא גדול מאוד 17. אנחנו בתחילה התמקדנו בתחום ביניים (MD) של Hsp104 17, אם כי יכולים להיות מועסקות גישות דומות לדומיינים אחרים. מודלים אלה מאפשרים בדיקות סקר לאיתור פעילות Disaggregase ישירות, בניגוד לטכניקות חלופיות כגון תצוגה לפני שטח, ושארricted להשתמש לניטור מחייב 18.
הפרוטוקול שלנו מבוסס על שני שלבי סינון (איור 1). ראשית, גרסאות Hsp104 המדכאות את הרעילות של מצע המחלה בשמרים נבחרות. לשם כך, Hsp104 גרסאות ו- קשור מחלה מצעם cotransformed לשמרי Hsp104 Δ. אנו מעסיקים שמרי Hsp104 Δ ללחקור את חלל רצף Hsp104 בהעדר wild-type (WT) Hsp104 17. חשוב לציין, מחיקה של Hsp104 אינה משפיעה על α-syn, FUS, או TDP-43 רעילות בשמרים, וביטוי של Hsp104 WT מספק הצלה מינימאלית 1,13,17. השמרים אז מצופים על גרימת תקשורת כדי לגרום לביטוי של שני החלבונים. שמרים מחסה גרסאות Hsp104 המדכאות רעילות של הצמיחה מקנה המצע הקשורים למחלות של המושבה. גרסאות אלו נבחרו לניתוח נוסף, בעוד שמושבות שמירת גרסאות שאינו לדכא למות רעילות. עם זאת,תוצאות חיוביות שגויות הן בעיה משמעותית במסך זה. הביטוי של TDP-43, FUS, וα-syn הוא רעיל ביותר, אשר יוצר לחץ סלקטיבי חזק להופעתו של מדכאי גנטיים ספונטניים של רעילות שאינה קשורה לגרסת Hsp104 לידי ביטוי. כך, יש לנו להשתמש במסך משני שהוא גם גבוהה יחסית תפוקה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים אלה 17. במסך המשני זו, מטופלים שמרים נבחרים עם 5-Fluorootic חומצה (5-פואה) כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 19. אז הזנים נבחנים לגבי מצע רעילות (TDP-43, FUS, או α-SYN) באמצעות איתור assay כדי להבטיח שהרעילות של המצע משוחזרת לאחר אובדן פלסמיד Hsp104. כך, שמרים שברעילות משוחזרת במסך משני זה כנראה שבעבר הוצגו דיכוי רעילות בשל נוכחותם של גרסת Hsp104. השמרים הללו מיועדים 'להיטים' ופלסמיד Hsp104 צריך להיות אזהתאושש ורצף לזהות מוטציות בגן Hsp104 17 (איור 1). כל להיטים אז צריכים להיות אושר על ידי בניית המוטציה באופן עצמאי באמצעות מוטגנזה מכוונת ולאחר מכן בדיקה חוזרת לדיכוי רעילות. היישומים האפשריים עבור פרוטוקול זה הם רחבים. שימוש בשיטות אלה, ספריות מכל סוג של חלבון יכולות להיות מוקרנת לגרסות המדכאות רעילות של כל חלבון מצע כי הוא רעיל בשמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ספריית דור
- לבנות ספריות של Hsp104 באמצעות PCR מועדת לטעויות תחום ספציפי, להגביר ראשון תחום עניינים עם DNA פולימרז לשגיאות 20.
- לטהר את מוצר ה- PCR על ידי שאיבת קריש.
- לבצע צעד הארכת megaprimer באמצעות פרוטוקול מוטגנזה מכוון סטנדרטי: לשלב פלסמיד 50 ng תבנית, 250 megaprimer ng, 200 מיקרומטר dNTPs, וDNA פולימרז באיכות גבוהה במאגר PCR, ולדלל את נפח כולל של 50 μl עם מים הכיתה PCR 20 . להפעיל תכנית PCR סטנדרטית.
הערה: פריימרים ספציפיים בשימוש ישתנה בהתאם לאזור המסוים של הגן שהוא להיות מוגברים.- בעקבות PCR, לעכל תבנית ה- DNA של הורים עם μl 1 אנזים הגבלת DPN אני לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
- להפוך את הספרייה באמצעות electroporation או אחר בultracompetent E. coli ולטהר אותו על ידי miniprep.
הערה: דור ספרייהמשתנה מבוסס במידה מהותית על המטרות של ניסוי נתון. Hsp104 הוא חלבון גדול מאוד, כך שזה לא מעשי באקראי כל הגן, וזו הסיבה שאנו מנצלים PCR לשגיאות תחום ספציפי. בנוסף, המבנה של Hsp104 נשאר הבין היטב, והעיצוב של ספריות בבימוי מאתגרות 21. ניתן לבנות ספריות תוך שימוש בגישות מכוונות או אקראיות לmutagenesis, עם ההגבלה היחידה הוא שעמוד שדרת פלסמיד התבנית צריכה להכיל את גן URA3 כדי לאפשר 5-פואה בחירת דלפק בתקשורת דקסטרוז.
2. שינוי של ספריית Hsp104
- לשלב את המצע הקשורים למחלות לשמרי Hsp104 W303aΔ באמצעות ליתיום אצטט סטנדרטי / פרוטוקול שינוי PEG 22. בחר מושבות אחת ולסנן אותן לרעילות לבודד את מתח עם רעילות גבוהה של המחלה קשורה מצע 23.
הערה: השתמש במתח וIsola משולביםTE מושבה אחת כדי להבטיח ביטוי שווה בכל התאים. לשכפל את מצע המחלה לפלסמיד המאפשר שילוב של הגן תחת כל סמן אחר מאשר אורציל (אנו משתמשים היסטידין) וספריית Hsp104 לפלסמיד pAG416GAL (סמן אורציל) 24. כדי לאפשר ל5-פואה counterselection, להבטיח שהספרייה באה לידי ביטוי מפלסמיד עם סמן אורציל. יכולים גם להיות מועסקים זני שמרים אחרים. רשמתי לפנינו את הפנוטיפ דיכוי רעילות דומה באמצעות W303a וBY4741 זני שמרים בשני רקעי Hsp104 WT וΔ (Mej וJS, תצפיות לא פורסמו). - להפוך את ספריית Hsp104 לזן זה תוך שימוש באותו ליתיום אצטט / פרוטוקול שינוי PEG 22. בהיקף של עד השינוי כראוי כדי לשמור על מרחב הרצף של הספרייה ולשמור על גודל הספרייה חזה.
- פלייט תערובת הטרנספורמציה על noninducing, צלחות סלקטיבית (למשל SD--אורה) באמצעות מספיק צלחות ללהבטיח צמיחה של מספר רב של מושבות. השתמש בצלחות פטרי גדולות (150 מ"מ) כדי למזער את מספר הצלחות הנחוצות. שחזור transformants באמצעות צלחות מאפשר יעילות שינוי להיות מוערכת.
- להפוך Hsp104 WT ובקרות שליליות וקטור במקביל.
3. הקרנה לדיכוי Proteotoxicity
- שטוף את המושבות מהצלחות באמצעות תקשורת נשירת raffinose תוספת (למשל SRaff--אורה). השתמש פיפטה סרולוגית והחלה מעץ סטרילי כדי לשחרר את המושבות מהצלחות. העבר את שטיפות נוזל לצינור חרוטי 50 מיליליטר ומערבולת ביסודיות כדי להפריד כל גושים של תאים. לדלל את תרבות מעונן במקצת, OD 600 ~ 0.025.
הערה: כאן raffinose משמשת כדי להקל על התאים של דיכוי בתיווך גלוקוז של אינדוקציה, וכך תחול התאים לזירוז בתיווך גלקטוז. - לגדול התרבות בדילול הלילה בתקשורת נשירת raffinose עם רועד ב30 ºC. לגדול WT Hsp104 ובקרות וקטור במקביל.
- למחרת בבוקר, צלחת טווח ריכוזים על גלקטוז הבודד צלחות (למשל SGal--האורה) (1 μl 2 מיליליטר מרוכז תרבות ב400 μl נפח כולל). ציפוי במגוון רחב של ריכוזים יבטיח כי צלחת תהיה מושבות אחת. הריכוז בפועל נדרש תלוי ברעילות של מצע המחלה של עניין.
- לנרמל את הווקטור ותרבויות Hsp104 WT לOD 600 של הספרייה וצלחת כמויות שווה להשוות צמיחה של הספרייה ביחס לקבוצת הביקורת.
- כדי להעריך החמרת בחירה, צלחת הספרייה ברמת סוכר (הדחקה) תקשורת. דגירה צלחות במשך 2-3 ימים ב 30 ºC, עד מושבות להופיע (איור 2). להעריך את המושבות וכתוצאה מכך ולהשוות לקבוצת הביקורת.
הערה: לעתים קרובות שני מושבות גדולות וקטנות מתקבלות, אבל אין קשר בין גודל מושבה ומעשהivity הוא ציין. מסך להיטים הפוטנציאליים אלה תוך שימוש בטכניקת 5-פואה בחירת דלפק (שלב 4) כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות נשאו מעל לריצוף.
4. 5-פואה Counterselection והאיתור לחסל חיובי שגוי
- פס החוצה מושבות אחת בשני עותקים על גבי מדיה זוגית אחת נשירה (למשל SD--האורה וSD-צלחות) ולגדול לילה בשעה 30 ºC. חזור עם פקדי וקטור וHsp104 WT. ציפוי על SD-לפני 5-פואה מגבירה את היעילות של שלב 5-פואה על ידי הגדלת הסבירות שתאים איבדו את הפלסמיד Hsp104 כאשר הם מצופים על 5-פואה.
- כדי למנוע צלחות מהתייבשות, לעטוף את SD--אורה צלחות בparafilm ולאחסן ב 4 ºC בעת ביצוע מסך 5-פואה. צלחות אלה סופו של דבר לשמש לריצוף.
- פס המושבות מSD-צלחות למושבות אחת על צלחות 5-פואה (YPD תקשורת + 1G / L 5-פואה) ו דגירה של 1-2 ימים ב 30 ו186 #; C עד מושבות אחת מופיע. כאן, 5-פואה הופכת למוצר רעיל (5-fluorodeoxyuridine) בתאים המכילים את גן URA3. כך, כל תאים מקננים עדיין פלסמיד Hsp104 ימותו.
- פס מושבות אחת מצלחות 5-פואה בשני עותקים על גבי SD-אורה וSD-צלחות. מבחן 3 מושבות לכל נפגעו כדי להגביר את הסבירות שמושבה אחת לפחות עבור כל פגע תאבד את הפלסמיד Hsp104. דגירה של 1-2 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. מושבות שאיבדו את הפלסמיד Hsp104 לא יגדל על SD-צלחות, אך לא צלחות SD-אורה.
- לגדול הזנים שאיבדו פלסמידים Hsp104 לאיתור מבחני. לגדול הזנים לרוויה בתקשורת נשירת raffinose (למשל SRaff-שלו) ב -96 DeepWell 2 צלחות מיליליטר לילה בשעה 30 ºC עם רעד. הקפד לכלול זני שליטת 5-פואה טופלו.
- להכין צלחות לאיתור assay. בעזרת פיפטה רבה, 200 תקשורת נשירת raffinose μl aliquot (למשל SRaff-) לעמודות גם צלחת גם 96, בהזמנת 1 ו -7 לתרבויות המסודרות. Aliquot 250 μl של כל אחד 16 התרבויות רוויות בטורי 1 ו -7 של הצלחת.
- סדרתי לדלל את התרבויות 5 לקפל לתוך כל עמודה של הצלחת, ערבוב ביסודיות עם פיפטה רבה. הסר 50 μl של התרבות בדילול מלא מעמודים 6 ו -12 כדי להבטיח את הנפח הסופי של כל אחד גם הוא 200 μl. זה חיוני כדי להבטיח גם תצפית.
- שימוש בכלי 96-בורג משכפל (Frogger), לזהות את התרבויות בשני עותקים על גבי SD-SGal-צלחות ו. דגירה הצלחות על 30 ºC במשך 2-3 ימים.
- בחר עבור סידור זנים כי תערוכת רעילות על SGal-צלחות דומות לזה של קבוצת הביקורת. בטל זנים חיוביים שקריים שאינם רעילים כמו הפקדים. 5-פואה היא גם לעתים קרובות רעילה בפני עצמו, כל כך להשליך זנים כי תערוכת פגם צמיחה בSD-צלחות או שהם מציגים רעילות משמעותית יותר מאשר מצע המחלה לבד (
5. סידור גרסאות Hsp104 על ידי המושבה PCR
- שמרים לגרד ~ 10 μl מצלחות SD--האורה ב 3 μl 20 מ"מ NaOH בצינורות רצועת PCR וlyse התאים על ידי ההפשרה הקפאה. מניחים את צינורות הרצועה במקפיא -80 ºC למשך 10 דקות או בחנקן נוזלי, ואז לדגור על 99 ºC בthermocycler למשך 10 דקות. לדלל את הזנים למי כיתה PCR 100 μl.
- הכן PCR תגובות: תבנית PCR 5 μl, 0.5 μl 100 מיקרומטר כל צבע יסוד, 10mm dNTPs 0.5 μl, 0.25 DNA פולימרז μl במאגר PCR, ולעשות עד נפח כולל של 25 μl עם מים כיתה PCR. פריימרים עיצוב כדי להגביר את האזור באופן אקראי בתוספת כ -100 נ"ב בכל קצה. מזער את הגודל של האזור המוגבר כדי להגדיל את הסיכוי של הגברה מוצלחת. להפעיל תכנית PCR סטנדרטית.
- ניתוח דגימות על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לאשר הגברה של מוצר ה- PCR של siz המתאיםדואר. חזור PCR אם אין מוצר קיים.
הערה: הכשל בPCR הוא בדרך כלל עקב יותר מדי שמרים בשימוש בשלב 5.1. - הכן דגימות לרצפי DNA. הסר פריימרים PCR או על ידי טיהור PCR או באמצעות מגיב ניקוי מוצר ה- PCR כמו exonuclease אני ושרימפס אלקליין phosphatase אנזים (ExoSAP-IT) לבזות DNA חד גדילים. מגיב זה אנזימי מדרדרת פריימרים וdNTPs מאוגדים, המאפשר תפוקה גבוהה יותר.
- רצף מוצרי ה- PCR. הקפד לנתח ביסודיות chromatograms רצף למוטציות. מוטציות אפשר לראות כתערובת של שני נוקלאוטידים באתר נתון (איור 4), כמרים לעתים קרובות נמל פלסמידים מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בנינו ספרייה של גרסאות Hsp104 אקראיות בתחום האמצע והקרנו אותו לדיכוי TDP-43 רעילות. הספרייה הפכה ומצופית על גלוקוז וגלקטוז צלחות (איור 2) על מנת להעריך את החומרה של המסך. מושבות אחת נבחרו והזנים נבחרו דלפק באמצעות 5-פואה לחסל את הפלסמיד Hsp104. זנים אלה ולאחר מכן נבדקו כדי לאשר רעילות שנבע TDP-43 לבד, ללא גרסאות Hsp104. מבחני איתור של קבוצת משנה של הגרסאות שנבחרו במסך הראשוני הראו כי של 4 המושבות שנבחרו, 2 מוצג דיכוי TDP-43 רעילות תיווך Hsp104, 1 היה חיובי כוזב, ו1 מוצג רעילות מוגברת לאחר טיפול 5-פואה (איור 3). 2 להיטים האמיתיים היו רצף לאחר מכן על ידי המושבה PCR לזהות מוטציות תחום האמצע (איור 4). ברגע שמוטציות אלה זוהו, המוטציה Hsp104 נבנתה מחדש בפלסמיד Hsp104 ההורים על ידי מוטגנזה מכוונת כדי לאשר דיכוי רעילות. גרסאות שנבחרו באמצעות שיטות אלה מאוחר יותר אישרו לדכא צבירה בשמרים, ברור אגרגטים, מעוצב מראש במבחני ביוכימיים, ולדכא את הניוון של מערכת עצבי דופאמין בג מודל elegans של PD 17.
איור 1:. תרשים זרימה לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated ספריות Hsp104 (סמן URA3, אמרגן GAL1) הופכים בשמרים המכילים את מצעי מחלה (סמן HIS3, אמרגן GAL1) והוקרן למדכאי רעילות על ידי ציפוי בתקשורת וישכנע. אז להיטים פוטנציאליים מוקרנים שוב באמצעות צעד counterselection 5-פואה לחסל מדכאי רעילות ספציפיים. גרסאות שנבחרו בשלב השני לאחר מכן רצף של המושבה PCR. href = היעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. הקרנה למדכאי רעילות השמרים cotransformed עם pAG303GAL-TDP-43 וספריית pAG416GAL-Hsp104 היו מצופים על גלוקוז תקשורת (הדחקה) או גלקטוז (גרימה). TDP-43 הוא רעיל ביותר, ולכן מעט מאוד גרסאות Hsp104 הן מסוגלות לדכא רעילות זו, ומסך זה הוא מאוד מחמיר. מושבות בודדות שנבחרו כלהיטים מצלחת גלקטוז למסך המשני 5-פואה. שני מושבות גדולות וקטנות בדרך כלל שהושגו, אבל אנחנו לא נצפו כל מגמות המכתיבות כיצד גודל מושבה בקורלציה עם פעילות.
s.jpg "/>
איור 3:. 5-פואה מסך המשני שמרים שטופלו ב5-פואה כדי להתמודד בחר לפלסמיד Hsp104 הוערכו על ידי תצפית assay. זנים גדלו בSRaff-תקשורת, באופן סדרתי בדילול 5 פי, והבחינו בשני עותקים על גבי SD-SGal-צלחות ו. Hsp104 A503V הוא להיט אמיתי הוא שאימתנו בעבר ולהראות כאן כשליטה יחד עם וקטור בלבד 17. שורות 3 ו -4 הן להיטי ספרייה ששומרים על TDP-43 האובדן הבא רעילות של מדכא Hsp104. שורה 5 מראה שווא חיובי, שבו TDP-43 הוא כבר לא רעיל, כך מדכא רעילות ספציפי קיים. שורה 6 מראה מתח שהוא רעיל יותר מ TDP-43 בדרך כלל הוא, ככל הנראה בשל רעילות 5-פואה. זן זה עדיין יכול להיות רצף אבל לא יכול להיות להיט בתוקף.
אנאלי 4. איורyzing תוצאות רצף. שמרים נבחרים לעתים קרובות מכילים פלסמידים מרובים. לכן, הבא רצף של מוצרי ה- PCR המושבה, יש להקפיד כדי לוודא שכל מוטציות לא התעלמו בchromatograms. בchromatogram זה, שתי מוטציות פוטנציאליות (כונה על ידי *) יכולות להתעלם. במקרה הראשון, מדובר בשילוב של וT ובמקרה השני, תערובת של T ו- C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציגים את הגישה שלנו לבידוד גרסאות Hsp104 potentiated המדכאות את הרעילות של מצעים הקשורים למחלות באמצעות מודלים השמרים proteinopathy. שימוש בגישה זו, ספריות גדולות של גרסאות יכולות להיות מוקרנת בתפוקה גבוהה, עם המגבלה היחידה להיות מספר הגרסאות שעוברות מסך המשני 5-פואה. על ידי ביצוע השלבים הבאים בפורמט 96 גם, אנו שגרתי מסך עד 200 להיטים בכל פעם בשלב 5-פואה במהלך 1-2 שבועות. מספר הלהיטים שהתקבלו במהלך שלב הסינון הראשוני ישתנה בהתאם במידה רבה על רעילות מצע והאיפור של כל ספרייה מסוימת. כאשר רצף להיטים, זה הכרחי כדי לנתח בזהירות את כל chromatograms הרצף מאז תערובות של פלסמידים הן בדרך כלל נמצאות בכל תא.
לפעמים יש לנו ציינו אחוז גדול של Hsp104 WT להיות מבודד כמו "להיטים". זה עשוי בשל נוכחותם של גנטי ספונטנימדכאי או פעילות חלשה מאוד. כדי לעקוף בעיה זו, מצאנו כי הקרנה בטמפרטורות גבוהות (למשל 34 מעלות צלזיוס) יכולה להקטין את אחוז "הלהיטים" כי הם Hsp104 WT. כמו כן הוא חיוני מחדש שיבוט כל להיטי Sequenced להעריך באופן עצמאי את הפעילות של כל גרסאות רומן ועל מנת להבטיח טוהר פלסמיד. ברגע שלהיטים חדשים מזוהים, הם יכולים להיות מוערכים לדיכוי הצבירה בשמרים ומאופיין ביוכימית.
יש לנו להשתמש בשיטות אלה כדי לבודד potentiated Hsp104 גרסאות נגד TDP-43, FUS, וα-סינוקלאין ומאומתים פעילותם באמצעות מבחני ביוכימיה חלבון טהור 17. סופו של דבר, יכולים להשתמש בשיטות אלה כדי להקרין ספריות חלבון נגד כל מצע של עניין, כי הוא רעיל בשמרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
