Introduction
खमीर proteinopathy मॉडल amyotrophic पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) और पार्किंसंस रोग (पीडी) 1-3 सहित प्रोटीन-misfolding विकारों के लिए विकसित किया गया है. ए एल एस रोगियों में misfold जो प्रोटीन तेदेपा-43 और FUS, की अभिव्यक्ति, खमीर 1,2 में cytoplasmic समुच्चय के लिए फार्म विषाक्त और mislocalize हैं. इसी तरह, पीडी में फंसा है जो α-synuclein (α-SYN), की अभिव्यक्ति, विषाक्त है और mislocalizes खमीर 3 में cytoplasmic समुच्चय के रूप में. इन सुविधाओं को इन विकारों 4,5 के साथ रोगियों में phenotypes पुनरावृत्ति. इस प्रकार, खमीर मॉडल को रोकने या इन phenotypes 2,6-13 रिवर्स कि प्रोटीन या छोटे अणुओं के लिए स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी मंच प्रदान करते हैं. हम कारण तेदेपा-43, FUS, और α-syn करने के एकत्रीकरण और विषाक्तता पीछे करने में सक्षम हैं कि प्रोटीन के विकास में रुचि रखते हैं. हम Hsp104, दोनों fr प्रोटीन disaggregating के विशिष्ट सक्षम है कि खमीर से एक एएए + प्रोटीन पर ध्यान केंद्रितखमीर में ओम अनाकार समुच्चय और amyloid, अभी तक यह कोई मानव सजात 14,15 है. Hsp104 सूक्ष्मता अंतर्जात खमीर prions disaggregate को देखते हैं और यह आमतौर पर 16,17 मुठभेड़ों कभी नहीं जो मानव neurodegenerative रोगों में फंसा substrates के disaggregate के लिए ही सीमित क्षमता है. इस प्रकार, हम प्रभाव के साथ इन मानव substrates के disaggregate करने में सक्षम हैं कि Hsp104 का परिष्कृत संस्करण इंजीनियर का लक्ष्य. Hsp104 त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग वेरिएंट की ऐसा करने के लिए, हम बड़े पुस्तकालयों का निर्माण; इन पुस्तकालयों खमीर proteinopathy मॉडल 17 का उपयोग कर जांच की जा सकती है. Hsp104 17 बहुत बड़ी है, जैसा कि हम पुस्तकालयों का निर्माण और स्क्रीनिंग के लिए एक डोमेन-लक्षित दृष्टिकोण अपनाया है. इसी दृष्टिकोण अन्य डोमेन स्क्रीन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, हालांकि हम शुरू में, बीच डोमेन Hsp104 17 का (एमडी) पर ध्यान केंद्रित किया. इस तरह बाकी है जो सतह प्रदर्शन, के रूप में वैकल्पिक तकनीकों के लिए विरोध के रूप में इन मॉडलों, सीधे disaggregase गतिविधि के लिए स्क्रीनिंग सक्षम18 बाध्यकारी निगरानी के लिए उपयोग करने के लिए ricted.
हमारी प्रोटोकॉल दो स्क्रीनिंग कदम (चित्रा 1) पर आधारित है. सबसे पहले, खमीर में रोग सब्सट्रेट की विषाक्तता को दबाने कि Hsp104 वेरिएंट चयनित हैं. ऐसा करने के लिए, Hsp104 वेरिएंट और रोग-जुड़े सब्सट्रेट Δ hsp104 खमीर में cotransformed रहे हैं. हम जंगली प्रकार की अनुपस्थिति (डब्ल्यूटी) Hsp104 17 में Hsp104 अनुक्रम अंतरिक्ष का पता लगाने के लिए Δ hsp104 खमीर रोजगार. महत्वपूर्ण बात है, Hsp104 का विलोपन खमीर में α-syn, FUS, या तेदेपा-43 विषाक्तता को प्रभावित नहीं करता, और Hsp104 गुम्मट की अभिव्यक्ति न्यूनतम बचाव 1,13,17 प्रदान करता है. खमीर तो दोनों प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए मीडिया उत्प्रेरण पर चढ़ाया जाता है. कॉलोनी की बीमारी से जुड़े सब्सट्रेट प्रदान विकास की विषाक्तता को दबाने कि Hsp104 वेरिएंट शरण खमीर. कालोनियों विषाक्तता मरने को दबाने नहीं है कि वेरिएंट को बनाए रखते हुए ये वेरिएंट, आगे के विश्लेषण के लिए चुने गए हैं. हालांकि,झूठी सकारात्मक इस स्क्रीन में एक पर्याप्त समस्या हैं. तेदेपा-43, FUS, और α-syn की अभिव्यक्ति व्यक्त की जा रही Hsp104 संस्करण के लिए असंबंधित विषाक्तता का सहज आनुवंशिक दमन की उपस्थिति के लिए एक मजबूत चयनात्मक दबाव बनाता है, जो बेहद जहरीला कर रहे हैं. इस प्रकार, हम भी इन अविशिष्ट विषाक्तता दमन 17 को खत्म करने के लिए अपेक्षाकृत उच्च throughput है कि एक माध्यमिक स्क्रीन का इस्तेमाल किया है. इस माध्यमिक स्क्रीन में, चयनित खमीर Hsp104 प्लाज्मिड 19 के लिए चयन का मुकाबला करने के लिए 5-Fluorootic एसिड (5 FOA) के साथ व्यवहार कर रहे हैं. स्ट्रेन तो सब्सट्रेट की विषाक्तता Hsp104 प्लाज्मिड के नुकसान के बाद बहाल है कि यह सुनिश्चित करने के लिए परख खोलना के माध्यम से (तेदेपा-43, FUS, या α-SYN) विषाक्तता सब्सट्रेट के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. इस प्रकार, विषाक्तता इस माध्यमिक स्क्रीन में बहाल है जिसमें खमीर शायद मूल कारण Hsp104 संस्करण की उपस्थिति के लिए विषाक्तता दमन का प्रदर्शन किया. ये खमीर 'हिट' के रूप में नामित कर रहे हैं और Hsp104 प्लाज्मिड तो होना चाहिएबरामद और Hsp104 जीन 17 (चित्रा 1) में उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए अनुक्रम. किसी भी हिट तो विषाक्तता दमन के लिए retesting तो स्वतंत्र रूप से उत्परिवर्तन निर्माण साइट निर्देशित mutagenesis के उपयोग करते हुए और से reconfirmed किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल के लिए आवेदन संभावित व्यापक हैं. इन विधियों का प्रयोग, प्रोटीन के किसी भी प्रकार के पुस्तकालयों खमीर में विषाक्त है कि किसी भी सब्सट्रेट प्रोटीन की विषाक्तता को दबाने कि वेरिएंट के लिए जांच की जा सकती है.
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Protocol
1. लाइब्रेरी पीढ़ी
- डोमेन-विशिष्ट त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग Hsp104 के पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए, पहले एक त्रुटि प्रवण डीएनए पोलीमरेज़ 20 के साथ ब्याज की डोमेन बढ़ाना.
- जेल निष्कर्षण द्वारा पीसीआर उत्पाद शुद्ध.
- एक मानक साइट निर्देशित mutagenesis के प्रोटोकॉल का उपयोग एक megaprimer विस्तार कदम प्रदर्शन: पीसीआर बफर में 50 एनजी टेम्पलेट प्लाज्मिड, 250 एनजी megaprimer, 200 माइक्रोन dNTPs, और उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ गठबंधन, और पीसीआर ग्रेड पानी 20 से 50 μl कुल मात्रा को पतला . एक मानक पीसीआर कार्यक्रम चलाते हैं.
नोट: परिलक्षित हो रहा है कि जीन की विशेष क्षेत्र के आधार पर अलग अलग होंगे प्रयुक्त विशिष्ट प्राइमरों.- पीसीआर के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1 μl DPN मैं प्रतिबंध एंजाइम के साथ पैतृक टेम्पलेट डीएनए को पचाने.
- Ultracompetent ई में electroporation या अन्य तरीकों से पुस्तकालय रूपांतरण कोलाई Miniprep से यह शुद्ध और.
नोट: लाइब्रेरी पीढ़ीकाफी हद तक एक भी प्रयोग के उद्देश्य पर आधारित होती है. Hsp104 एक बहुत बड़ी प्रोटीन है, तो यह हम डोमेन-विशिष्ट त्रुटि प्रवण पीसीआर का उपयोग यही वजह है कि पूरे जीन, randomize के लिए अव्यावहारिक है. साथ ही, Hsp104 की संरचना खराब 21 को चुनौती देने का निर्देश पुस्तकालयों की डिजाइन बनाने, समझा रहता है. पुस्तकालय केवल प्रतिबंध टेम्पलेट प्लाज्मिड रीढ़ डेक्सट्रोज मीडिया पर 5 FOA काउंटर चयन के लिए अनुमति देने के लिए URA3 जीन शामिल करना चाहिए कि होने के साथ, mutagenesis के लिए निर्देशित या यादृच्छिक दृष्टिकोण का उपयोग कर निर्माण किया जा सकता.
Hsp104 लाइब्रेरी 2. परिवर्तन
- एक मानक लिथियम एसीटेट / खूंटी परिवर्तन प्रोटोकॉल 22 का उपयोग W303aΔ hsp104 खमीर में रोग-जुड़े सब्सट्रेट एकीकृत. एकल कालोनियों का चयन करें और सब्सट्रेट 23 जुड़े रोग के उच्च विषाक्तता के साथ एक तनाव को अलग करने की विषाक्तता के लिए उन्हें स्क्रीन.
नोट: एक एकीकृत तनाव और इसोला का प्रयोग करेंसभी कोशिकाओं में समान अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए एक भी कॉलोनी ते. PAG416GAL प्लाज्मिड (uracil मार्कर) 24 में uracil के अलावा अन्य किसी भी मार्कर (हम हिस्टडीन उपयोग) और Hsp104 पुस्तकालय के तहत जीन के एकीकरण की अनुमति एक प्लाज्मिड में रोग सब्सट्रेट क्लोन. 5-FOA counterselection के लिए अनुमति देने के लिए, पुस्तकालय uracil मार्कर के साथ एक प्लाज्मिड से व्यक्त किया है कि यह सुनिश्चित करें. अन्य खमीर उपभेदों भी नियोजित किया जा सकता. हम W303a और दोनों WT और Δ hsp104 पृष्ठभूमि में BY4741 खमीर उपभेदों (mej और जे एस, अप्रकाशित टिप्पणियों) का उपयोग कर एक समान विषाक्तता दमन फेनोटाइप का उल्लेख किया है. - एक ही लिथियम एसीटेट / खूंटी परिवर्तन प्रोटोकॉल 22 का उपयोग करते हुए इस तनाव में Hsp104 पुस्तकालय रूपांतरण. पुस्तकालय के अनुक्रम अंतरिक्ष बनाए रखने के लिए और भविष्यवाणी पुस्तकालय आकार को बनाए रखने के लिए उचित परिवर्तन को पैमाने पर.
- करने के लिए पर्याप्त प्लेट का उपयोग noninducing, चयनात्मक प्लेटों पर परिवर्तन मिश्रण (जैसे एसडी उनका-ura) प्लेटकालोनियों की एक बड़ी संख्या के विकास को सुनिश्चित करते हैं. जरूरत प्लेटों की संख्या कम करने के लिए बड़े पेट्री डिश (150 मिमी) का प्रयोग करें. प्लेट का उपयोग transformants उबर परिवर्तन दक्षता का आकलन किया जा सकता है.
- समानांतर में Hsp104 WT और वेक्टर नकारात्मक नियंत्रण रूपांतरण.
Proteotoxicity के दमन के लिए 3. स्क्रीनिंग
- Raffinose पूरक ख़ारिज मीडिया (जैसे SRaff उसका ura) का उपयोग कर प्लेटें बंद कालोनियों धो लें. प्लेटों से कालोनियों ढीला करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक और बाँझ लकड़ी applicators का प्रयोग करें. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और भंवर के लिए तरल washes के स्थानांतरण को अच्छी तरह से कोशिकाओं के किसी भी गुच्छों अलग करने के लिए. एक थोड़ा बादल संस्कृति, आयुध डिपो 600 ~ 0.025 को पतला.
नोट: यहाँ raffinose इस प्रकार गैलेक्टोस की मध्यस्थता शामिल करने के लिए कोशिकाओं को भड़काना, प्रेरण की ग्लूकोज की मध्यस्थता दमन की कोशिकाओं को राहत देने के लिए कार्य करता है. - 3 झटकों के साथ raffinose ख़ारिज मीडिया में रातोंरात पतला संस्कृति विकसित0 डिग्री सेल्सियस. समानांतर में Hsp104 WT और वेक्टर नियंत्रण के लिए आगे बढ़ें.
- अगली सुबह, व्यक्तिगत गैलेक्टोस पर सांद्रता का एक सीमा प्लेट (जैसे SGal उसका ura) प्लेट (400 μl कुल मात्रा में संस्कृति केंद्रित 2 मिलीलीटर 1 μl). सांद्रता का एक व्यापक रेंज चढ़ाना एक थाली एकल कालोनियों होगा कि यह सुनिश्चित करेंगे. आवश्यक वास्तविक एकाग्रता ब्याज की बीमारी सब्सट्रेट की विषाक्तता पर निर्भर करता है.
- पुस्तकालय के 600 आयुध डिपो के लिए वेक्टर और Hsp104 गुम्मट संस्कृतियों मानक के अनुसार और नियंत्रण करने के लिए पुस्तकालय रिश्तेदार की वृद्धि की तुलना करने के बराबर मात्रा थाली.
- चयन तंगी का आकलन करने के लिए, मीडिया (दमन) ग्लूकोज पर पुस्तकालय थाली. कालोनियों (चित्रा 2) दिखाई देते हैं, जब तक 30 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं. परिणामस्वरूप कालोनियों का आकलन और नियंत्रण करने के लिए की तुलना करें.
नोट: अक्सर दोनों बड़े और छोटे कालोनियों प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन कॉलोनी आकार और कानून के बीच कोई संबंधivity मनाया जाता है. अनुक्रमण के लिए खत्म किया झूठी सकारात्मक कम करने के लिए एक 5-FOA काउंटर चयन तकनीक (4.) का उपयोग कर इन संभावित हिट स्क्रीन.
4. 5-FOA Counterselection और खोलना झूठी सकारात्मक समाप्त करने के लिए
- डबल और सिंगल ख़ारिज मीडिया पर दो प्रतियों में एकल कालोनियों (जैसे एसडी उनका-Ura और एसडी उनकी प्लेट) और 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बढ़ने बाहर स्ट्रीक. वेक्टर और Hsp104 गुम्मट नियंत्रण के साथ दोहराएँ. पर चढ़ाना एसडी उनके पहले 5 FOA वे 5 FOA पर चढ़ाया जाता है जब कोशिकाओं Hsp104 प्लाज्मिड खो दिया है कि संभावना में वृद्धि से 5 FOA कदम की क्षमता बढ़ जाती है.
- 5-FOA स्क्रीन प्रदर्शन करते हुए बाहर सुखाने से प्लेटों को रोकने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर एसडी उनका-Ura parafilm में प्लेटें और दुकान लपेटो. ये प्लेटें अंततः अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- स्ट्रीक से कालोनियों एसडी-अपने 5-FOA प्लेटों पर एकल कालोनियों को प्लेट (YPD मीडिया + 1G / एल 5-FOA) और व 30 में 1-2 दिनों के लिए सेते# 186; सी एकल कालोनियों दिखाई देते हैं जब तक. यहां, 5-FOA URA3 जीन होते हैं कि कोशिकाओं में एक जहरीले उत्पाद (5 fluorodeoxyuridine) में बदल जाता है. इस प्रकार, अब भी Hsp104 प्लाज्मिड को शरण देने के लिए किसी भी कोशिकाओं मर जाएगा.
- स्ट्रीक एसडी Ura और एसडी उनकी प्लेटों पर दो प्रतियों में 5 FOA प्लेटों से एकल कालोनियों. प्रत्येक के लिए टेस्ट 3 कालोनियों प्रत्येक हिट के लिए कम से कम एक कॉलोनी Hsp104 प्लाज्मिड खो दिया है कि संभावना में वृद्धि करने के लिए मारा. 30 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए सेते हैं. एसडी उनकी प्लेटों लेकिन नहीं एसडी Ura प्लेटों पर विकसित होगा Hsp104 प्लाज्मिड खो दिया है कि कालोनियों.
- Assays के खोलना के लिए Hsp104 प्लास्मिड खो दिया है कि स्ट्रेन बढ़ता है. झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात 96 DeepWell 2 मिलीलीटर प्लेटों में (जैसे SRaff-उनकी) raffinose ख़ारिज मीडिया में संतृप्ति को स्ट्रेन बढ़ता है. 5-FOA इलाज नियंत्रण उपभेदों शामिल करना न भूलें.
- परख खोलना के लिए प्लेटें तैयार करें. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, विभाज्य 200 μl raffinose ख़ारिज मीडिया (जैसे SRaff-उनकी) प्रतिएक 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से, आरक्षण कॉलम साफ संस्कृतियों के लिए 1 और 7. विभाज्य 250 कॉलम 1 में 16 संतृप्त संस्कृतियों में से प्रत्येक के μl और थाली की 7.
- क्रमानुसार एक multichannel विंदुक के साथ अच्छी तरह से मिश्रण, थाली के प्रत्येक स्तंभ में संस्कृतियों 5 गुना पतला. प्रत्येक अच्छी तरह से अंतिम मात्रा सुनिश्चित करने के लिए कॉलम 6 और 12 से पतला संस्कृति की 50 μl निकालें 200 μl है. यह भी खोलना सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है.
- एक 96-बोल्ट प्रतिलिपिकार उपकरण (Frogger) का उपयोग करना, एसडी उनकी और SGal-उनकी प्लेटों पर दो प्रतियों में संस्कृतियों हाजिर. 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
- नियंत्रण के समान SGal-उनकी प्लेटों पर विषाक्तता कि प्रदर्शन उपभेदों क्रमबद्ध करने के लिए चुनें. नियंत्रण के रूप में के रूप में विषाक्त नहीं कर रहे हैं कि के रूप में झूठी सकारात्मक स्ट्रेन त्यागें. 5-FOA भी अपने दम पर अक्सर विषैला होता है, तो अकेले रोग सब्सट्रेट से एसडी उनकी प्लेटों पर एक विकास दोष या कि प्रदर्शनी में काफी अधिक विषाक्तता कि प्रदर्शन स्ट्रेन (त्यागने
5. कॉलोनी पीसीआर द्वारा Hsp104 वेरिएंट अनुक्रमण
- परिमार्जन ~ 10 μl पीसीआर पट्टी ट्यूबों में 3 μl 20 मिमी NaOH में एसडी उनका-Ura प्लेटों से खमीर और फ्रीज पिघलना द्वारा कोशिकाओं lyse. फिर 10 मिनट के लिए एक thermocycler में 99 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, 10 मिनट के लिए या तरल नाइट्रोजन में एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में पट्टी ट्यूब रखें. पीसीआर ग्रेड पानी के साथ 100 μl को स्ट्रेन पतला.
- पीसीआर प्रतिक्रियाओं तैयार: 5 μl पीसीआर टेम्पलेट, 0.5 μl 100 माइक्रोन प्रत्येक प्राइमर, 0.5 μl 10mM dNTPs, पीसीआर बफर में 0.25 μl डीएनए पोलीमरेज़, और पीसीआर ग्रेड पानी के साथ 25 μl कुल मात्रा पर निर्भर करते हैं. डिजाइन प्राइमरों यादृच्छिक क्षेत्र के साथ साथ दोनों छोर पर लगभग 100 बीपी बढ़ाना. सफल प्रवर्धन की संभावना में वृद्धि को परिलक्षित क्षेत्र का आकार छोटा करें. एक मानक पीसीआर कार्यक्रम चलाते हैं.
- उचित siz की एक पीसीआर उत्पाद के प्रवर्धन पुष्टि करने के लिए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा नमूनों का विश्लेषणई. कोई उत्पाद मौजूद है अगर पीसीआर दोहराएँ.
नोट: पीसीआर विफलता आम तौर पर कदम 5.1 में इस्तेमाल किया जा रहा है बहुत अधिक खमीर की वजह से है. - डीएनए अनुक्रमण के लिए नमूने तैयार करें. ऐसे exonuclease मैं और चिंराट alkaline फॉस्फेट एंजाइम के रूप में पीसीआर शुद्धि या एक पीसीआर उत्पाद सफाई अभिकर्मक का उपयोग करके या तो पीसीआर प्राइमरों निकालें (ExoSAP आईटी) एकल असहाय डीएनए नीचा करने के लिए. इस अभिकर्मक enzymatically उच्च throughput के लिए अनुमति देता है, अनिगमित प्राइमरों और dNTPs degrades.
- पीसीआर उत्पादों अनुक्रम. अच्छी तरह से परिवर्तन के लिए अनुक्रमण chromatograms का विश्लेषण करने के लिए सुनिश्चित करें. अक्सर कई प्लास्मिड बंदरगाह खमीर के रूप में उत्परिवर्तन, किसी साइट (चित्रा 4) में दो न्यूक्लियोटाइड का एक मिश्रण के रूप में देखा जा सकता है.
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Representative Results
हम मध्यम डोमेन बेतरतीब Hsp104 वेरिएंट की एक पुस्तकालय का निर्माण और तेदेपा-43 विषाक्तता के दमन के लिए यह जांच की है. पुस्तकालय तब्दील और स्क्रीन की तंगी का आकलन करने के लिए ग्लूकोज और गैलेक्टोज प्लेट (चित्रा 2) पर चढ़ाया गया था. एकल कालोनियों चयन किया गया था और दबाव काउंटर Hsp104 प्लाज्मिड को खत्म करने के लिए 5-FOA का उपयोग कर चयन किया गया था. ये स्ट्रेन तो उस विषाक्तता पुष्टि करने के लिए मूल्यांकन किया गया Hsp104 वेरिएंट के बिना, तेदेपा-43 अकेले की वजह से था. प्रारंभिक स्क्रीन में चयनित वेरिएंट की एक सबसेट का खोलना assays के चयनित 4 कालोनियों की, 2 1 एक झूठी सकारात्मक था, Hsp104 की मध्यस्थता तेदेपा-43 विषाक्तता दमन प्रदर्शित, और 1 5 FOA इलाज के बाद बढ़ाया विषाक्तता प्रदर्शित पता चला है कि (चित्रा 3). 2 सच हिट तो बीच डोमेन म्यूटेशन (चित्रा 4) को पहचानने के लिए कॉलोनी पीसीआर द्वारा अनुक्रम गया. इन उत्परिवर्तन की पहचान की गई एक बार, Hsp104 उत्परिवर्तन निर्माण किया गया था नए सिरे से साइट निर्देशित mutagenesis के द्वारा पैतृक Hsp104 प्लाज्मिड में विषाक्तता दमन पुष्टि करने के लिए. इन तरीकों का उपयोग कर चयनित वेरिएंट बाद में खमीर में एकत्रीकरण, जैव रासायनिक assays में स्पष्ट preformed समुच्चय को दबाने, और एक सी में डोपामिनर्जिक neurodegeneration को दबाने के लिए की पुष्टि की थी पीडी 17 की एलिगेंस मॉडल.
चित्रा 1:. Potentiated Hsp104 वेरिएंट के लिए अलग फ्लो-चार्ट Hsp104 पुस्तकालयों (URA3 मार्कर, GAL1 प्रमोटर) रोग के substrates (HIS3 मार्कर, GAL1 प्रमोटर) युक्त खमीर में तब्दील हो और उत्प्रेरण मीडिया पर चढ़ाना द्वारा विषाक्तता दमन के लिए जांच कर रहे हैं. संभावित हिट तो अविशिष्ट विषाक्तता दमन खत्म करने के लिए एक 5-FOA counterselection कदम का उपयोग कर फिर से जांच कर रहे हैं. इस दूसरे चरण में चयनित वेरिएंट तो कॉलोनी पीसीआर द्वारा अनुक्रम रहे हैं. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52089/52089fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank" href> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2:. PAG303GAL-तेदेपा-43 और pAG416GAL-Hsp104 पुस्तकालय के साथ cotransformed विषाक्तता दमन के लिए स्क्रीनिंग खमीर ग्लूकोज पर (दमन) या गैलेक्टोस (उत्प्रेरण) मीडिया चढ़ाया गया. तेदेपा-43 बेहद जहरीला है, तो बहुत कुछ Hsp104 वेरिएंट इस विषाक्तता को दबाने में सक्षम हैं, और इस स्क्रीन बहुत कठोर है. 5-FOA माध्यमिक स्क्रीन के लिए गैलेक्टोस थाली से हिट के रूप में एकल कालोनियों चुने गए हैं. दोनों बड़े और छोटे कालोनियों आम तौर पर प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन हम कॉलोनी आकार गतिविधि के साथ संबद्ध कैसे नियंत्रित करती हैं कि किसी भी रुझान नहीं मनाया है.
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चित्रा 3:. 5-FOA माध्यमिक स्क्रीन खमीर परख खोलना द्वारा मूल्यांकन किया गया Hsp104 प्लाज्मिड के लिए चयन का मुकाबला करने के लिए 5-FOA के साथ इलाज किया. स्ट्रेन एसडी उनकी और SGal-उनकी प्लेटों पर क्रमानुसार 5 गुना पतला, SRaff-अपने मीडिया में हो गई, और दो प्रतियों में देखा गया था. Hsp104 A503V हम पहले से सत्यापित और अकेले 17 वेक्टर के साथ एक नियंत्रण के रूप में यहाँ दिखा दिया है कि एक सच्चे हिट है. पंक्तियाँ 3 और 4 Hsp104 शमन करने की तेदेपा-43 विषाक्तता निम्नलिखित नुकसान बनाए रखने कि पुस्तकालय हिट हैं. पंक्ति 5 तेदेपा-43 अब कोई विषैला होता है, जहां एक झूठी सकारात्मक पता चलता है, तो एक अविशिष्ट विषाक्तता का शमन मौजूद है. पंक्ति 6 आम तौर पर संभवतः कारण 5-FOA विषाक्तता के लिए है, तेदेपा-43 से अधिक विषैला होता है कि तनाव से पता चलता है. इस तनाव अभी भी अनुक्रम किया जा सकता है, लेकिन एक वैध हिट नहीं हो सकता है.
चित्रा 4. गुदाअनुक्रमण परिणाम yzing. चयनित खमीर अक्सर कई प्लास्मिड गये हैं. इसलिए, कॉलोनी पीसीआर उत्पादों की अनुक्रमण के बाद, देखभाल किसी म्यूटेशन chromatograms में अनदेखी नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. इस वर्णलेख में, (* से चिह्नित) दो संभावित म्यूटेशन अनदेखा किया जा सकता है. पहले उदाहरण में, एक और टी के और दूसरे में एक मिश्रण, टी और सी का एक मिश्रण है
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Discussion
यहाँ हम खमीर proteinopathy मॉडल का उपयोग कर रोग से जुड़े substrates की विषाक्तता को दबाने कि potentiated Hsp104 वेरिएंट को अलग करने के लिए हमारे दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं. इस दृष्टिकोण का प्रयोग, वेरिएंट के बड़े पुस्तकालयों केवल सीमा 5-FOA माध्यमिक स्क्रीन कि पास वेरिएंट की संख्या होने के साथ, उच्च throughput में जांच की जा सकती है. 96 प्रारूप में इन चरणों का प्रदर्शन करके, हम नियमित रूप से 1-2 सप्ताह के पाठ्यक्रम पर 5 FOA कदम में एक समय में 200 हिट करने के लिए स्क्रीन. प्रारंभिक जांच चरण के दौरान प्राप्त की हिट फिल्मों की संख्या काफी हद तक सब्सट्रेट विषाक्तता और प्रत्येक विशेष पुस्तकालय के श्रृंगार के आधार पर अलग अलग होंगे. हिट अनुक्रमण है, यह plasmids के मिश्रण आमतौर पर प्रत्येक कोशिका में मौजूद हैं के बाद से ध्यान से सभी अनुक्रमण chromatograms का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है.
हम कभी कभी Hsp104 गुम्मट का एक बड़ा प्रतिशत 'हिट' के रूप में अलग किया जा रहा है का उल्लेख किया है. इस वजह से सहज आनुवंशिक की मौजूदगी की संभावना हैदमन या बहुत कमजोर गतिविधि. इस समस्या को नाकाम करने के लिए, हम ऊंचा तापमान (जैसे 34 डिग्री सेल्सियस) पर स्क्रीनिंग Hsp104 गुम्मट हैं कि 'हिट' का प्रतिशत कम कर सकते हैं कि मिल गया है. यह फिर से क्लोन किसी अनुक्रम हिट स्वतंत्र रूप से किसी भी उपन्यास वेरिएंट की गतिविधि का आकलन करने के लिए और प्लाज्मिड शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए भी आवश्यक है. नए हिट पहचान कर रहे हैं, वे खमीर में एकत्रीकरण के दमन के लिए मूल्यांकन और biochemically होती जा सकता है.
हम Hsp104 तेदेपा-43, FUS, और α-synuclein के खिलाफ वेरिएंट potentiated अलग करने के लिए इन तरीकों का इस्तेमाल किया और शुद्ध प्रोटीन जैव रसायन assays के 17 का उपयोग करते हुए उनकी गतिविधियों को सत्यापित किया है. अंत में, इन तरीकों खमीर में विषैला होता है कि ब्याज की किसी भी सब्सट्रेट के खिलाफ प्रोटीन पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150 mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2 ml Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a 'druggable' Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L. Methods in Enzymology. Wittrup, K. D., Verdine, G. L. 503, Academic Press. 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. Methods in Enzymology. 154, Academic Press. Lawrence Grossman Ray Wu. 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, Humana Press. 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D.
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
