Abstract
1970 के दशक पश्चिमी धब्बा, उपस्थिति और जटिल जैविक नमूने भीतर विशिष्ट प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत का आकलन करने के लिए एक तकनीक के पहले सार्वजनिक रूप से सूचना दी प्रयोग देखा. तब से, पश्चिमी सोख्ता पद्धति आणविक जीव प्रयोगात्मक प्रदर्शनों की सूची का एक आम घटक बन गया है. शब्द "पश्चिमी धब्बा" का उपयोग PubMed का एक सरसरी खोज २२०००० प्रकाशित पांडुलिपियों से अधिक महत्वपूर्ण बात है वर्ष 2014 तक इस तकनीक का इस्तेमाल किया है पता चलता है कि पिछले दस साल के विकास के साथ मिलकर तकनीकी इमेजिंग अग्रिम देखा है संवेदनशीलता में सुधार और रैखिक का पता लगाने की भी अधिक से अधिक श्रेणियों मिले हैं, जिनमें से संवेदनशील फ्लोरोसेंट लेबल. परिणाम जीव पहले से कहीं अधिक संवेदनशीलता और सटीकता के साथ तुलनात्मक अभिव्यक्ति विश्लेषण बाहर ले जाने के लिए अनुमति देता है कि वेस्टर्न ब्लाट (QFWB) आधारित एक अब सही मायने में quantifiable प्रतिदीप्ति है. कई "अनुकूलित" पश्चिमी सोख्ताके तरीके मौजूद हैं और विभिन्न प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है. ये अक्सर कारण सूक्ष्म लेकिन undocumented प्रक्रियात्मक संशोधन की आवश्यकता को लागू करने के लिए मुश्किल साबित होते हैं. इस प्रोटोकॉल समस्या निवारण रणनीतियों के साथ पूरा एक स्थापित और मजबूत QFWB विधि के लिए एक व्यापक विवरण, प्रदान करता है.
Introduction
पश्चिमी सोख्ता (पश्चिम बंगाल) मूल रूप से इस तरह के एक ऊतक homogenate 1 के रूप में, एक जटिल जैविक नमूने में ब्याज की एक प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए 1970 के दशक में विकसित एक विश्लेषणात्मक तकनीक है. आमतौर कारण कुंजी एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत करने के लिए, प्रोटीन immunoblot के रूप में भेजा, कार्यप्रणाली 5 अलग चरणों के होते हैं: उनके समविद्युतविभव बिंदु से प्रोटीन की 1) electrophoretic जुदाई; 2) एक nitrocellulose या polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली के लिए स्थानांतरण; 3) ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग लेबलिंग; प्राथमिक एंटीबॉडी के खिलाफ निर्देशित एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 4) ऊष्मायन; और 5) दृश्य.
दृश्य कार्यप्रणाली सुरक्षा और संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए समय के साथ विकसित किया गया है. पहले WBS में से कुछ तो अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल chemilluminescent (ईसीएल) के तरीकों तो वर्णमिति और प्रगति की जो रेडियो लेबल टैग का उपयोग किया गया. Radioactiviवर्णमिति और ईसीएल के तरीके ऐसे alkaline फॉस्फेट या streptavidin हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के रूप में 2 एक एंजाइम संवाददाता के साथ एक अप्रत्यक्ष लेबलिंग तकनीक का उपयोग जबकि Ty सीधे विशिष्ट प्रतिजन के लिए जांच पर चिह्नित किया गया. क्रोमाजेन या luminescent उत्पाद की लेबलिंग की तीव्रता मजबूत या कमजोर संकेत ताकत, नमूने में ब्याज की प्रोटीन की अधिक या कम उपस्थिति को इंगित करता है जिससे densitometry का उपयोग कर मापा जाता है. ईसीएल अधिक संवेदनशील है और इसलिए इष्ट कार्यप्रणाली 2 है लेकिन सभी 3 तरीकों शुरू में बाद में 3 की स्थापना की और अधिक परिष्कृत डिजिटल इमेजिंग तकनीक के साथ एक्स-रे फिल्म पर विकसित किए गए. पश्चिम बंगाल के डिजिटल इमेजिंग की उन्नति न केवल ब्याज की अपने प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक शोधकर्ता की अनुमति दी है, लेकिन अन्य नमूने के खिलाफ मुकाबले जब भी किसी चयनित प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर एक अनुमान अनुमति दी है और इसलिए के रूप में भेजा जा सकता है "अर्द्ध मात्रात्मक & #8221 ;. मापा प्रतिदीप्ति का स्तर सीधे एक नमूना भीतर मात्रा और एक भी प्रोटीन की अभिव्यक्ति से संबंधित है जिसके तहत हाल ही में, एक सही मायने में मात्रात्मक और अधिक संवेदनशील पश्चिमी सोख्ता तकनीक विकसित की गई है: मात्रात्मक (QFWB) सोख्ता पश्चिमी फ्लोरोसेंट.
ईसीएल लेबलिंग के साथ QFWB की तुलना, एक फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग एक रेखीय पता लगाने प्रोफाइल 4 उत्पन्न करता है. यह संकेत रैखिकता आम तौर पर सर्वत्र व्यक्त गृह व्यवस्था जीन 5,6 के साथ, यानी सीधे प्रोटीन अभिव्यक्ति से संबंधित 5 माइक्रोग्राम प्रति और संकेत संतृप्ति नीचे कम प्रोटीन भार, के साथ होता है, जहां ईसीएल तकनीकों के विपरीत है. यह असमानता सबसे अधिक संभावना संभावित संकेत संतृप्ति के एक उच्च संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप एक biotinylated माध्यमिक के लिए बाध्य करने के लिए एक avidin ईसीएल सब्सट्रेट के लिए उपलब्ध बाध्यकारी साइटों की एक बड़ी संख्या के कारण होता है. इस रूप में onl के लिए भेजा जा रहा ईसीएल आधार immunoblotting के लिए मुख्य कारणों में से एक हैY "अर्द्ध मात्रात्मक" 7. अभिव्यक्ति के स्तर में सूक्ष्म अंतर को मापने और गलत माप का कारण बन सकता है जब संकेत के संतृप्ति बिंदु महत्व का है. हाल के वर्षों में बढ़ती संवेदनशीलता और सूक्ष्म अभिव्यक्ति भिन्नता की पहचान का ब्यौरा व्यापक प्रोटिओमिक तकनीक के आगमन के सत्यापन प्रयोगों 8,9 के लिए सही मायने में मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता पर बढ़ती निर्भरता में हुई है. संवेदनशील मजबूत और सही मायने में मात्रात्मक पद्धति के आवेदन इसलिए महत्वपूर्ण है.
कई "अनुकूलित" पश्चिमी सोख्ता के तरीके अक्सर कारण औपचारिक दस्तावेज प्रोटोकॉल में स्पष्ट नहीं हो सकता है कि सूक्ष्म पद्धति समायोजन स्थापित करने के लिए या दोहराने के लिए मुश्किल साबित हो जो स्वतंत्र प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग किया गया है. इस QFWB के लिए एक स्थापित और मजबूत प्रोटोकॉल है और साथ ही आम समस्याओं था समस्या निवारण के लिए मूल्यवान रणनीति प्रदान करता हैटी कार्यान्वयन के दौरान उत्पन्न हो सकती है.
इस प्रोटोकॉल मूल murine मस्तिष्क homogenates साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन बाद ऊतकों के नमूनों और प्रजातियों 4,9,10 की एक विस्तृत रेंज में प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है. विशिष्ट समस्याओं के निवारण के लिए आवश्यक संभावित प्रोटोकॉल विविधताओं शामिल किए गए हैं.
Protocol
इस प्रोटोकॉल परिवर्तनशीलता को कम करने और स्थिरता में सुधार के क्रम में वाणिज्यिक उत्पादन बफ़र्स, जैल और हस्तांतरण के ढेर का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है. आवश्यक उपभोक्ता वस्तुओं की एक पूरी सूची के लिए सामग्री की सूची को देखें.
मैं-धब्बा तेजी से हस्तांतरण और ली भ्रष्टाचार ओडिसी इमेजिंग प्रणाली का उपयोग फ्लोरोसेंट पश्चिम बंगाल प्रोटोकॉल
नमूना 1. तैयारी
- बफर चयन / तैयारी
- नमूना homogenization के लिए एक उचित निकासी बफर चयन करें और सभी को नीचे की ओर तकनीक कार्यरत होना साथ बफर संगत है कि यह सुनिश्चित करें. एक निष्कर्षण बफर तैयार: RIPA बफर (25 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 7.6), 150 मिमी NaCl, 1% एनपी 40, 1% सोडियम deoxycholate, 0.1% एसडीएस) अलगाव नमूना से पहले 5% protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त.
नोट: वहाँ निष्कर्षण बफ़र्स के कई अलग अलग प्रकार उपलब्ध हैं और कोशिका के भीतर ब्याज की प्रोटीन के स्थान के आधार पर चयन कर रहे हैं. ये शामिल हैं, लेकिन नहीं कर रहे हैंRIPA बफर (पूरे सेल, माइटोकॉन्ड्रियल और परमाणु के घटकों), एनपी 40 lysis बफर (पूरे सेल या झिल्ली बाध्य) और Tris-ट्राइटन को सीमित (cytoplasmic बाध्य कंकाल). हालांकि, निष्कर्षण बफ़र्स भीतर कुछ रासायनिक डिटर्जेंट solubilize या यहां तक कि एक प्रोटीन को निष्क्रिय करने में मदद मिल सकती है लेकिन, यानी, Bicinchoninic एसिड (बीसीए) परख एक विशिष्ट प्रोटीन दृढ़ संकल्प परख का उपयोग करते समय प्रोटीन दृढ़ संकल्प के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. परख के साथ रासायनिक अनुकूलता के बारे में निर्माता के दिशा निर्देशों की जाँच करें.
- नमूना homogenization के लिए एक उचित निकासी बफर चयन करें और सभी को नीचे की ओर तकनीक कार्यरत होना साथ बफर संगत है कि यह सुनिश्चित करें. एक निष्कर्षण बफर तैयार: RIPA बफर (25 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच 7.6), 150 मिमी NaCl, 1% एनपी 40, 1% सोडियम deoxycholate, 0.1% एसडीएस) अलगाव नमूना से पहले 5% protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल युक्त.
- प्रोटीन निष्कर्षण / solubilization
- मैन्युअल जब तक एक Dounce या लगभग 1:10 / वी (ऊतक वजन / बफर मात्रा) डब्ल्यू तैयार निष्कर्षण बफर में एक polypropylene टिप के साथ एक हाथ से आयोजित बिजली homogenizer का उपयोग homogenization के द्वारा पीछा कैंची और / या स्केलपेल का उपयोग ऊतक नमूना तर एक चिकनी / संगत homogenate का उत्पादन किया है.
नोट: छोटे, / बहुमूल्य मुश्किल नमूने प्राप्त करने के लिए, डिटर्जेंट आधारित एक्सट्रेक्शन caएन अभी भी 1 से नीचे कारगर हो: 5. - 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने homogenization में पोस्ट करें. जब तक आवश्यक डिग्री सेल्सियस -80 पर solubilized प्रोटीन और दुकान युक्त सतह पर तैरनेवाला निकालें. बाद में यदि जरूरी हुआ तो आगे और अधिक कड़े निकासी की अनुमति देने के अघुलनशील छर्रों को बनाये रखें. प्रोटीन दृढ़ संकल्प कदम 1.3 के लिए आगे बढ़ें.
- मैन्युअल जब तक एक Dounce या लगभग 1:10 / वी (ऊतक वजन / बफर मात्रा) डब्ल्यू तैयार निष्कर्षण बफर में एक polypropylene टिप के साथ एक हाथ से आयोजित बिजली homogenizer का उपयोग homogenization के द्वारा पीछा कैंची और / या स्केलपेल का उपयोग ऊतक नमूना तर एक चिकनी / संगत homogenate का उत्पादन किया है.
- प्रोटीन दृढ़ संकल्प
- एक बीसीए, ब्रैडफोर्ड या इसी तरह परख का उपयोग करके प्रत्येक निकाले नमूना भीतर प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण. मानक वक्र की गणना, दृढ़ संकल्प अनुपात, आर चुकता मूल्य के गुणांक के नमूने, 15 के भीतर प्रोटीन बहुतायत का सबसे सटीक दृढ़ संकल्प को दर्शाता है जो 0.99 से अधिक या बराबर है कि यह सुनिश्चित करें.
नोट: सभी नमूनों QFWB से तुलना की जा रही एक ही मानक वक्र के खिलाफ assayed किया जाना चाहिए.
- एक बीसीए, ब्रैडफोर्ड या इसी तरह परख का उपयोग करके प्रत्येक निकाले नमूना भीतर प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण. मानक वक्र की गणना, दृढ़ संकल्प अनुपात, आर चुकता मूल्य के गुणांक के नमूने, 15 के भीतर प्रोटीन बहुतायत का सबसे सटीक दृढ़ संकल्प को दर्शाता है जो 0.99 से अधिक या बराबर है कि यह सुनिश्चित करें.
- नमूना तैयार करना
- योजना और 2 समान जी के लिए सीढ़ी और नमूनों की लोडिंग क्रम रिकॉर्डएल्स: एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में स्थानांतरण और जेल 2 के लिए जेल 1. गरीब या स्पष्ट हस्तांतरण के साथ पैदा हो सकता है कि किसी भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए क्रमिक रूप से नियंत्रण और "इलाज" नमूने लोड.
- प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा की गणना. न्यूरोनल वियोजन में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक मानक प्रोटीन भार 15 माइक्रोग्राम प्रति है. DH 2 ओ के साथ एक 10 μl मात्रा के लिए प्रत्येक नमूना श्रृंगार 2 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर लोडिंग बफर, भंवर और गर्मी के 5 μl जोड़ें.
- इस तरह के ब्याज का सही बैंड की पहचान के साथ सहायता करने के लिए एक पुनः संयोजक प्रोटीन के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना शामिल करें. हालांकि गलत बैंड के चयन से बचने के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों का पालन सही ढंग से सकारात्मक नियंत्रण नमूना तैयार करते हैं. चित्रा 1 देखें.
चित्रा 1. पीositive नियंत्रण चयन. एक प्रयोग के लिए सकारात्मक नियंत्रण के अलावा पता लगाया लेबलिंग असली है की पुष्टि करता है. हालांकि, सावधानी से अपने नियंत्रण प्रयोगात्मक नमूने का उपयोग करने के लिए सही ढंग से पहले काम कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. ए) फ्यूजन प्रोटीन TREM 2 1 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के निर्माता के दिशा निर्देशों पर लोड किया गया था, लेकिन डेटा पत्रक के साथ 110 केडीए संघर्ष में मनाया लेबलिंग आणविक भविष्यवाणी 60-70 केडीए. बी) को कम करने एजेंट के साथ इसके अलावा और ऊष्मायन के बाद का वजन, संलयन प्रोटीन लेबलिंग की भविष्यवाणी की आणविक वजन कम पाया गया. हालांकि, इस कमी प्रक्रिया प्रोटीन का संकेत कमी हुई के रूप में अधिक से अधिक प्रोटीन लोड आवश्यक था मतलब.
प्रोटीन की 2. Electrophoretic पृथक्करण
- 4-12% बीआईएस / Tris जेल की तैयारी (1.0 मिमी)
नोट: ढाल जैल एक व्यापक आणविक वजन रेंज भर में अधिक से अधिक प्रोटीन जुदाई का उत्पादन किया जाता है.- चुनें और एमईएस तैयारया MOPS DH 2 ओ के साथ गिराए (टैंक प्रति 1 एल) बफर चल एमईएस बफर केडीए mops जबकि चल बफर हालांकि 15 केडीए नीचे कम आणविक वजन प्रोटीन के गरीब संकल्प होगा 200 केडीए ऊपर उच्च आणविक वजन प्रोटीन का पता लगाने के लिए पसंद किया जाता है 3.5-160 भीतर प्रोटीन का बेहतर संकल्प पैदा करता है.
- जेल के पैर को शामिल किया गया है कि कंघी और टेप की पट्टी निकालें. धीरे से एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग बफर चलाने के साथ कुओं बाहर धो लो. बफर चलाने के साथ कुओं भरें और कोई बुलबुले जेल में रहना सुनिश्चित करते हैं.
- जेल तैयारी और लदान
- टैंक में जैल डालें और सभी जवानों को प्रभावी ढंग से काम कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए बफर चलाने के साथ इंटर जेल डिब्बे भरें.
- बाद कुओं में जेल 1 और जेल 2. भार में पहले कुएं में प्रत्येक नमूने के 10 μl आणविक वजन मानक के 3 μl जोड़ें.
नोट: सीढ़ी के अपवाद के साथ, जेल 1 और जेल 2 समान होना चाहिए. यह आवश्यक वें हैओडिसी इमेजर की 700 चैनल में दिखाई करने के क्रम में कुल प्रोटीन दाग का उपयोग करते समय जेल 2 के लिए इस्तेमाल पूर्व दाग आणविक वजन मानक पर नीले और दिख रहा है. - दोनों जैल लोड कर रहे हैं एक बार, शेष चल बफर के साथ टैंक को भरने और ढक्कन सुरक्षित.
- वैद्युतकणसंचलन
- "भागो" नमूना सुनिश्चित करने के लिए 4 मिनट के लिए 80 वी पर जेल एक समान फैशन में polyacrylamide जेल मैट्रिक्स में प्रवेश करती है. इसके बाद क्रमश या नमूना डाई जेल के पैर में देखा जा सकता है जब तक 50 मिनट के लिए 180 वी वोल्टेज और समय को बढ़ाने.
नोट: उच्च voltages कम रन टाइम्स को प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, इस जैल के बीच नमूने तेजी से तापमान 14 में वृद्धि की वजह से बाहरी लेन नमूनों से चलाने जहां "स्माइली" जैल में हो सकता है.
- "भागो" नमूना सुनिश्चित करने के लिए 4 मिनट के लिए 80 वी पर जेल एक समान फैशन में polyacrylamide जेल मैट्रिक्स में प्रवेश करती है. इसके बाद क्रमश या नमूना डाई जेल के पैर में देखा जा सकता है जब तक 50 मिनट के लिए 180 वी वोल्टेज और समय को बढ़ाने.
लोड हो रहा है नियंत्रण जेल की 3. कुल प्रोटीन दाग
- का उपयोग कैसेट से रिहाई जेल 2एक जेल चाकू. कुओं और जेल के पैर निकालें. अभिविन्यास सहायता करने के लिए जेल के निशान.
- एक वर्ग पेट्री डिश (अनुमानित आकार 12 एक्स 12 सेमी) में प्रोटीन दाग की लगभग 30 मिलीलीटर छानना. समाधान सुनिश्चित करने के पूरे जेल को शामिल किया गया, प्रोटीन दाग में जेल 2 जगह, तो दाग कमरे के तापमान पर 1 घंटे के न्यूनतम के लिए जेल आंदोलन.
- प्रोटीन दाग छानना और पहले दृश्य के लिए आसुत जल में जेल 3x धो लो. कल्पना करने के लिए 6.3 कदम आगे बढ़ना.
4. मैं-धब्बा अर्ध शुष्क फास्ट प्रोटीन स्थानांतरण
नोट: मैं-धब्बा मशीन का उपयोग प्रोटीन हस्तांतरण के लिए आवश्यक सभी अभिकर्मकों विशेष रूप से मैं-धब्बा कार्यप्रणाली के लिए डिजाइन वाणिज्यिक उत्पादों रहे हैं और माल की सूची में पाया जा सकता है.
- "नीचे" स्थानांतरण ढेर तैयार करें. पन्नी को कवर किया और जेल की टंकी से प्रत्यक्ष बफर चलाने के साथ पूर्व गीला निकालें. आसुत जल के साथ पूर्व गीला फिल्टर पेपर.
- दोहराएँ कदम 3.1 और जगह जेल 1 परतैयार "नीचे" स्थानांतरण ढेर.
- जेल से अधिक पूर्व गीला फिल्टर पेपर निर्धारित करना. कोई बुलबुले परतों के बीच फंस रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर पेपर और जेल रोल.
- शीर्ष हस्तांतरण ढेर से पन्नी ढक्कन निकालें और फिल्टर पेपर और नीचे ढेर के शीर्ष पर शीर्ष ढेर रखना. किसी भी हवाई बुलबुले को खत्म करने के लिए स्थानांतरण हो चुकी है "सैंडविच" रोल.
- मैं-धब्बा मशीन का ढक्कन पर स्थानांतरण ढेर किट से स्पंज डालें. उसके बाद बंद ढक्कन सुरक्षित रूप से मैं-धब्बा मशीन पर समर्पित अंतरिक्ष पर स्थानांतरण ढेर सैंडविच रखें. मैं-धब्बा आरंभ और कार्यक्रम 3 पर 8.5 मिनट के लिए हस्तांतरण.
- एक कम प्रोटीन संकेत या असमान उच्च अगर वहाँ: कम आणविक भार प्रोटीन अनुपात एक अर्द्ध शुष्क "तेज" हस्तांतरण विधि का उपयोग करते समय, निर्माता के हस्तांतरण बार परीक्षण. चित्रा 2 में देखा के रूप में आदर्श स्थानांतरण वोल्टेज / समय संयोजन निर्धारित करने के समान भार का नमूना दोहराता का उपयोग कर एक सरल अनुकूलन प्रोटोकॉल भागो .
चित्रा 2. मैं-ब्लाट. एक का उपयोग कर स्थानांतरण) सीढ़ी से भरी हुई एक एकल जेल के अनुकूलन और तीन मिलकर दोहराता में murine पूरे मस्तिष्क homogenate के 15 माइक्रोग्राम प्रति तीन वर्गों में कटौती की गई थी. एक खंड का तबादला नहीं किया गया था, एक (निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार) 7.5 मिनट के लिए हस्तांतरित और 8.5 मिनट के लिए एक था. जेल वर्गों तो 680 चैनल में एक अवरक्त इमेजर पर स्कैन और मात्रा निर्धारित. बी) प्रत्येक जेल के अवशिष्ट प्रोटीन सामग्री में अंतर का प्रदर्शन मात्रा का ठहराव मूल्यों की चित्रमय प्रतिनिधित्व 0, 7.5, और 8.5 मिनट के बाद, त्वरित ब्लू प्रोटीन दाग के साथ दाग रहे थे स्थानांतरण की. हस्तांतरण के समय की एक अतिरिक्त मिनट लगभग 45% की अतिरिक्त प्रोटीन स्थानांतरण में हुई ध्यान दें.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
प्रोटीन की 5. एंटीबॉडी का पता लगाने
- झिल्ली तैयारी और अवरुद्ध
- मैं-धब्बा मशीन से स्थानांतरण ढेर निकालें. नीचे स्थानांतरण ढेर पर जेल उजागर शीर्ष और फिल्टर पेपर परत निकालें.
- एक स्केलपेल के साथ जेल के आसपास कट और अभिविन्यास प्रयोजनों के लिए एक त्रिकोणीय कटौती झिल्ली पर प्रतिनिधित्व किया है कि यह सुनिश्चित करें. झिल्ली trimming के बाद, प्रोटीन स्थानांतरण क्षमता की जांच और / या त्यागने के लिए जेल दाग.
- तेजी से 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर युक्त एक साफ 50 मिलीलीटर ट्यूब (या समकक्ष संदूक) में झिल्ली कदम है और लगातार आंदोलन के लिए एक यांत्रिक रोलर (या कक्षीय मंच) पर जगह है.
नोट: यह झिल्ली बाहर शुष्क करने की अनुमति नहीं है कि महत्वपूर्ण है. अर्द्ध शुष्क हस्तांतरण के दौरान झिल्ली गर्म हो जाएगा. यह मैं अनुमति देगा के रूप में स्थानांतरण ढेर खोलने से पहले 2 मिनट रुकोटी शांत और ढेर Deconstruction दौरान धीमी सुखाने समय के लिए. Washes और incubations के दौरान आंदोलन के लिए एक रोलर और ट्यूब का उपयोग करने की आवश्यकता समाधान की मात्रा में उल्लेखनीय कमी की अनुमति देता है. - 1x पीबीएस में झिल्ली 3 एक्स 5 मिनट धो लें. 1x पीबीएस त्यागें और कमरे के तापमान पर 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए undiluted अवरुद्ध बफर के साथ झिल्ली ब्लॉक.
- प्राथमिक एंटीबॉडी तैयारी.
- 0.1% Tween20 साथ अवरुद्ध बफर के 5 मिलीलीटर में निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें. लगातार आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं.
नोट: अवरुद्ध बफर आम तौर पर undiluted प्रयोग किया जाता है, लेकिन 1 तक पतला किया जा सकता है: 4 पीबीएस के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी उच्च पर्याप्त विशिष्टता है यदि. - प्राथमिक एंटीबॉडी त्यागें और 1x पीबीएस के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए झिल्ली 6 बार धो लो.
- 0.1% Tween20 साथ अवरुद्ध बफर के 5 मिलीलीटर में निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी तैयार करें. लगातार आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात तैयार प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली सेते हैं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी चयन और तैयारी
- SECO लिएndary केवल उपरोक्त कदम 5.2.1 और 5.2.2 न आना और नमूना विशिष्ट माध्यमिक बैंडिंग पैटर्न निर्धारित करने के लिए 5.3 कदम आगे बढ़ना, नियंत्रण प्रयोजनों के लिए मूल्यांकन लेबलिंग. चित्रा 3 देखें.
माध्यमिक एंटीबॉडी की चित्रा 3. अनुकूलन. ए) murine के 15 माइक्रोग्राम प्रति (एम) के खिलाफ माध्यमिक केवल गैर विशिष्ट लेबलिंग का एक बहु प्रजातियों तुलना, Ovine (ओ) और फ्लोरोसेंट की एक किस्म के साथ इक्वाइन (ई) तंत्रिका ऊतक homogenates माध्यमिक एंटीबॉडी में चिह्नित . एल आणविक भार सीढ़ी है. Ovine ऊतक homogenate गधा विरोधी बकरी 800 एंटीबॉडी. बी का उपयोग करने के लिए जब केवल नमूना यह एक अलग ऊतक नमूना का उपयोग करते समय गैर विशिष्ट लेबलिंग होती है यदि पता लगाने के लिए भी महत्वपूर्ण है) माध्यमिक लेबलिंग के साथ पार प्रतिक्रिया थी, यानी, murine gastrocnemius मांसपेशियों (15 _6; छ लोड). यह नमूना पार माउस मस्तिष्क homogenate का उपयोग करते समय हालांकि यह घटित नहीं था, गधा विरोधी माउस 680 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करते हैं.
- फ्लोरोसेंट 0.1% Tween20 साथ बफर अवरुद्ध में सांद्रता सिफारिश निर्माता निम्न माध्यमिक एंटीबॉडी 680 या 800 (लाल या हरी चैनल) में चिह्नित तैयार करें. लगातार आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए तैयार माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ अंधेरे में झिल्ली सेते हैं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी त्यागें और 1x पीबीएस के साथ धोने प्रति 5 मिनट के लिए झिल्ली 6 बार धो लो. दृश्य - 6 कदम आगे बढ़ना.
- एक उपयुक्त अतिरिक्त कदम के रूप में माध्यमिक एंटीबॉडी की एक सीमा के साथ मार्कर के दृश्य के रूप में की उम्मीद नहीं कर रहा है, तो परीक्षा सीढ़ी. नहीं सभी माध्यमिक एंटीबॉडी सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीढ़ी के सभी मार्कर बैंड के दृश्य की अनुमति.
- उम्मीद की बैंड दिखाई नहीं कर रहे हैं, यानी, Donk एक वैकल्पिक माध्यमिक मेजबान का उपयोगबकरी विरोधी खरगोश बनाम ey विरोधी खरगोश एक उपयुक्त प्रोटोकॉल संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा 4 देखें. एक माध्यमिक एंटीबॉडी बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया होस्ट प्रजातियों कभी कभी के कारण विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्टता की कमी के दृश्य के साथ एक मुद्दा हो सकता है.
हड्डी वसा, मांसपेशियों, यकृत और - - ERK प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated और तीन अलग माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ incubated चित्रा 4. समस्या निवारण माध्यमिक एंटीबॉडी विशिष्टता ऊतकों के नमूनों की एक सीमा के पश्चिमी धब्बा (लेन प्रति 15 माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन).. शीर्ष पैनल: ली भ्रष्टाचार बकरी विरोधी खरगोश के साथ 680 माध्यमिक एंटीबॉडी लेबल पश्चिम बंगाल वसा और हड्डी के कमजोर लेबलिंग का उत्पादन किया है और कोई संकेत जिगर और मांसपेशियों के नमूने में पाया गया था. मध्य पैनल: झिल्ली (शीर्ष पैनल से) छीन लिया और repr गया थामाध्यमिक जुड़े हुए ईसीएल कार्यप्रणाली और बकरी विरोधी खरगोश एचआरपी का उपयोग ओबेद. बैंड मांसपेशियों और जिगर के नमूनों में अब दिखाई दे रहे हैं और लेबलिंग वसा और हड्डी के नमूनों में अधिक तीव्र प्रकट होता है. नीचे पैनल: (शीर्ष और मध्यम पैनल से) झिल्ली छीन ली और भ्रष्टाचार गधा विरोधी खरगोश ERK प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए एक बड़ा आकर्षण दिखाया गया है जो 680 माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग reprobed गया था. मांसपेशियों और जिगर के लिए लेबल अब वसा और हड्डी दोनों नमूनों से बढ़ाकर संकेत तीव्रता के साथ दिख रहा है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
6. दृश्य
नोट: सभी छवियों लाइट-भ्रष्टाचार ओडिसी क्लासिक इमेजर और संबद्ध छवि प्रो विश्लेषण सॉफ्टवेयर (संस्करण 3.1.4) का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं.
- मुड़ें और कंप्यूटर और इमेजर पर लॉग ऑन करें. इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और एक नई फ़ाइल बनाएँ. चित्रा 5 देखें.
चित्रा 5. दृश्य और वेस्टर्न ब्लॉट की मात्रा का ठहराव. Murine gastrocnemius मांसपेशियों (30 माइक्रोग्राम प्रति लोड) दिखा एक पश्चिमी धब्बा का स्कैन Annexin वी प्राथमिक एंटीबॉडी (36 केडीए) और बकरी विरोधी खरगोश 800 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ जांच. झिल्ली स्कैन और 800 चैनल में कल्पना की गई थी. प्रोटीन (Annexin वी) यों, एक आयताकार बॉक्स यह तो नकल की है और एक ही क्षेत्र की माप सुनिश्चित करने के लिए शेष नमूना गलियों के ऊपर चिपकाया जाता है नमूना 1. से ब्याज के बैंड के चारों ओर खींचा है. पृष्ठभूमि स्वचालित रूप से तैयार की आकृति के चारों ओर के लिए जिम्मेदार है, लेकिन यह सही रूप में परिभाषित किया गया है पृष्ठभूमि माप सुनिश्चित करने के लिए बदला जा सकता है. नीचे दी गई तालिका घटाया पृष्ठभूमि के साथ कुल प्राप्त संकेत, पृष्ठभूमि और संकेत सहित खींचा प्रत्येक आकार की मात्रा निर्धारित माप प्रदर्शित करता है. यह जानकारी तो एक में निर्यात किया जा सकता हैस्प्रेडशीट प्रोग्राम (सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा निर्धारित) अभिव्यक्ति अनुपात की गणना और बाद में सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने की अनुमति देता है. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
- इमेजर के ढक्कन खोलें. नीचे बाएँ हाथ के कोने पर कांच पर 1x पीबीएस की एक छोटी राशि डालो और फिर पीबीएस के शीर्ष पर झिल्ली जगह है. झिल्ली झिल्ली और ग्रिड अक्ष के बीच रह गया है इमेजर पर धुरी और एक 1 सेमी अंतराल के साथ वर्ग है सुनिश्चित करें.
- कोई बुलबुले कांच और झिल्ली के बीच फंस रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली रोल.
- झिल्ली एक्स और वाई अक्ष पर रह रहे वर्गों की संख्या की गणना. इमेजर का ढक्कन बंद कर दें. झिल्ली कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर रह रहे वर्गों की संख्या दर्ज करें.
- फ्लोरोसेंट टैग पर निर्भर करेगा जो झिल्ली स्कैन करने के लिए उपयुक्त चैनल का चयन करेंमाध्यमिक एंटीबॉडी, यानी, 700 चैनल या एक 680 या 800 फ्लोरोसेंट टैग एंटीबॉडी क्रमशः इस्तेमाल किया गया है, जब 800 चैनल. दोहरी लेबलिंग बाहर किया जाता है, तो दोनों चैनलों में स्कैन.
नोट: पहले दोहरे लेबलिंग से बाहर ले जाने के लिए एक प्रोटीन लेबलिंग का अनुकूलन. - एक उच्च बहुतायत प्रोटीन एक कम तीव्रता स्कैन का उपयोग करते हैं, झिल्ली को स्कैन करने की तीव्रता का चयन करें. प्राथमिक एंटीबॉडी ब्याज की प्रोटीन एक उच्च तीव्रता स्कैन चयन के लिए गरीब संबंध है वैकल्पिक रूप से अगर, यानी, स्तर 5. प्रेस स्कैन शुरू करने के लिए शुरू करते हैं. 6.4 कदम आगे बढ़ना.
- लोड हो रहा है नियंत्रण जेल के दृश्य (चित्रा 6).
पैनल से 6 चित्रा कुल प्रोटीन लेबलिंग और विश्लेषण. ए) लेन. बी प्रति घोड़ा सरवाइकल ganglia homogenate के 20 माइक्रोग्राम प्रति युक्त कुल प्रोटीन लेबल जेल की तस्वीर) जेलकुल प्रोटीन दाग जेल से मात्रा निर्धारित माप के 680 चैनल. सी) ग्राफ में स्कैन इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्राप्त की. आणविक वजन मार्करों द्वारा निर्धारित माप की एक सीमा है, यानी, 30-110 केडीए, मानक त्रुटि सुनिश्चित करने के लिए माप की एक हिस्टोग्राम प्रदान करने के लिए लिया जाता है (SEM) के प्रत्येक नमूने में कुल प्रोटीन का स्तर एक समान हैं यह दर्शाता है कि (समूहबद्ध नमूनों की) कम है जेल में. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.- पालन 6.1 और 6.2 दोहराएँ.
- ग्रिड अक्ष शुरू होता है जहां इमेजर के नीचे कोने में कांच पर आसुत पानी डालो.
- पानी के शीर्ष पर जेल प्लेस और इसलिए गलियों एक्स या ग्रिड के वाई अक्ष या तो सीधा कर रहे हैं पैंतरेबाज़ी. ग्रिड के वाई और एक्स अक्ष और जेल के बीच एक 1 सेमी अंतराल छोड़ दो और जेल ग्रिड अक्ष पर रह रहे वर्गों की संख्या गिनती. पासइमेजर का ढक्कन.
- जेल कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर रह रहे वर्गों की संख्या दर्ज करें.
- कुल प्रोटीन दाग जेल स्कैन करने के लिए 700 चैनल का चयन करें.
नोट: ब्लू 700 चैनल में fluoresces. - 5 और प्रेस शुरू करने के लिए तीव्रता सेट करें.
- स्कैन छवि की मात्रा
- सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता का उत्पादन करने के लिए चमक और विपरीत बटन समायोजित करें. उच्च पृष्ठभूमि शोर प्रतीत होता है, तो एक कम तीव्रता पर झिल्ली जाँच और उच्च गुणवत्ता स्कैन सेटिंग का उपयोग करें.
नोट: किसी भी समायोजन स्कैनिंग जब अधिग्रहीत फ्लोरोसेंट डेटा में परिवर्तन नहीं होगा. - अधिग्रहीत डेटा के लिए कोई परिवर्तन के साथ वांछित अभिविन्यास में देखने के क्रम में छवियों 90 डिग्री, 180 डिग्री और 270 डिग्री घुमाएँ. अधिक से अधिक 3 डिग्री से "मुक्त रोटेशन" में उन्मुखीकरण के छोटे समायोजन, बनाने हालांकि, जब pixilation मूल्यों में अधिग्रहीत डेटा विकृत हो सकता है और इस प्रकार मात्रा का ठहराव परिणामों को प्रभावित.
- आकार मेनू से एक आकार का चयन करें - ज्यादातर मामलों में एक आयत का उपयोग करें - और ब्याज की बैंड (पश्चिम बंगाल) या नमूना लेन 1 में पूरे लेन (कुल प्रोटीन जेल) के चारों ओर खींचना.
- कॉपी और ब्याज या पूरे लेन का नमूना लेन 2 बैंड भर में आकार चिपकाएं. हर नमूना के लिए ब्याज की प्रत्येक व्यक्ति बैंड और कुल प्रोटीन जैल के लिए प्रत्येक लेन भर दोहराएँ.
- पृष्ठभूमि माप अगले लेन में एक संकेत को शामिल नहीं करता है कि जाँच करें. पृष्ठभूमि स्वतः सॉफ्टवेयर द्वारा काट लिया और खींचा आकार के चारों ओर पूरे किनारे धरना या इसे नीचे / ऊपर या छोड़ दिया और आकार के सही होने के लिए निर्दिष्ट किया जा सकता है किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, एक उपयोगकर्ता परिभाषित पृष्ठभूमि बॉक्स नामित.
- मनमाना फ्लोरोसेंट इकाइयों में तैयार की प्रत्येक आकार के लिए आकार मेज के लिए संकेत प्रदर्शित करें. पृष्ठभूमि स्वतः संकेत से काट लिया जाएगा.
- विभिन्न सॉफ्टवेयर में देखने के लिए एक TIF फ़ाइल के रूप में छवि निर्यात. छवि निर्यात और उसी में हेरफेर न करेंइस रूप में एनजी गैर छवि प्रो सॉफ्टवेयर झूठी डेटा पैदा इमेजर द्वारा अधिग्रहीत मूल डेटा बदल जाएगा.
- चरणों को दोहराएँ 6.4.3-6.4.7 दोहरी लेबलिंग बढ़ाता या पैदा करते हैं और मानक त्रुटि डेटा मुक़ाबला करने के लिए लोडिंग नियंत्रण जैल पर कई मापन बाहर ले जाने के लिए जब.
- सबसे अच्छी छवि गुणवत्ता का उत्पादन करने के लिए चमक और विपरीत बटन समायोजित करें. उच्च पृष्ठभूमि शोर प्रतीत होता है, तो एक कम तीव्रता पर झिल्ली जाँच और उच्च गुणवत्ता स्कैन सेटिंग का उपयोग करें.
7. पोस्ट विज़ुअलाइज़ेशन
- 1x पीबीएस में झिल्ली रखें या भविष्य फिर से जांच कर रही है और ब्याज की अन्य प्रोटीन के लिए झिल्ली के अलग करना के लिए लंबी अवधि के भंडारण के लिए बाहर सूखी.
- स्ट्रिपिंग और झिल्ली की फिर से जांच कर रही. 7 चित्रा देखें.
चित्रा 7. झिल्ली अलग करना और reprobing. एक अवरक्त इमेजिंग प्रणाली. एक साथ स्कैन विभिन्न अलग करना चरणों का पालन झिल्ली के प्रतिनिधि उदाहरण हैं. पहले immunodetection सीएसपी प्राथमिक एंटीबॉडी (खरगोश) के साथ किए गए और 7 पर स्कैन किया गया00 चैनल. बी. सबसे पहले अलग करना और 800 चैनल के साथ ROCK2 (खरगोश) के साथ reprobing. ऑरेंज तीर पट्टी और फिर से जांच के बाद वर्तमान सीएसपी प्राथमिक एंटीबॉडी शेष इंगित करता है. बैंड एक उच्च आणविक वजन (सफेद तीर). सेल्सियस पर मौजूद है के रूप में इस ROCK2 की माप को प्रभावित नहीं करता. दूसरा अलग करना और 800 चैनल. डी में β-Spectrin एंटीबॉडी (बकरी) के साथ reprobed और कल्पना. तीसरी अलग करना और α-synuclein एंटीबॉडी (खरगोश). ई के साथ reprobing. चौथा अलग करना और 800 चैनल के साथ ubiquitin एंटीबॉडी (माउस) के साथ reprobing. पिछले एंटीबॉडी से शेष संकेत अभी भी वहाँ है (α-synuclein. ऑरेंज तीर). एफ. पांचवें अलग करना और 700 चैनल में imaged CALB2 एंटीबॉडी (खरगोश) के साथ reprobing. इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी थे: बकरी विरोधी माउस 800cw, बकरी विरोधी खरगोश 680rd, बकरी विरोधी खरगोश 800cw, गधा विरोधी बकरी 800cw (माल की सूची देखें). लेन लेबल: एल - सीढ़ी, 1/260 - नमूना 1/2. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.- Revitablot अलग करना बफर के लगभग 30 मिलीलीटर होते हैं और लगातार आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5-20 मिनट के बीच incubated हैं कि एक वर्ग पेट्री डिश में रखें झिल्ली (एस).
- उत्पन्न हुई झिल्ली (ओं) पीबीएस में 3 बार तो प्रतिदीप्ति का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित करने के लिए इमेजर पर जाँच धो - यह कदम हर पट्टी के बाद दोहराया जाना चाहिए.
- प्रतिदीप्ति रहता है अगर लंबी अवधि के लिए झिल्ली (ओं) को सेते हैं. शेष कोई माध्यमिक संकेत है कि पुष्टि करने के लिए प्रत्येक पट्टी के बाद झिल्ली फिर स्कैन करें.
नोट: झिल्ली (ओं) ही छीन लिया और झिल्ली की अखंडता अनुपात संकेत करने के लिए अवांछनीय उच्च पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप से समझौता नहीं किया गया है कि गारंटी के लिए 3 बार की अधिकतम reprobed किया जाना चाहिए.
Representative Results
QFWB संवेदनशीलता और पहचान के रैखिक सीमा पारंपरिक ईसीएल पता लगाने की तुलना में अधिक है, जिससे प्रभावी व्याख्या सहायता सटीक डाटा एकत्र किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं कि नियंत्रण उपायों के एक नंबर रहे हैं. सबसे पहले, सकारात्मक नियंत्रण नमूने के शामिल किए जाने के चित्र 1 में दिखाया गया है. दूसरे, स्थानांतरण का अनुकूलन झिल्ली को जेल से उच्च और कम आणविक भार प्रोटीन के समकक्ष आंदोलन की गारंटी करने के लिए चित्रा 2 में प्रदर्शन के रूप में. तीसरा, एंटीबॉडी के अनुकूलन, विशेष रूप से माध्यमिक जिसका अनुकूलन अक्सर अनदेखी की है, लेकिन जो एंटीबॉडी ब्याज की प्रोटीन (ओं) की सही व्याख्या के साथ हस्तक्षेप करने में सक्षम बैंडिंग गैर विशिष्ट उत्पादन कर सकते हैं. चित्रा 3 देखें. चौथे, यह भी हो सकता है मामला एक प्रोटीन से undetectable दिखाई देता है लेकिन वर्तमान होने की उम्मीद है जब, यह भी बस एक माध्यमिक रईस का उपयोग करके सुधारा जा सकता है जो एक माध्यमिक एंटीबॉडी मुद्दा हो सकता है किएक अलग प्रजाति की मेजबानी में एड. चित्रा 4 देखें. पांचवें क्रम में, कुल प्रोटीन लेबलिंग और विश्लेषण सर्वत्र आंतरिक संदर्भ मानकों 3 के लिए व्यक्त कर रहे हैं कि पारंपरिक एकल प्रोटीन (एस) के उपयोग की तुलना में कहीं अधिक मजबूत और quantifiable विधि है. इन एकल प्रोटीन से कई विभिन्न neurodegenerative रोगों के मॉडल के रूप में अच्छी तरह से बीच विभिन्न ऊतकों के नमूनों में व्यक्त किया जा पाया गया है और अभिव्यक्ति की एकरूपता ही ऊतक 3 के भीतर बदल सकते हैं. मानक त्रुटि इंगित करने के लिए की तुलना करने और प्रत्येक नमूने के खिलाफ मापा विभिन्न आणविक भार श्रेणियों में प्रत्येक लेन में प्रोटीन लोड बढ़ाता द्वारा कुल प्रोटीन विश्लेषण के साथ संयुक्त जब चित्रा 6 में प्रदर्शन के रूप में इसलिए, एक लोडिंग नियंत्रण जेल का उत्पादन नमूना लोड की एकरूपता की पुष्टि करेगा . महत्वपूर्ण बात, इन समस्या निवारण तकनीकों और नियंत्रण के सभी केवल विश्लेषण टी की संवेदनशीलता और स्थिरता के रूप में प्रभावी हैंऑपरेटर (चित्रा 5) द्वारा लागू ools. अंत में इस तकनीक को अलग करना और कारण कारकों सहित, लेकिन लंबे समय तक भंडारण की स्थिति के तहत वृद्धि की संवेदनशीलता, कम पृष्ठभूमि, दोहरी रंग का पता लगाने और झिल्ली स्थिरता के लिए सीमित नहीं करने के लिए ईसीएल से अधिक लचीलेपन के साथ झिल्ली की फिर से जांच कर रही करने के लिए उधार देता है. 7 चित्रा देखें.
Discussion
कारण पर विचार और योजना किसी भी प्रयोग करने से पहले आवश्यक है और अंत में इस्तेमाल तकनीक की सफलता का निर्धारण कर सकते हैं. उपयुक्त एंटीबॉडी, स्थानांतरण और दृश्य तरीकों का उपयोग करने के लिए चयन करने के लिए कोशिश कर रहा है जब संभावित ब्लॉकों के ढेर सारे पेश कर सकते हैं पश्चिम बंगाल का उपयोग प्रोटीन का पता लगाने में प्रगति. सौभाग्य से, प्रोटीन उपस्थिति और नमूने के बीच तेजी से सूक्ष्म अभिव्यक्ति मतभेद निर्धारित करने के लिए नियमित तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता QFWB एक सावधान चेकलिस्ट और उचित नियंत्रण के उपायों का उपयोग. इस प्रोटोकॉल से बचने और / या इसके साथ जुड़े कई आम नुकसान की कुछ काबू पाने के लिए फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पश्चिमी सोख्ता के साथ-साथ कुछ समस्या निवारण रणनीतियों के लिए एक व्यापक मार्गदर्शन प्रदान करता है.
संवेदनशीलता को बनाए रखने और प्राप्त करने के लिए कार्यरत महत्वपूर्ण कदम सही मायने में व्यावहारिक और तुलनीय माप शामिल हैं: ऊतक के नमूने से 1) मजबूत प्रोटीन निकासी; 2) नमूना तैयार करने; 3) सही प्रोटीन loadinजी कुल प्रोटीन विश्लेषण द्वारा निर्धारित; मैं-ब्लाट का उपयोग प्रोटीन की 4) इष्टतम हस्तांतरण; एक अवरक्त इमेजर और संबद्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 0.1% Tween20 युक्त बफर अवरुद्ध में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के 5) तैयार करने, और 6) सही दृश्य और विश्लेषण.
इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट का पता लगाने के लिए वास्तव में मात्रात्मक और अधिक परंपरागत ईसीएल पता लगाने की तकनीक 3,11 के साथ तुलना में अधिक संवेदनशीलता प्रदान करता है. यह पता लगाने की प्रणाली बहुपक्षीय बहु है, और इस तरह के रूप QFWB तक सीमित नहीं है. यह प्रणाली पूरे ऊतक वर्गों 12 के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति कम बिजली पर immunohistological लेबलिंग की इमेजिंग में सक्षम है. इस मात्रात्मक आकलन के संदर्भ में पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी साथ पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस कब्जा rivaling दूर लाल इमेजिंग देख सकता था जो संकल्प के मामले में संभावित भविष्य के विकास का एक क्षेत्र है.
हालांकि, पी में सूक्ष्म परिवर्तन करने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथएक न्यूनतम और नियंत्रण उपायों के लिए रखा जाता है अभिव्यक्ति यह परिवर्तनशीलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है rotein मजबूत प्रोटोकॉल के साथ कड़े हैं. यह नमूना लोड हो रहा वर्दी, पता लगाने के असली और संबंध में निर्माता के दिशा निर्देशों का परीक्षण स्थानांतरित करने के लिए है, तो यह निर्धारित करने के क्रम में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुकूलन है कि आश्वासन प्रदान करने के लिए कुल प्रोटीन दाग जैल का उत्पादन द्वारा पीछा ऊतक के नमूने से कठोर प्रोटीन निष्कर्षण के साथ शुरू होता है टाइम्स कुशल प्रोटीन हस्तांतरण प्राप्त करने के लिए.
फिर भी, पश्चिम बंगाल के लिए शर्तें अनुकूलित कर रहे हैं, तब भी जब अभी भी समस्या को पूरी तरह से यहाँ का पता लगाया गया है नहीं हो सकता है कि वेस्टर्न चलाने के साथ वहाँ जुड़े हो सकते हैं. ये शामिल हैं, लेकिन प्रोटीन solubilization और निकासी बफर के विकल्प सहित कारकों तक सीमित नहीं हैं. कुछ बफ़र्स प्रोटीन एकाग्रता assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, और कुछ ऊतकों ऐसे स्वचालित macera के उपयोग के रूप में और अधिक मजबूत तकनीक की आवश्यकता होती है, solubilize के लिए विशेष रूप से कठिन हैंting के इस तरह के एक एमएसीएस dissociator के साथ एम ट्यूबों के रूप में कंटेनर सील. इसके अलावा, -80 डिग्री सेल्सियस पर निकाले और गैर निकाली गई सामग्री के भंडारण के लिए सरल नियंत्रण उपायों के तुरंत निकासी के बाद इष्टतम लेबलिंग प्राप्त करने और गरीब परिणाम हफ्ते बाद होने के बीच का अंतर हो सकता है.
आधुनिक QFWB तरीकों प्रोटीन अभिव्यक्ति में सूक्ष्म अंतर पर कब्जा करने के लिए और अधिक संवेदनशील साबित हो रहे हैं और इस तरह के ईसीएल के रूप में पुरानी तकनीक की तुलना में जब अधिक बहुमुखी एक साथ दोहरी लेबलिंग 3 अनुमति दे रहे हैं. यह पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल मजबूत और सही मात्रा का ठहराव और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए आसानी से repeatable रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल विभिन्न ऊतकों के नमूनों और प्रजातियों 3 की एक किस्म में प्रोटीन का पता लगाने के लिए नियमित तौर पर इस्तेमाल किया जा संवेदनशील और काफी मजबूत है और इसलिए प्रयोग 1 प्रति उपभोज्य के उपयोग के साथ-साथ समय को कम करने के लिए एक ही QFWB भीतर कम और उच्च बहुतायत प्रोटीन की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. 9,14 हालांकि सटीकता जिससे गलत डाटा अधिग्रहण से परहेज का पालन किया जाना चाहिए महत्वपूर्ण और उचित नियंत्रण के उपायों का समावेश है omic पढ़ाई - 1 इसके अलावा, इस तकनीक की वृद्धि की संवेदनशीलता में तेजी से लोकप्रिय के सत्यापन की अनुमति देता है.
Acknowledgments
हम धन्यवाद करने के लिए वित्तीय सहायता के लिए निम्नलिखित चाहेंगे: बीबीएसआरसी संस्थान सामरिक कार्यक्रम अनुदान - सीएफ व TMW; बीबीएसआरसी पूर्व बायो डीटीपी वित्त पोषण - एलजी; एडिनबर्ग डार्विन ट्रस्ट - MLH. हम भी इस पांडुलिपि में TREM2 अनुकूलन शामिल करने की अनुमति के लिए डॉ बैरी McColl धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
| M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life Technologies, UK | IB401001 | |
| MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life Technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
| SeeBlue Pre-stained protein standard | Life Technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
| NuPAge LDS Sample buffer 4x | Life Technologies, UK | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x) | Life Technologies, UK | NP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life Technologies, UK | NP0322BOX | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
| Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
| Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
| ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
| iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
| InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
| Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
- Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G.
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
- Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
- Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
- Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95 (2013).
- Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
- Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
- Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).
