Abstract
På slutten av 1970-tallet kom de første offentlig rapportert bruk av western blot, en teknikk for å vurdere tilstedeværelse og relative overflod av spesifikke proteiner i komplekse biologiske prøver. Siden da, har western blotting metodikk blitt en vanlig komponent i molekylærbiologer eksperimentelle repertoar. En overfladisk søk i PubMed å bruke begrepet "western blot" antyder at i overkant av 220 000 publiserte manuskripter har gjort bruk av denne teknikken innen år 2014. Viktigere, har de siste ti årene sett teknisk bildebehandling fremskritt kombinert med utviklingen av sensitive fluorescerende etiketter som har forbedret sensitivitet og overgitt enda større områder av lineær gjenkjenning. Resultatet er en nå virkelig kvantifiserbar fluorescens basert Western Blot (QFWB) som tillater komparativ uttrykk analyse biologer å gjennomføre med større følsomhet og nøyaktighet enn noen gang før. Mange "optimalisert" western blottingmetoder finnes og benyttes i forskjellige laboratorier. Disse viser seg ofte vanskelig å gjennomføre på grunn av kravet om subtile, men udokumenterte prosessuelle endringer. Denne protokollen gir en omfattende beskrivelse av en etablert og robust QFWB metoden, komplett med feilsøkingsstrategier.
Introduction
Western-blotting (WB) er en analytisk teknikk som opprinnelig ble utviklet på slutten av 1970-årene for å bestemme nærvær eller fravær av et protein av interesse i et komplekst biologisk prøve, slik som en vev homogenat 1. Ofte referert til som protein immunoblot, på grunn av nøkkelen antistoff-antigen-interaksjon, består metodikken av 5 adskilte trinn: 1) elektroforetisk separering av proteinene ved deres isoelektriske punkt; 2) overføring til en nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran; 3) merking ved bruk av et primært antistoff som er spesifikt til proteinet av interesse; 4) inkubasjon med et sekundært antistoff rettet mot det primære antistoff; og 5) visualisering.
Visualisering metodikken har utviklet seg med tiden til å forbedre sikkerheten og følsomhet. Noen av de første BAC ble utført ved hjelp av radiomerkede koder som deretter utviklet seg til kolo og deretter de mer utbredt chemilluminescent (ECL) metoder. Radioaktivitetenty ble direkte merket på prober for spesifikke antigener, mens kolorimetriske metoder og ECL bruke en indirekte teknikk for merking med et enzym reporter for eksempel alkalisk fosfatase eller streptavidin-pepperrot peroksydase (HRP) 2. Intensiteten av merking av chromagen eller luminescent produkt blir målt ved hjelp av densitometri hvorved signalstyrken, sterk eller svak, mer eller mindre indikerer nærværet av proteinet av interesse i prøven. ECL er mer følsom og derfor foretrekkes metodikk 2, men alle tre metoder ble opprinnelig utviklet på røntgenfilm med mer sofistikerte digital avbildningsteknikker deretter etablert tre. Fremme av digital avbildning av WB ikke bare tillot en forsker for å bestemme nærvær eller fravær av deres protein av interesse, men også tillatt en slutning til nivået av ekspresjon av et valgt protein når sammenlignet mot andre prøver, og kan derfor bli henvist til som "semi-kvantitativ & #8221 ;. Nylig har en virkelig kvantitativt og mer følsom western-blotting-teknologi blitt utviklet hvorved nivået av fluorescens målt er direkte relatert til mengden og ekspresjon av et enkelt protein i en prøve: kvantitativt fluorescerende western blotting (QFWB).
Når man sammenligner QFWB med ECL merking, bruk av et fluorescerende sekundært antistoff genererer en lineær deteksjon profil 4. Dette er i motsetning til ECL teknikker hvor signallineæriteten vanligvis oppstår med lave protein belastninger under 5 mikrogram og signal metning direkte relatert til protein uttrykk, dvs. med overalt uttrykt husholdningsgener 5,6. Dette misforhold er sannsynligvis forårsaket av et større antall bindingsseter tilgjengelig for en avidin ECL substrat for å binde seg til et biotinylert sekundært, noe som resulterer i en høyere sannsynlighet av potensiell signal metning. Dette er en av de viktigste årsakene til ECL basen immunoblotting blir referert til som only "semi-kvantitativ" 7. Metningspunktet for signalet er av avgjørende betydning når man måler små forskjeller i uttrykk nivåer og kan føre til unøyaktige målinger. I de senere årene framveksten av utbredte proteomikk teknikker detaljering stadig økende følsomhet og identifisering av subtile uttrykk differensialer har resultert i en stadig økende avhengighet av virkelig kvantitativ western blotting for valideringsforsøk 8,9. Anvendelsen av sensitive, robust og virkelig kvantitativ metodikk er derfor avgjørende.
Mange "optimalisert" vestlige blotting metoder har blitt benyttet av uavhengige laboratorier, som ofte viser seg vanskelig å sette opp eller replikere grunnet subtile metodiske justeringer som kanskje ikke er synlig i formelle dokumenterte protokoller. Dette er et etablert og robust protokoll for QFWB og i tillegg gir verdifulle strategier for feilsøking vanlige problemer that kan oppstå under gjennomføringen.
Denne protokollen ble opprinnelig optimalisert for bruk med mus hjerne homogenates, men har siden blitt brukt effektivt på tvers av et bredt spekter av vevsprøver og arter 4,9,10. Potensielle protokoll variasjoner som kreves for bestemte feilsøkingsproblemer er inkludert.
Protocol
Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av kommersielt produsert buffere, geleer og overføre stabler for å redusere variasjon og bedre konsistens. Referere til Materialer List for en komplett liste over rekvisita som kreves.
Fluorescerende WB protokollen ved hjelp av I-Blot rask overføring og LI-COR Odyssey bildesystem
1. Fremstilling av prøve
- Buffer utvalg / preparatet
- Velg et passende utvinning buffer for prøve homogenisering og sørge for at bufferen er kompatibel med alle nedstrøms teknikker for å være ansatt. Tilbered en ekstraksjon buffer: RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS) som inneholdt 5% protease inhibitor cocktail før prøve isolasjon.
MERK: Det finnes mange forskjellige typer uttreknings buffere tilgjengelige og er valgt avhengig av plasseringen av proteinet av interesse i cellen. Disse inkluderer, men er ikkebegrenset til RIPA-buffer (hel celle, mitokondriell og nukleære komponenter), NP-40 lyseringsbuffer (helcelle eller membranbundet) og Tris-Triton (cytoplasmisk skjelett bundet). Imidlertid kan noen kjemiske detergenter innenfor ekstraksjon buffere hjelpe til å solubilisere eller deaktivere et protein, men kan interferere med proteinbestemmelse ved bruk av en spesifikk proteinbestemmelse assay, dvs. Bicinchoninic syre (BCA) assay. Sjekk produsentens retningslinjer for kjemisk kompatibilitet med analysen.
- Velg et passende utvinning buffer for prøve homogenisering og sørge for at bufferen er kompatibel med alle nedstrøms teknikker for å være ansatt. Tilbered en ekstraksjon buffer: RIPA-buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS) som inneholdt 5% protease inhibitor cocktail før prøve isolasjon.
- Protein utvinning / solubilisering
- Manuelt klo- vevsprøve ved hjelp av sakser og / eller skalpell etterfulgt av homogenisering ved bruk av enten en Dounce eller en håndholdt elektrisk homogenisator med en polypropylen spiss i den fremstilte utvinning buffer ved omtrent 1:10 w / v (vekt vev / buffervolum) inntil en glatt / konsistent homogenatet blir produsert.
MERK: For mindre, dyre / vanskelig å få tak i prøvene, vaskemiddel basert extractions can fremdeles være effektivt ned til 1: 5. - Poste homogenisering, sentrifugere prøven på 20.000 xg i 20 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten inneholdende de oppløseliggjorte proteiner og oppbevar ved -80 ° C inntil behov. Behold uløselige pellets å tillate ytterligere strengere ekstraksjon ved behov senere. Fortsett til protein besluttsomhet trinn 1.3.
- Manuelt klo- vevsprøve ved hjelp av sakser og / eller skalpell etterfulgt av homogenisering ved bruk av enten en Dounce eller en håndholdt elektrisk homogenisator med en polypropylen spiss i den fremstilte utvinning buffer ved omtrent 1:10 w / v (vekt vev / buffervolum) inntil en glatt / konsistent homogenatet blir produsert.
- Protein besluttsomhet
- Bestemme konsentrasjonen av proteinet i hver prøve ekstrahert ved hjelp av enten en BCA, Bradford assay eller lignende. Ved beregning av standardkurven, sørge for at koeffisienten forholdet, R-kvadratverdien er større enn eller lik til 0,99, som gjenspeiler den mest nøyaktige bestemmelse av protein overflod i løpet av de 15 prøvene.
NOTE: Alle prøver blir sammenlignet ved QFWB må analyseres mot den samme standardkurve.
- Bestemme konsentrasjonen av proteinet i hver prøve ekstrahert ved hjelp av enten en BCA, Bradford assay eller lignende. Ved beregning av standardkurven, sørge for at koeffisienten forholdet, R-kvadratverdien er større enn eller lik til 0,99, som gjenspeiler den mest nøyaktige bestemmelse av protein overflod i løpet av de 15 prøvene.
- Fremstilling av prøve
- Planlegge og registrere lasteorden stiger og prøver for to identiske gels: gel en for overføring og gel 2 som en laste kontroll. Lastes kontrollen og "behandlet" prøver sekvensielt for å unngå eventuelle skjevheter som kan oppstå med dårlig eller utvetydig overføring.
- Beregn proteinmengden som kreves for hver prøve. En standard protein belastning å påvise proteiner i nerve isolater er 15 mikrogram. Gjør hver prøve opp til en 10 pl volum med dH 2 O. Tilsett 5 ul av ladningsbuffer, Vortex og oppvarm til 98 ° C i 2 min.
- Omfatte en positiv kontrollprøve for eksempel et rekombinant protein for å hjelpe til med identifikasjon av den riktige båndet av interesse. Men forberede positiv kontrollprøve på riktig måte i henhold til produsentens retningslinjer for å unngå valg av feil band. Se figur 1.
Figur 1. Positive utvalg kontroll. Tilsetning av positive kontroller til et eksperiment bekrefter oppdaget merking er reell. Imidlertid må man vise forsiktighet for å sikre at kontrollen fungerer som det skal før du bruker eksperimentelle prøver. A) Fusion protein TREM 2 ble lastet på produsentens retningslinjer av 1 mikrogram / ml, men merking observert ved 110 kDa konflikter med dataarket spådd molekylær vekt på 60-70 kDa B.) Etter tilsetning og inkubering med reduksjonsmidlet, ble fusjonsproteinet merking detektert ved den forutsagte molekylvekt. Imidlertid medførte dette en større protein belastning som var nødvendig for reduksjonsprosessen redusert signalet av proteinet.
2. Elektro Separering av Proteiner
- Utarbeidelse av 4-12% Bis / tris gel (1,0 mm)
MERK: Gradient geler blir brukt til å produsere større proteinseparasjon over et bredt molekylvektsområde.- Velg og forberede MESMOPS, eller rennende buffer (1 L per tank) ved fortynning med dH 2 O. MES-buffer gir bedre oppløsningen av proteiner innen 3,5 til 160 kDa, mens Mopper rennende buffer er foretrukket å detektere høyere molekylvekt 200 kDa proteiner ovenfor vil imidlertid ha dårligere oppløsning av proteinene med lavere molekylvekt under 15 kDa.
- Fjern kammen og stripe av tape som dekker foten av gelen. Forsiktig vaske brønnene med buffer ved hjelp av en 1 ml pipette. Fylle brønnene med rennende buffer og sikre at ingen bobler forblir i gelen.
- Gel forberedelse og lasting
- Sett inn gels i tanken og fylle inter gel rommet med rennende buffer for å sikre at alle selene fungerer effektivt.
- Tilsett 3 ul av standard molekylvekt inn i den første brønnen i en gel og gelen 2. Laste 10 ul av hver prøve til etterfølgende brønner.
MERK: Med unntak av stiger, må gel 1 & gel 2 være identiske. Det er viktig thved pre-farget molekylvektstandard anvendes for gel blå og 2 er synlig ved bruk av en total proteinflekk for å være synlig i kanalen 700 av Odyssey imager. - Når begge geler er lastet, fylle tanken med den gjenværende rennende buffer og sikre lokket.
- Elektroforese
- "Run" av gelen ved 80 V i 4 minutter for å sikre at prøven kommer inn i polyakrylamid-gel-matriksen på en ensartet måte. Deretter øke spenningen og tid til 180 V i 50 min henholdsvis, eller inntil prøve fargestoff kan sees ved foten av gelen.
MERK: Høyere spenninger kan brukes for å oppnå kortere kjøretider. Dette kan imidlertid føre til "smiley" gels der de midterste prøver av gels kjører raskere enn de ytre prøver kjørefelt forårsaket av en økning i temperaturen 14.
- "Run" av gelen ved 80 V i 4 minutter for å sikre at prøven kommer inn i polyakrylamid-gel-matriksen på en ensartet måte. Deretter øke spenningen og tid til 180 V i 50 min henholdsvis, eller inntil prøve fargestoff kan sees ved foten av gelen.
3. Totalt Protein Stain av Loading Kontroll Gel
- Slipp gel 2 fra kassetten meden gel kniv. Fjern brønnene og foten av gelen. Marker gel for å hjelpe orientering.
- Dekanter omtrent 30 ml av proteinflekk inn i et firkantet petriskål (omtrentlig størrelse 12 x 12 cm). Plassere gelen 2 inn i proteinet flekken, og sikrer løsningen dekker hele gelen, og deretter omrøre gelen i 1 time minimum ved romtemperatur for å gi flekker.
- Dekanter proteinflekk og vask gelen 3x i destillert vann før visualisering. Gå videre til trinn 6.3 til å visualisere.
4. I-Blot Semi Dry Fast Protein Transfer
MERK: Alle reagenser som kreves for proteinoverføring ved hjelp av I-Blot maskin er kommersielle produkter spesielt utviklet for I-Blot metodikk og kan finnes i materiallisten.
- Klargjør "bunnen" transfer stabelen. Fjern foliedeksel og pre-våt med rennende buffer direkte fra gelen tanken. Pre-vått filterpapir med destillert vann.
- Gjenta trinn 3.1 og sted gel 1 påden klargjorte "bunnen" transfer stabelen.
- Legg den pre-vått filterpapir over gel. Rulle filterpapir og gel for å sikre at ingen bobler blir innesperret mellom lagene.
- Fjern folien lokket fra toppen transfer bunken og legg den øverste bunken på toppen av filterpapiret og bunnen stabelen. Rull transfer stack "sandwich" for å eliminere eventuelle luftbobler.
- Sett svampen fra overførings stabelen settet på lokket av I-Blot maskin. Plasser transfer stack-sandwich på dedikert plass på I-Blot maskin så tett lokk sikkert. Start I-Blot og overføre 8,5 min på program 3.
- Hvis det er en lav protein-signal eller ujevne høy: lav molekylvekt protein prosenter, teste produsentens transfertiden når du bruker en semi tørr "fast" overføringsmetode. Kjøre en enkel protokoll optimalisering ved hjelp av eksempel gjentakelser av identisk belastning for å bestemme den ideelle overførings spenning / tid-kombinasjonen som sett i figur 2 .
Figur 2. Optimalisering av overføringen ved hjelp av I-Blot. A) En enkelt gel lastet med stigen og 15 ug av muse-hel hjerne-homogenat i tre tandem repetisjoner ble kuttet opp i tre seksjoner. En del ble ikke overført, ble man overført 7,5 min (som per produsentens retningslinjer) og en for 8,5 min. De gel-seksjoner ble deretter farget med Instant blå flekk protein, skannes på en infrarød bildefanger i kanalen 680 og kvantifisert. B) grafisk fremstilling av kvantifisering av verdier som demonstrerer forskjellen i restproteininnholdet i hver gel etter 0, 7,5, og 8,5 min for overføring. Legg merke til at en ytterligere minutt av overføringstiden resulterte i ytterligere protein overføring av omtrent 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5. Antistoff Påvisning av proteiner
- Membranpreparat og blokkering
- Fjern overførings stabelen fra I-Blot maskin. Fjern det øverste og filterpapirlaget eksponere gelen på den nederste overførings stabelen.
- Skjær rundt gelen med en skalpell og sikre at en trekantet kutt for orienteringsformål er representert på membranen. Etter membran trimming, protein flekker på gel for å sjekke overføringseffektivitet og / eller forkaste.
- Før det membran i en ren 50 ml tube (eller tilsvarende beholder) som inneholder 5 ml 1x PBS og plassere på en mekanisk roller (eller orbital plattform) for konstant omrøring.
NB: Det er viktig at membranen ikke er lov til å tørke ut. Under halvtørr transfer membranen blir varme. Vent to minutter før du åpner transfer stabelen da dette vil gi it å kjøle og treg tørketid under stakken dekonstruksjon. Bruk av en valse og rør for agitering under vaskinger og inkubasjoner tillater betydelig reduksjon i volum av oppløsninger som kreves. - Vask membranen 3 x 5 min i 1x PBS. Kast 1 x PBS og blokkere membranen med ufortynnet blokkeringsbuffer i minst 30 minutter ved romtemperatur.
- Primært antistoff forberedelse.
- Forbered det primære antistoff i henhold til produsentens retningslinjer i 5 ml blokkering buffer med 0,1% Tween 20. Inkuber membran med den fremstilte primære antistoff over natten ved 4 ° C med konstant omrøring.
MERK: Blokkering buffer er vanligvis brukes ufortynnet, men kan fortynnes opp til 1: 4 med PBS hvis det primære antistoff har høy spesifisitet tilstrekkelig. - Kast det primære antistoff og vaske membranen 6 ganger i 5 minutter hver med 1 x PBS.
- Forbered det primære antistoff i henhold til produsentens retningslinjer i 5 ml blokkering buffer med 0,1% Tween 20. Inkuber membran med den fremstilte primære antistoff over natten ved 4 ° C med konstant omrøring.
- Sekundært antistoff utvalg og forberedelse
- For secondary bare merking vurdering for kontrollformål, hoppe over trinn 5.2.1 og 5.2.2 ovenfor, og gå videre til trinn 5.3 til å bestemme utvalgsspesifikke sekundære båndmønstre. Se figur 3.
Figur 3. Optimalisering av sekundære antistoffer. A) En multiarts sammenligning av sekundær kun ikke-spesifikke merking mot 15 ug av muse (M), sau (O) og Equine (E) nervevev homogenater med en rekke forskjellige fluorescerende sekundære antistoffer merket . L er molekylvekten stigen. Ovine vev homogenat var den eneste prøve som kryssreagerer med det sekundære merking ved bruk av esel anti-geit-antistoff 800. B) Det er også viktig å fastslå om ikke-spesifikk merking oppstår ved bruk av en annen vevsprøve, dvs. murin gastrocnemius muskel (15 _6; g belastning). Denne prøven kryssreagerer med eselet anti-mus 680 sekundært antistoff, men dette skjedde ikke når du bruker musen hjernehomogenat.
- Klargjør fluorescerende merket sekundært antistoff 680 eller 800 (rød eller grønn kanal) etter produsenten anbefalte konsentrasjoner i blokkering buffer med 0,1% Tween 20. Inkuber membranen i mørket med den preparerte sekundært antistoff i 90 minutter ved romtemperatur med konstant omrøring.
- Kast det sekundære antistoff og vaske membranen 6 ganger i 5 minutter per vask med 1 x PBS. Gå videre til trinn 6 - visualisering.
- Hvis visualisering av markører ikke fungerer som forventet, eksamen stiger med en rekke sekundære antistoffer som et egnet ekstra trinn. Ikke alle sekundære antistoffer tillater visualisering av alle merkebånd i alle kommersielt tilgjengelige stiger.
- Hvis forventet band er ikke synlig, kan du bruke en alternativ sekundær vert, dvs. donkey anti kanin geite-antikanin versus betegner en egnet protokoll modifikasjon. Se figur 4. Host arter som brukes til å heve et sekundært antistoff kan noen ganger føre til et problem med visualisering grunn av mangel på spesifisitet for spesifikke primære antistoffer.
Figur 4. Problemløsning sekundært antistoff spesifisitet Western blot av en rekke forskjellige vevsprøver (15 ug protein per bane) -. Fett, muskler, ben og lever - ERK inkubert med primært antistoff og inkubert med tre forskjellige sekundære antistoffer. Øvre panel: WB merket med LI-COR geite-anti-kanin-sekundært antistoff produsert 680 svak merking av fett og ben, og ikke noe signal ble detektert i leveren og muskelprøver. Midtre panelet: Membran (fra topp panel) ble strippet og reprObed bruker ECL metodikk og Geit anti-kanin HRP knyttet sekundært. Band er nå synlig i muskel og leverprøver og merking synes mer intense i fett og bein prøver. Bunnplate: Membran (fra toppen og midtpanelet) ble strippet og reprobed hjelp LI-COR Donkey anti-kanin 680 sekundært antistoff som har vist en større affinitet for ERK primære antistoff. Merking for muskel og lever er nå synlig med økt signalintensitet fra både fett og bein prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
6. Visualisering
MERK: Alle bilder er kjøpt ved hjelp av LI-COR Odyssey Classic imager og tilhørende Image Pro analyse programvare (versjon 3.1.4).
- Snu og logge på datamaskinen og imager. Åpne bildebehandlingsprogrammer og opprette en ny fil. Se figur 5.
Figur 5. Visualisering og kvantifisering av western blot. Skanningen av en western blot viser murine gastrocnemius muskelen (30 mikrogram belastning) undersøkt med Annexin V primært antistoff (36 kDa) og geit anti-kanin 800 sekundært antistoff. Membranen ble skannet og visualisert i 800 kanal. For å kvantifisere protein (Annexin V), er en rektangulær boks trukket rundt båndet av interesse fra prøven 1. Denne blir så kopiert og limt over de resterende eksempel baner for å sikre måling av det samme område. Bakgrunn automatisk utgjorde rundt formen trukket, men dette kan forandres for å sikre bakgrunnen målingen er nøyaktig definert. Tabellen nedenfor viser de tallfestede målinger av hver figur trukket inkludert total signal oppnås, bakgrunn og signal med bakgrunn trekkes fra. Denne informasjonen kan deretter eksporteres til enregnearkprogram for å beregne uttrykk forholdstall (som bestemmes av relative fluorescens intensitet) og lar påfølgende statistiske analyser som skal utføres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Åpne lokket av imager. Hell en liten mengde 1x PBS på glasset på den nederste venstre hjørne og deretter plassere membran på toppen av PBS. Sikre at membranen er firkantet med aksen på bildefanger og en 1 cm gap som er igjen mellom membranen og gitteret akse.
- Rull membran for å sikre at ingen bobler er fanget mellom glasset og membranen.
- Tell antall kvadrater membranen inntar på x- og y-aksen. Lukk lokket på imager. Oppgi antall ruter membranen opptar på dataprogrammer.
- Velg den aktuelle kanal for å skanne membranen som vil avhenge av det fluorescerende tagav det sekundære antistoff, dvs. kanal 700 eller 800 når en kanal 680 eller 800 fluoriserende merkede antistoff har blitt brukt hhv. Når dobbel merking er utført, skanne i begge kanaler.
MERK: Optimaliser enkelt protein merking før utføring av dual merking. - Velg intensitet for å skanne membranen, hvis en høy overflod protein bruke en lav intensitet scan. Alternativt hvis det primære antistoffet har dårlig affinitet for protein av interesse å velge en høyere intensitet scan, dvs. nivå 5. Trykk på start for å starte skanningen. Gå videre til trinn 6.4.
- Visualisering av lastekontroll-gel (figur 6).
Figur 6. Totalt protein merking og analyse. A) Fotografi av en total protein merket gel som inneholder 20 mikrogram av hest cervical ganglia homogenate per kjørefelt. B) Gel fra Panel Askannet i 680 kanal. C) Diagram over kvantifiserte målinger fra total protein farget gel innhentet ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer. En rekke målinger bestemmes av molekylvektmarkører, det vil si, 30 til 110 kDa, blir tatt for å tilveiebringe et histogram av målinger for å sikre standardfeil (SEM) er lav (av de grupperte prøver) som indikerer at total proteinnivåer i hver prøve er ensartet over gelen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.- Følg trinn 6.1 og 6.2.
- Hell destillert vann på glasset i nedre hjørne av imager der rutenettet aksen begynner.
- Plassere gelen på toppen av vannet og manøvrere slik at banene er vinkelrett til enten x- eller y-aksen av nettet. La et 1 cm gap mellom y og x-aksen av gitteret og gelen og telle antall kvadrater gelen opptar på gitteret akse. Lukklokket på imager.
- Oppgi antall ruter gelen opptar på dataprogrammer.
- Velg kanalen 700 for å skanne det totale protein farget gel.
MERK: Blå fluoresces i 700 kanal. - Sett intensiteten til 5 og trykk start.
- Kvantifisering av skannet bilde
- Juster lysstyrke og kontrast knappene for å produsere den beste bildekvaliteten. Dersom det synes å være høy bakgrunnsstøy, vil søke gjennom membranen ved en lavere intensitet og bruk av høy kvalitet skanne innstilling.
MERK: Eventuelle justeringer vil ikke endre de fluorescerende data ervervet ved skanning. - Rotere bilder 90 °, 180 ° og 270 ° for å vise i ønsket retning med ingen endring i dataene ervervet. Men når du gjør små justeringer av orientering i "fri rotasjon", av mer enn 3 °, kan data ervervet i Piksilasjon verdier bli forvrengt og dermed påvirke kvantifisering resultater.
- Velg en form fra figurer menyen - bruk et rektangel i de fleste tilfeller - og tegne rundt bandet av interesse (WB) eller hele lane (total protein gel) i prøven spor 1.
- Kopier og lim formen over til prøve kjørefelt to band av interesse eller hele kjørefelt. Gjenta over hvert enkelt band av interesse for hver prøve, og hvert kjørefelt for total protein geler.
- Kontroller at bakgrunnen målingen ikke innlemme et signal i det neste felt. Bakgrunnen kan trekkes automatisk av programvaren og omfatter hele kanten rundt figuren tegnet eller det kan angis å være topp / bunn eller venstre og høyre side av figuren. Alternativt utpeke en brukerdefinert bakgrunnsboksen.
- Vise signal for figurer tabell for hver figur trukket i vilkår fluorescerende enheter. Bakgrunnen vil automatisk bli trukket fra signalet.
- Eksportere bildet som en TIF-fil for visning i ulike programvare. Ikke eksportere bildet og manipulere USIng non image pro programvare som dette vil endre de opprinnelige dataene ervervet av imager generere falske data.
- Gjenta trinn 6.4.3-6.4.7 når kvantifisere dual merking eller utføre flere målinger på lastekontroll gels å generere og samle standard feildata.
- Juster lysstyrke og kontrast knappene for å produsere den beste bildekvaliteten. Dersom det synes å være høy bakgrunnsstøy, vil søke gjennom membranen ved en lavere intensitet og bruk av høy kvalitet skanne innstilling.
7. Post Visualisering
- Hold membraner i 1x PBS eller tørke ut for langtidslagring for fremtidig re-sondering og stripping av membraner for andre proteiner av interesse.
- Stripping og re-sondering av membraner. Se figur 7.
Figur 7. Membran stripping og reprobing. Representative eksempler på membraner følgende ulike stripping trinn skannet med en infrarød bildedannende system. A. Den første immunodeteksjonsprosedyren ble gjennomført med CSP primært antistoff (kanin) og skannet ved 700 kanal. B. Først stripping og reprobing med ROCK2 (kanin) med 800-kanal. Oransje pil indikerer gjenværende CSP primært antistoff tilstede etter stripen og re-probe. Dette påvirker ikke målingen av ROCK2 som bandet er til stede ved en høyere molekylvekt (hvit pil). C. Andre strippe og reprobed med β spektrin-antistoff (geit) og visualisert i 800 kanal. D. Tredje stripping og reprobing med α-synuclein antistoff (kanin). E. Fjerde stripping og reprobing med ubiquitin antistoff (mus) med 800-kanal. Det er fortsatt gjenværende signal fra den siste antistoff (α-synuclein. Orange pil). F. Femte stripping og reprobing med CALB2 antistoff (kanin) avbildet i 700 kanal. Sekundære antistoffer som ble brukt var: geit-anti-mus-800cw, geite-anti-kanin-680rd, geite-anti-kanin-800cw, esel anti-geite 800cw (se Materialer List). Lane etiketter: L - stige, 1/260, - prøve 1/2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.- Sted membranen (e) i en firkantet petriskål som inneholder ca. 30 ml Revitablot strippebuffer og inkuberes mellom 5-20 minutter ved romtemperatur med konstant omrøring.
- Vask membranen (e) 3 ganger i PBS skann på imager for å sikre fullstendig fjerning av fluorescens har oppstått - dette trinnet bør gjentas etter hver stripe.
- Inkuber membranen (e) i lengre perioder hvis fluorescens gjenstår. Skanne membranen etter hver stripe for å bekrefte at det ikke er noe gjenværende sekundære signal.
MERK: Membran (e) bør bare strippet og reprobed et maksimum på tre ganger for å sikre at integriteten av membranen ikke har blitt kompromittert som resulterer i uønsket høy bakgrunns å signalforhold.
Representative Results
Som QFWB følsomhet og den lineære området for påvisning er større enn vanlig ECL deteksjon, er det en rekke kontrolltiltak som er avgjørende for å sikre at nøyaktige data samles inn, og dermed hjelpe effektiv tolkning. For det første, inkludering av positive kontrollprøver som vist i figur 1. For det andre, for å optimalisering av overføringen garantere tilsvarende bevegelse av høy- og lavmolekylære proteiner fra gelen til membranen som vist i figur 2. For det tredje, optimalisering av antistoffer, spesielt sekundært antistoffer som optimalisering er ofte oversett, men som kan produsere ikke-spesifikk banding i stand til å interferere med riktig tolkning av protein (er) av interesse. Se figur 3. For det fjerde kan det også være slik at når et protein synes ikke målbart, men er forventet å være til stede, kan dette også være et sekundært antistoff problem som kan korrigeres ved å bruke en sekundær raised i en annen vertsarter. Se figur 4. For det femte, er totalprotein-analyse, og merking en langt mer robust og kvantifiserbare fremgangsmåte i forhold til bruk av tradisjonelle enkelt protein (er) som er ubikvitært uttrykt for interne referansestandarder 3. Mange av disse enkeltproteiner er blitt funnet å bli uttrykt forskjellig i modeller av nevrodegenerative sykdommer så vel som mellom forskjellige vevsprøver og ensartetheten av uttrykket kan endre innenfor det samme vev 3. Derfor vil produksjonen av en lastekontroll-gel bekrefte ensartethet av prøvebelastning når den kombineres med en total protein-analyse ved å sammenligne og kvantifisering av proteinmengden i hvert kjørefelt på forskjellige molekylvekter varierer målt mot hver prøve for å indikere standard feil som demonstrert i Figur 6 . Viktigere, alle av disse feilsøkingsteknikker og kontroller er bare så effektiv som følsomheten og konsistensen av analysen tools anvendt av operatøren (figur 5). Endelig er denne teknikken gir seg til stripping og re-sentret av membraner med større fleksibilitet enn ECL på grunn av faktorer, inkludert, men ikke begrenset til økt følsomhet, redusert bakgrunn, to fargedeteksjon og membran stabilitet under langvarige lagringsbetingelser. Se figur 7.
Discussion
Hensyn og planlegging er viktig før noen forsøk, og kan til slutt avgjøre suksessen av teknikken som brukes. Fremskritt i protein deteksjon ved hjelp av WB kan presentere en mengde potensielle snublesteiner når du prøver å velge de riktige antistoffer, overføring og visualisering metoder å bruke. Heldigvis, med et nøye sjekkliste og hensiktsmessige kontrolltiltak QFWB kan brukes rutinemessig for å bestemme protein tilstedeværelse og stadig mer subtile uttrykk forskjeller mellom prøvene. Denne protokollen gir en omfattende guide til fluorescerende kvantitativ western blotting, samt noen få feilsøkings strategier for å unngå og / eller overvinne noen av de mange vanlige fallgruvene knyttet til den.
De kritiske trinn ansatt for å opprettholde følsomheten og få virkelig målbare og sammenlignbare målinger inkluderer: 1) robust protein utvinning fra vevsprøver; 2) prøveopparbeidelse; 3) nøyaktig protein loading bestemt ved total protein-analyse; 4) optimal overføring av proteiner ved hjelp av I-Blot; 5) Fremstilling av primære og sekundære antistoffer i blokkeringsbuffer inneholdende 0,1% Tween 20, og 6) korrekt visualisering og analyse ved hjelp av en infrarød bildefanger og tilhørende programvare.
Fluorescerende deteksjon er virkelig kvantitativ og gir større følsomhet i forhold til mer tradisjonelle ECL deteksjonsteknikker 3,11. Denne deteksjonssystemet er multi fasettert, og som sådan er ikke begrenset til QFWB. Dette systemet er i stand til avbildning av immunohistological merking på lav effekt slik visualisering og kvantifisering av hele vevssnitt 12. Dette er ett område av potensiell fremtidig utvikling i form av vedtak som kan se langt rødt bildebehandling rivaliserende konvensjonell immunfluorescens fange med konvensjonelle mikroskoper i form av kvantitativ vurdering.
Men med større følsomhet overfor subtile endringer i protein uttrykk det er viktig å sikre variabilitet er holdt til et minimum og kontrolltiltak er strenge med robuste protokoller. Dette begynner med streng protein utvinning fra vevsprøve fulgt av produksjonen av totale protein farget gels for å gi sikkerhet for at prøven lasting er uniform, optimalisering av primære og sekundære antistoffer for å avgjøre om påvisning er reell og teste produsentens retningslinjer med hensyn til å overføre ganger for å oppnå effektiv proteinoverføring.
Likevel, selv når forholdene for WB er optimalisert, kan det fortsatt problemer forbundet med å kjøre westernfilmer som kanskje ikke har vært fullt utforsket her. Disse omfatter, men er ikke begrenset til faktorer, inkludert protein solubilisering og valg av ekstraksjonsbuffer. Noen buffere kan interferere med proteinkonsentrasjons assays, og noen vev er spesielt vanskelige å oppløseliggjøre, som krever mer robust teknikker så som bruk av automatisert MaceraTing lukkede beholdere slik som M-rør sammen med en Mac dissociator. I tillegg kan enkle kontrolltiltak for lagring av ekstrahert og ikke-ekstraherte materialet ved -80 ° C være forskjellen mellom å oppnå en optimal merking umiddelbart etter ekstraksjon og ha dårlige resultater uker senere.
Moderne metoder er QFWB vist seg å være mer følsomme for å fange små forskjeller i proteinekspresjon, og er mer allsidig tillater simultan dobbelt merking 3 når sammenlignet med eldre teknikker som ECL. Det er viktig at vestlige blotting protokoller er robust og lett repeterbare for nøyaktig kvantifisering og statistisk analyse. Denne protokollen er følsom og robust nok til å brukes rutinemessig for deteksjon av proteiner tvers av en rekke ulike vevsprøver og arter tre og tillater kvantifisering av lave og høye overflod proteiner innen samme QFWB derfor redusere forbruks bruk samt tid per forsøk 1. 1. I tillegg gjør økt følsomhet av denne teknikken validering av stadig mer populært - omic studier 9,14 men nøyaktighet er avgjørende og inkludering av hensiktsmessige kontrolltiltak må følges dermed unngå feilaktige datainnsamling.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takker følgende for økonomisk støtte: BBSRC Institute Strategic Programme Funding - CF & TMW; BBSRC East Bio DTP finansiering - LG; The Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Vi ønsker også å takke Dr Barry McColl om tillatelse til å inkludere TREM2 optimalisering i dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
| M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life Technologies, UK | IB401001 | |
| MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life Technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
| SeeBlue Pre-stained protein standard | Life Technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
| NuPAge LDS Sample buffer 4x | Life Technologies, UK | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x) | Life Technologies, UK | NP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life Technologies, UK | NP0322BOX | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
| Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
| Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
| ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
| iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
| InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
| Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
- Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
- Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
- Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
- Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95 (2013).
- Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
- Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
- Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).
