Abstract
De late jaren 1970 zag de eerste publiekelijk gemeld gebruik van de western blot, een techniek voor de beoordeling van de aanwezigheid en relatieve rijkdom van specifieke eiwitten in complexe biologische monsters. Sindsdien heeft western blotting methode uitgegroeid tot een gemeenschappelijke component van de moleculaire biologen experimentele repertoire. Een vluchtige zoektocht van PubMed gebruik van de term "Western Blot" suggereert dat meer dan 220.000 gepubliceerde manuscripten gebruik van deze techniek hebben gemaakt in het jaar 2014. Belangrijk is, hebben de afgelopen tien jaar technische imaging vooruitgang in combinatie met de ontwikkeling gezien van fluorescente labels die verbeterde gevoeligheid en nog meer reeksen van lineaire detectie opgeleverd. Het resultaat is een nu echt Kwantificeerbaar Fluorescentie gebaseerd Western Blot (QFWB) waarmee biologen om vergelijkende expressie analyse uit te voeren met een grotere gevoeligheid en nauwkeurigheid dan ooit tevoren. Veel "geoptimaliseerd" western blottingmethoden bestaan en worden gebruikt in verschillende laboratoria. Deze blijken vaak moeilijk uit te voeren als gevolg van de eis van subtiele maar ongedocumenteerde procedurele wijzigingen. Dit protocol biedt een uitgebreide beschrijving van een gevestigde en robuuste QFWB methode, compleet met strategieën voor probleemoplossing.
Introduction
Western blotting (WB) is een analytische techniek die oorspronkelijk ontwikkeld in de late jaren 1970 om de aanwezigheid of afwezigheid van een eiwit van interesse om een complex biologisch monster, zoals een weefsel homogenaat 1. Meestal aangeduid als eiwit immunoblot, Gezien de cruciale interactie van antilichaam-antigeen, de werkwijze bestaat uit 5 verschillende stappen: 1) de elektroforetische scheiding van eiwitten door hun iso-elektrisch punt; 2) de overdracht naar een nitrocellulose of polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan; 3) het labelen met een primair antilichaam dat specifiek is voor het eiwit van belang; 4) incubatie met een secundair antilichaam gericht tegen de primaire antilichaam; en 5) visualisatie.
Visualisatie methodiek is geëvolueerd met de tijd om de veiligheid en de gevoeligheid te verbeteren. Enkele van de eerste WBS werden uitgevoerd met radioactief gemerkt labels die vervolgens ontwikkeld tot colorimetrische en vervolgens de meer algemeen gebruikte chemilluminescent (ECL) methoden. Radioactivity werd direct gemerkt op probes voor specifieke antigenen dat kleur- en ECL methodologieën indirecte labeling techniek met een reporter enzym zoals alkalische fosfatase of streptavidine horseradish peroxidase (HRP) 2. De intensiteit van etikettering van de chromageen of luminescerende product wordt gemeten met densitometrie waarbij de signaalsterkte, sterk of zwak, geeft min of meer de aanwezigheid van het eiwit van interesse in het monster. ECL is het gevoeliger en dus bevoordeeld methodologie 2 maar alle 3 de methoden werden in eerste instantie ontwikkeld op x-ray film met meer geavanceerde digitale imaging technieken later vastgesteld 3. De vooruitgang van digitale beelden van WB niet alleen toegestaan onderzoeker om de aanwezigheid of afwezigheid van het eiwit van interesse te bepalen, maar ook toegestaan een gevolgtrekking om het niveau van expressie van een gekozen eiwit in vergelijking met andere monsters en kunnen daarom worden aangeduid als "semikwantitatieve & #8221 ;. Onlangs heeft een echt kwantitatieve en gevoeliger western blotting techniek ontwikkeld waarbij de mate van fluorescentie gemeten direct gerelateerd aan de hoeveelheid en expressie van een eiwit in een monster: kwantitatief fluorescent western blotting (QFWB).
Bij vergelijking QFWB met ECL etikettering, het gebruik van een fluorescerende secundair antilichaam genereert een lineair detectieprofiel 4. Dit in tegenstelling tot ECL technieken waar signaallineariteit gebeurt meestal met lage eiwit last van minder 5 ug en signaalverzadiging rechtstreeks verband houden met eiwitexpressie, dwz met alom tot expressie housekeeping genen 5,6. Dit verschil wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een groter aantal bindingsplaatsen beschikbaar tegen avidine ECL substraat te binden aan een gebiotinyleerd secundair, waardoor een grotere kans potentiële signaalverzadiging. Dit is een van de belangrijkste redenen voor ECL base immunoblotting wordt aangeduid als ONLy "semi-kwantitatieve" 7. Het verzadigingspunt van signaal van cruciaal belang bij het meten subtiele verschillen in expressieniveaus en kan leiden tot onnauwkeurige metingen. In de afgelopen jaren is de opkomst van grootschalige proteomics technieken detaillering steeds grotere gevoeligheid en identificatie van subtiele expressie verschillen heeft geleid tot een steeds grotere afhankelijkheid van werkelijk kwantitatieve western blotting voor validatie-experimenten 8,9. De toepassing van gevoelige, robuuste en echt kwantitatieve methodiek is daarom cruciaal.
Veel "geoptimaliseerd" western blotting methodieken zijn gebruikt door onafhankelijke laboratoria, die vaak blijken moeilijk op te zetten of te repliceren vanwege subtiele methodologische aanpassingen die niet duidelijk in formele gedocumenteerde protocollen kunnen zijn. Dit is een gevestigde en robuust protocol voor QFWB en bovendien geeft waardevolle strategieën voor het oplossen van gemeenschappelijke problemen that zich kunnen voordoen tijdens de uitvoering.
Dit protocol werd oorspronkelijk geoptimaliseerd voor murine hersenhomogenaten, maar is sindsdien effectief gebruikt in een breed scala van weefselmonsters en soorten 4,9,10. Potentiële protocol variaties nodig zijn voor specifieke kwesties oplossen van problemen zijn inbegrepen.
Protocol
Dit protocol is geoptimaliseerd met commercieel geproduceerde buffers, gels en overdracht stapels om variabiliteit verminderen en de consistentie. Raadpleeg Materials List voor een volledige lijst van hulpstoffen nodig.
Fluorescerende WB protocol met behulp van I-Blot snelle overdracht en LI-COR Odyssey imaging systeem
1. Bereiding van monster
- Buffer selectie / opstelling
- Selecteer een geschikte extractie buffer voor monster homogenisering en ervoor te zorgen dat de buffer is compatibel met alle downstream-technieken worden ingezet. Bereid een extractiebuffer: RIPA buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS) die 5% proteaseremmer cocktail voor isolatie proeven.
OPMERKING: Er zijn veel verschillende soorten extractiebuffers verkrijgbaar en worden geselecteerd afhankelijk van de locatie van het eiwit van belang in de cel. Deze omvatten maar zijn nietbeperkt tot RIPA buffer (hele cellen, mitochondriale en nucleaire componenten), NP-40 lysis buffer (cellulair of membraangebonden) en Tris-Triton (cytoplasmatisch skelet gebonden). Echter, sommige chemische reinigingsmiddelen in extractiebuffers helpen solubiliseren of zelfs een eiwit deactiveren maar kan storen eiwitbepaling als een bepaalde eiwitbepaling assay, dwz bicinchoninezuur (BCA) assay. Controleer richtlijnen van de fabrikant ten aanzien van chemische verenigbaarheid met de test.
- Selecteer een geschikte extractie buffer voor monster homogenisering en ervoor te zorgen dat de buffer is compatibel met alle downstream-technieken worden ingezet. Bereid een extractiebuffer: RIPA buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS) die 5% proteaseremmer cocktail voor isolatie proeven.
- Eiwitextractie / oplosbaar
- Handmatig maceraat het weefselmonster met een schaar en / of scalpel gevolgd door homogeniseren met behulp van een dounce of een handbediende elektrische homogenisator met een polypropyleen tip in de bereide extractiebuffer ongeveer 1:10 w / v (gewicht weefsel / buffer volume) tot glad / consistente homogenaat wordt geproduceerd.
OPMERKING: Voor kleinere, kostbare / moeilijk te verkrijgen monsters, detergent gebaseerd extracties can nog steeds effectief neer op 1: 5. - Stel homogenisatie, centrifuge monsters bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant dat de opgeloste eiwitten en bewaar bij -80 ° C totdat ze nodig waren. Behouden onoplosbare pellets verder strengere extractie toe indien later nodig. Ga verder met eiwitbepaling stap 1.3.
- Handmatig maceraat het weefselmonster met een schaar en / of scalpel gevolgd door homogeniseren met behulp van een dounce of een handbediende elektrische homogenisator met een polypropyleen tip in de bereide extractiebuffer ongeveer 1:10 w / v (gewicht weefsel / buffer volume) tot glad / consistente homogenaat wordt geproduceerd.
- Eiwitbepaling
- Bepaal de eiwitconcentratie in elk monster geëxtraheerd met behulp van een BCA, Bradford of dergelijke assay. Bij het berekenen van de standaard curve op dat de determinatiecoëfficiënt verhouding, R-kwadraat waarde groter dan of gelijk aan 0,99 waarin de meest nauwkeurige bepaling van eiwitgehalte in de monsters 15 weerspiegelt.
Opmerking: Alle monsters worden vergeleken door QFWB worden getest tegen dezelfde standaard curve.
- Bepaal de eiwitconcentratie in elk monster geëxtraheerd met behulp van een BCA, Bradford of dergelijke assay. Bij het berekenen van de standaard curve op dat de determinatiecoëfficiënt verhouding, R-kwadraat waarde groter dan of gelijk aan 0,99 waarin de meest nauwkeurige bepaling van eiwitgehalte in de monsters 15 weerspiegelt.
- Voorbereiding van het monster
- Plannen en noteer de laadvolgorde van ladders en monsters voor 2 identieke gels: gel 1 voor overdracht en gel 2 als een laad controle. Laad de controle en "behandeld" monsters sequentieel aan een vooroordeel dat zou kunnen ontstaan met een slechte of eenduidige overdracht te voorkomen.
- Bereken de hoeveelheid eiwit voor elke monster. Een standaard eiwit belasting eiwitten in neuronale isolaten 15 ug. Maak elk monster tot een 10 ul volume met dH 2 O. Voeg 5 ul loading buffer, vortex en verwarm bij 98 ° C gedurende 2 min.
- Omvatten positief controlemonster zoals een recombinant eiwit als hulpmiddel bij de identificatie van de juiste band plaats. Maar de positieve controlemonster kunnen bereiden volgende richtlijnen van de fabrikant voor selectie van de verkeerde banden voorkomen. Zie figuur 1.
Figuur 1. POSITIEVE controle selectie. De toevoeging van positieve controles een experiment bevestigt de gedetecteerde etikettering reëel. Voorzichtigheid moet echter voor worden gezorgd uw controle werkt goed voor met experimentele monsters. A) Fusion eiwit TREM 2 werd onder richtlijnen van 1 ug / ml van de fabrikant geladen, maar de labeling waargenomen bij 110 kDa conflicten datasheet voorspelde moleculaire gewicht van 60-70 kDa. B) Na toevoeging en incubatie met het reductiemiddel, werd het fusie-eiwit etiket gedetecteerd bij het voorspelde molecuulgewicht. Echter, dit betekent een grotere proteïnebelading was nodig omdat het reductieproces verminderde het signaal van het eiwit.
2. elektroforetische scheiding van eiwitten
- Bereiding van 4-12% Bis / Tris gel (1,0 mm)
Opmerking: Gradient gels worden gebruikt om grotere eiwitscheidingsprotocol produceren over een breed moleculair gewicht.- Selecteren en voor te bereiden MESof MOPS lopende buffer (1 L per tank) door verdunning met dH 2 O. MES buffer produceert betere resolutie van eiwitten in 3,5-160 kDa dat MOP loopbuffer voorkeur hoger molecuulgewicht eiwitten boven 200 kDa gedetecteerd zal echter slechter resolutie lager molecuulgewicht eiwitten dan 15 kDa.
- Verwijder de kam en het stukje tape dat de voet van de gel dekt. Voorzichtig wassen de putten met lopende buffer met behulp van een pipet 1 ml. Vul de putjes met loopbuffer en waarborgen geen luchtbellen achterblijven in de gel.
- Gelbereiding en laden
- Steek de gels in de tank en vul de inter gel compartiment met lopende buffer te zorgen dat alle zeehonden in werking effectief zijn.
- Voeg 3 ul van molecuulgewichtstandaard in het eerste putje in 1 gel en gel 2. Plaats 10 gl van elk monster in volgende putjes.
OPMERKING: Met uitzondering van de ladders moeten gel 1 & gel 2 identiek zijn. Het is absoluut noodzakelijk thbij de pre-lood molecuulgewichtsstandaard gebruikt voor gel 2 is blauw en zichtbaar bij het gebruik van een totaal eiwit vlek in het oog zichtbaar in de 700-kanaal van Odyssey imager te zijn. - Zodra beide gels worden geladen, vul de tank met de resterende lopende buffer en zet de deksel.
- Elektroforese
- "Run" de gel bij 80 V gedurende 4 minuten om de steekproef te waarborgen voert de polyacrylamide gel matrix op een uniforme wijze. Daarna verhogen de spanning en tijd 180 V gedurende 50 minuten respectievelijk of totdat het monster kleurstof zichtbaar aan de voet van de gel.
OPMERKING: Hogere spanningen kunnen worden toegepast op kortere doorlooptijden te realiseren. Dit kan echter leiden tot "Smiley" gels waar de monsters midden van de gelen sneller dan de buitenbaan monsters door temperatuurverhoging 14 draaien.
- "Run" de gel bij 80 V gedurende 4 minuten om de steekproef te waarborgen voert de polyacrylamide gel matrix op een uniforme wijze. Daarna verhogen de spanning en tijd 180 V gedurende 50 minuten respectievelijk of totdat het monster kleurstof zichtbaar aan de voet van de gel.
3. Totaal Eiwit Vlek van het laden Controle Gel
- Vrijlating gel 2 uit de cassette met behulp vaneen gel mes. Verwijder de putten en de voet van de gel. Markeer de gel aan hulp oriëntatie.
- Giet ongeveer 30 ml van het eiwit vlek in een vierkant petrischaal (geschatte grootte 12 x 12 cm). Plaats gel 2 in het eiwit vlek, zodat de oplossing omvat de gehele gel, daarna roeren de gel gedurende 1 uur minimum bij kamertemperatuur vlekken.
- Giet het eiwit vlek en was de gel 3x in gedestilleerd water voorafgaand aan de visualisatie. Ga verder met stap 6.3 te visualiseren.
4. I-Blot Semi Dry Fast Protein Transfer
OPMERKING: Alle reagentia die nodig zijn voor eiwit-overdracht met behulp van de I-Blot machine zijn commerciële producten die speciaal voor de I-Blot methode en kan worden gevonden in de Materials List.
- Bereid de "onderkant" overdracht stack. Verwijder folie deksel en pre-nat met stromend buffer rechtstreeks van de gel tank. Pre-nat filtreerpapier met gedestilleerd water.
- Herhaal stap 3.1 en plaats gel 1 opde voorbereide "bottom" overdracht stack.
- Leg de pre-nat filter papier over de gel. Rol het filterpapier en gel te zorgen dat er geen luchtbellen gevangen zitten tussen de lagen.
- Verwijder het folie deksel van de toptransfer stapel en leg de bovenste stapel boven op het filter met het onderste stapel. Rol de overdracht stack "sandwich" om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Plaats de spons van de overdracht stapel kit op het deksel van de I-Blot machine. Plaats de overdracht stapel sandwich op de speciale ruimte op de I-Blot machine daarna sluiten het deksel goed. Start de I-Blot en overdragen voor 8,5 min op programma 3.
- Als er een laag eiwit signaal of oneffen hoog: laag moleculair gewicht eiwit verhoudingen, testen overstaptijden van de fabrikant bij het gebruik van een semi-droge "snelle" overdrachtsmethode. Voer een eenvoudige optimalisatie protocol met monster herhalingen van identieke belasting het ideale overdrachtvoltage / tijdcombinatie bepalen zoals weergegeven in figuur 2 .
Figuur 2. Optimalisatie van overdracht met de I-Blot. A) Een enkele gel geladen met ladder en 15 ug muizen gehele hersenhomogenaat in drie tandem repeats werd gesneden in drie delen. Eén sectie werd niet overgedragen werd één overgebracht 7,5 min (volgens richtlijnen van de fabrikant) en een 8,5 min. De gel secties werden daarna gekleurd met Direct Blue eiwit vlek, gescand op een infrarood imager in het kanaal 680 en gekwantificeerd. B) Grafische weergave van de kwantificering waarden tonen het verschil in proteïneresten van elke gel na 0, 7,5, en 8,5 min van de overdracht. Merk op dat er een extra minuut overstaptijd resulteerde in extra eiwit overdracht van ongeveer 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
5. antilichaamdetectietests van Eiwitten
- Membraan voorbereiding en blokkeren
- Verwijder overdracht stapel uit de I-Blot machine. Verwijder de bovenste en filterpapierlaag blootstellen van de gel op de bodem overdracht stack.
- Snij rond de gel met een scalpel en ervoor te zorgen dat een driehoekige snede ter oriëntatie is vertegenwoordigd op het membraan. Na membraan in orde maken, eiwit vlekken de gel om de overdracht efficiëntie te controleren en / of te verwijderen.
- Snel bewegen de membraan in een schone buis van 50 ml (of gelijkwaardige opvangbak) met 5 ml 1x PBS en plaats op een mechanische roller (of orbitaal platform) voor constant roeren.
LET OP: Het is essentieel dat het membraan niet mag uitdrogen. Tijdens de semi-droge overdracht het membraan heet wordt. Wacht 2 minuten voor het openen van de overdracht stack als deze ik zal toestaant afkoelen en trage droogtijd tijdens stack deconstructie. Gebruik van een wals en buis voor agitatie tijdens wassen en incubaties maakt aanzienlijke vermindering van de hoeveelheden van oplossingen nodig. - Was het membraan 3 x 5 min in 1x PBS. Gooi de 1x PBS en blokkeren de membraan met onverdunde blokkerende buffer gedurende ten minste 30 min bij kamertemperatuur.
- Primaire antilichaambereiding.
- Bereid de primaire antilichaam volgens de richtlijnen van de fabrikant in 5 ml blokkerende buffer met 0,1% Tween20. Incubeer het membraan met de bereide primaire antilichaam overnacht bij 4 ° C onder constant roeren.
Opmerking blokkeren buffer wordt gewoonlijk onverdund gebruikt maar kunnen worden verdund tot 1: 4 met PBS als het primaire antilichaam hoog genoeg specificiteit. - Gooi het primaire antilichaam en was het membraan 6 maal gedurende 5 minuten elk met 1x PBS.
- Bereid de primaire antilichaam volgens de richtlijnen van de fabrikant in 5 ml blokkerende buffer met 0,1% Tween20. Incubeer het membraan met de bereide primaire antilichaam overnacht bij 4 ° C onder constant roeren.
- Secundair antilichaam selectie & voorbereiding
- Voor secondary alleen labelen assessment voor controledoeleinden, slaat u stap 5.2.1 en 5.2.2 hierboven en ga verder met stap 5.3 tot monster specifieke secundaire bandenpatronen bepalen. Zie figuur 3.
Figuur 3. Optimalisatie van secundaire antilichamen. A) Een multi species vergelijking secundair enige niet-specifieke labeling met 15 ug muizen (M), schapen (O) en Equine (E) zenuwweefsel homogenaten met verschillende fluorescente secundaire antilichamen gelabeld . L is het molecuulgewicht ladder. Schapen weefselhomogenaat het enige monster kruisreageren met de secundaire labeling bij gebruik ezel anti-geit antilichaam 800 B). Het is ook belangrijk om vast te stellen of niet-specifieke labeling plaatsvindt wanneer een ander weefselmonster, bijvoorbeeld murine gastrocnemius (15 _6; g belasting). Dit monster kruis reageert met de ezel anti-muis 680 secundair antilichaam, maar dit gebeurde niet bij het gebruik van de muis hersenhomogenaat.
- Bereid de tl-gelabeld secundair antilichaam 680 of 800 (rode of groene kanaal) volgende fabrikant aanbevolen concentratie in het blokkeren van buffer met 0,1% Tween20. Incubeer het membraan in het donker met de bereide secundair antilichaam gedurende 90 min bij kamertemperatuur onder constant roeren.
- Gooi het secundaire antilichaam en was het membraan 6 keer gedurende 5 minuten per wasbeurt met 1x PBS. Ga verder met stap 6 - visualisatie.
- Als visualisatie van markers werkt niet zoals verwacht, examen ladders met een bereik van secundaire antilichamen als een geschikte extra stap. Niet alle secundaire antilichamen laat visualisatie van alle marker bands in alle commercieel beschikbare ladders.
- Indien de verwachte bands zijn niet zichtbaar, gebruik dan een alternatieve secundaire gastheer, dwz, donkey anti konijn versus geit anti konijn een geschikte protocol modificatie. Zie figuur 4. Gastheersoort beoogd een tweede antilichaam te verhogen kan soms leiden tot een probleem met visualisatie door gebrek aan specificiteit voor specifieke primaire antilichamen.
Figuur 4. Problemen secundair antilichaam specificiteit Western blot van verschillende weefselmonsters (15 pg eiwit per laan) -. Vet, spier, lever en bot - ERK geïncubeerd met primair antilichaam en geïncubeerd met drie verschillende secundaire antilichamen. Bovenkant: WB gelabeld met LI-COR geit anti-konijn secundair antilichaam 680 weak labeling vet en bot en geen signaal werd gedetecteerd in de lever en spieren monsters. Middenpaneel: Membraan (van bovenste paneel) werd gestript en reprobed behulp ECL methodologie en de geit anti-konijn HRP gekoppelde secundaire. Bands zijn nu zichtbaar in de spieren en de lever monsters en etikettering lijkt intenser in het vet en bot monsters. Onderkant: Membraan (van boven en middelste paneel) werd gestript en opnieuw gesondeerd met behulp van LI-COR Donkey anti-konijn 680 secundaire antilichaam dat is gebleken dat een grotere affiniteit voor de ERK primaire antilichaam. Etikettering voor spier en lever is nu zichtbaar met een verhoogde signaal intensiteit van zowel vet en bot monsters. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6. Visualisatie
OPMERKING: Alle beelden worden verkregen met behulp van de LI-COR Odyssey Classic imager en bijbehorende Image Pro analyse software (versie 3.1.4).
- Draai en meld u aan op de computer en imager. Open de imaging-software en maak een nieuw bestand. Zie figuur 5.
Figuur 5. Visualisatie en kwantificering van western blot. Scan van een western blot die muizen gastrocnemius (30 ug belasting) gemerkt met Annexin V primair antilichaam (36 kDa) en geit anti-konijn 800 secundair antilichaam. Het membraan werd gescand en gevisualiseerd in de 800 kanalen. Aan het eiwit (Annexin V) te kwantificeren, is een rechthoekige doos getekend rond de band van belang uit steekproef 1. Dit wordt dan gekopieerd en geplakt over de resterende monster rijstroken om de meting van hetzelfde gebied te waarborgen. Achtergrond automatisch verwerkt rond de vorm getekend maar dit kan worden gewijzigd volgens de achtergrond meting nauwkeurig gedefinieerd waarborgen. De onderstaande tabel toont de gekwantificeerde metingen van elke vorm getrokken inclusief totale signaal verkregen, achtergrond en signaal met de achtergrond afgetrokken. Deze informatie kan vervolgens worden geëxporteerd naar eenspreadsheet programma om uitdrukking verhoudingen te berekenen (zoals bepaald door de relatieve fluorescentie-intensiteit) en maakt het mogelijk de verdere statistische analyses uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Open het deksel van de imager. Giet een kleine hoeveelheid 1x PBS op het glas op de linker benedenhoek en leg dan de membraan op de top van de PBS. Zorgen de membraan vierkant met de as van de imager en een 1 cm spleet overblijft tussen het membraan en de raster as.
- Rol het membraan zodat er geen luchtbellen worden opgesloten tussen het glas en het membraan.
- Tel het aantal vierkantjes het membraan inneemt in de x- en y-as. Sluit het deksel van de imager. Voer het nummer van de pleinen in het membraan inneemt op de computer software.
- Kies het juiste kanaal op het membraan zal afhangen van het fluorescerende label scannenvan het secundaire antilichaam, dat wil zeggen, 700 channel of 800 kanaal wanneer een 680 of 800 tl gemerkt antilichaam is respectievelijk zijn gebruikt. Wanneer dubbele etikettering wordt uitgevoerd, scant u in beide kanalen.
OPMERKING: Optimaliseer enkel eiwit etikettering voorafgaand aan het uitvoeren van dubbele etikettering. - Selecteer de intensiteit aan het membraan te scannen, als een hoge overvloed eiwit gebruiken een lage intensiteit scan. Alternatief als het primaire antilichaam slechte affiniteit voor het eiwit van interesse te selecteren een hogere intensiteit scan, dat wil zeggen, niveau 5. Druk begint de scan te starten. Ga verder met stap 6.4.
- Visualisatie van de belastingsbegrenzing gel (figuur 6).
Figuur 6. Totaal eiwit etikettering en de analyse. A) Foto van een totaal eiwit gelabeld gel met 20 ug van equine cervicale ganglia homogenisaat per rijstrook. B) Gel uit Panel Agescand in de 680-kanaal. C) Grafiek van gekwantificeerde metingen van de totale hoeveelheid eiwit gekleurde gel verkregen met behulp van beeldbewerkingssoftware. Een reeks metingen bepaald molecuulgewicht merkers, namelijk 30-110 kDa, verwerkt in een histogram metingen geven aan standaardfout waarborgen (SEM) laag (van de gegroepeerde monsters) dat aangeeft dat de totale eiwitniveaus in elk monster uniform over de gel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.- Volg de stappen 6.1 en 6.2.
- Giet gedestilleerd water op het glas in de onderste hoek van de imager waar het net as begint.
- Plaats de gel boven het water en manoeuvreren zodat de rijstroken loodrecht op de x- of y-as van het raster. Reactie 1 cm tussen de y- en x-as van het raster en de gel en tel het aantal vierkantjes de gel inneemt op het rooster as. Dichthet deksel van de imager.
- Voer het nummer van de pleinen van de gel inneemt op de computer software.
- Selecteer het kanaal 700 aan het totale eiwit gekleurde gel scannen.
OPMERKING: Blue fluoresceert in de 700-kanaal. - Stel de intensiteit tot 5 en druk op start.
- Kwantificering van de gescande afbeelding
- Pas de helderheid en het contrast knoppen om de beste beeldkwaliteit te produceren. Als er sprake lijkt te hoog achtergrondgeluid, scan het membraan op een lagere intensiteit en gebruik de instelling van hoge kwaliteit scan.
OPMERKING: Eventuele aanpassingen zullen niet de tl-gegevens verkregen bij het scannen wijzigen. - Afbeeldingen roteren 90 °, 180 ° en 270 ° om te bekijken in de gewenste richting, zonder verandering van de verkregen data. Wanneer echter kleine aanpassingen van oriëntatie in "vrije rotatie", met meer dan 3 °, gegevens verworven pixilation waarden kan vervormd worden en dus de kwantificering resultaten beïnvloeden.
- Kies een vorm uit de vormen menu - gebruik maken van een rechthoek in de meeste gevallen - en trekken rond de band van belang (WB) of de gehele rijbaan (totaal eiwit gel) in de steekproef van baan 1.
- Kopieer en plak de vorm over te brengen aan het monster laan 2 band van belang of de gehele rijbaan. Herhaal dit aan de overkant van elke individuele band van belang voor ieder monster en elke baan voor totaal eiwit gels.
- Controleer of de achtergrond meting geen signaal op te nemen in de volgende baan. De achtergrond kan automatisch in mindering worden gebracht door de software en omvatten hele rand rond de vorm getrokken of het kan worden gespecificeerd boven / onder of links en rechts van de vorm te zijn. Als alternatief, wijst een door de gebruiker gedefinieerde achtergrond doos.
- Geef het signaal voor de tafel vormen voor elke vorm getekend in willekeurige fluorescerende eenheden. De achtergrond wordt automatisch afgetrokken van het signaal.
- Exporteer het beeld als een TIF-bestand om te bekijken in verschillende software. Niet exporteren van het imago en manipuleren using niet-image pro software, omdat dit zal de oorspronkelijke gegevens verworven door de imager genereren valse gegevens wijzigen.
- Herhaal de stappen 6.4.3-6.4.7 wanneer kwantificeren dubbele etikettering of het uitvoeren van meerdere metingen aan het laden controle gels te genereren en verzamelen standaardfout data.
- Pas de helderheid en het contrast knoppen om de beste beeldkwaliteit te produceren. Als er sprake lijkt te hoog achtergrondgeluid, scan het membraan op een lagere intensiteit en gebruik de instelling van hoge kwaliteit scan.
7. Bericht Visualisatie
- Houd membranen in 1x PBS of uitdrogen voor langdurige opslag voor toekomstige re-sonderen en het strippen van de membranen voor andere eiwitten van belang.
- Strippen en opnieuw sonderen van membranen. Zie Figuur 7.
Figuur 7. Membraan strippen en reprobing. Representatieve voorbeelden van membranen na diverse strippen stappen gescand met een infrarood imaging systeem. A. De eerste immunodetectie werd uitgevoerd met CSP primair antilichaam (konijn) vervoerd en gescand op 700 kanaal. B. Eerst strippen en reprobing met Rock2 (konijn) met 800 kanalen. Oranje pijl geeft resterende CSP primair antilichaam aanwezig is na de strip en re-sonde. Dit laat de meting van Rock2 de band aanwezig in een hoger molecuulgewicht (witte pijl). C. Tweede strippen en opnieuw gesondeerd met β-Spectrin antilichaam (geit) en gevisualiseerd in de 800-kanaal. D. Derde strippen en reprobing met α-synucleïne antilichaam (konijn). E. Vierde strippen en reprobing met ubiquitine antilichaam (muis) met 800 kanalen. Er is nog overgebleven signaal van het laatste antilichaam (α-synucleïne. Oranje pijl). F. Vijfde strippen en reprobing met CALB2 antilichaam (konijn) afgebeeld in 700 kanaal. Secundaire antilichamen waren: geit anti-muis 800cw, geit anti-konijn 680rd, geit anti-konijn 800cw, ezel anti-geit 800cw (zie Materials List). Lane labels: L - ladder, 1/260; - sample 1/2. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.- Plaats membraan (s) in een vierkant petrischaal dat ongeveer 30 ml Revitablot strippen buffer bevat en geïncubeerd 5-20 min bij kamertemperatuur onder constant roeren.
- Was het membraan (s) 3 keer in PBS opnieuw te scannen dan op de imager om volledige verwijdering van fluorescentie zorgen heeft voorgedaan - deze stap moet worden herhaald na elke strip.
- Incubeer membraan (s) voor een langere periode als fluorescentie blijft. Scan het membraan na elke strip om te bevestigen dat er geen secundaire signaal overgebleven.
OPMERKING: Membraan (s) alleen wordt verwijderd en opnieuw gesondeerd maximaal 3 keer om te waarborgen dat de integriteit van het membraan niet aangetast waardoor ongewenste hoge achtergrond verhouding signaal.
Representative Results
Als QFWB gevoeligheid en het lineaire detectiegebied groter dan conventionele ECL detectie, zijn er een aantal beperkende maatregelen die van cruciaal belang dat nauwkeurige gegevens verzameld zijn, waardoor doeltreffende interpretatie helpen. Enerzijds de opname van positieve controlemonsters zoals getoond in figuur 1. Ten tweede optimalisering overdracht gelijkwaardige verkeer van hoog en laag molecuulgewicht eiwitten garanderen van de gel naar het membraan als getoond in figuur 2. Ten derde optimalisatie van antilichamen, vooral secondaire antilichamen waarvan optimalisatie wordt vaak vergeten, maar die kan produceren niet-specifieke verbinden staat zijn te interfereren met de juiste interpretatie van eiwit (ten) van belang. Zie figuur 3. Vierde kan het ook zo dat wanneer een eiwit wordt detecteerbare maar zal aanwezig zijn, kan ook een secundair antilichaam daar kan worden gecorrigeerd door simpelweg met een secundair rais zijned in een andere soort gastheer. Zie figuur 4. Ten vijfde, totaal eiwit labeling en analyse is veel robuuster en kwantificeerbare wijze in vergelijking met het gebruik van traditionele enkel eiwit (en) die alomtegenwoordig tot expressie worden gebracht voor interne referentienormen 3. Veel van deze enkele eiwitten bleken verschillend tot expressie modellen van neurodegeneratieve ziekten en verschillende weefselmonsters en de uniformiteit van expressie binnen hetzelfde weefsel 3 wijzigen. Daarom zal de productie van een gel loading controle de uniformiteit van het monster lading te bevestigen wanneer samen met volledige eiwitanalyse door vergelijking met kwantificering van eiwit lading in elke laan op verschillende molecuulgewichten varieert afgemeten elk monster standaardfout geven zoals getoond in figuur 6 . Belangrijk al deze technieken en controles oplossen zijn zo effectief als de gevoeligheid en coherentie van de analyse tools door de operator (figuur 5) aangebracht. Tenslotte deze techniek leent zich strippen en opnieuw sonderen membranen flexibeler dan ECL door factoren waaronder maar niet beperkt tot verhoogde gevoeligheid, verlaagd achtergrond, bicolor detectie en membraan stabiliteit bij langdurige opslag. Zie Figuur 7.
Discussion
Inachtneming en planning essentieel voor experimenten en kan uiteindelijk het succes van de techniek bepaald. De vooruitgang in eiwitdetectie behulp WB kan een overvloed aan potentiële struikelblokken presenteren wanneer het proberen om te kiezen de juiste antilichamen, overdracht en visualisatie methoden te gebruiken. Gelukkig met een zorgvuldige checklist en geschikte voorzorgsmaatregelen QFWB routinematig worden gebruikt om de aanwezigheid eiwit en steeds subtiele verschillen tussen de expressie monsters te bepalen. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor fluorescerende kwantitatieve western blotting, evenals een paar strategieën voor probleemoplossing te voorkomen en / of te overwinnen enkele van de vele valkuilen die ermee verbonden zijn.
De kritische stappen gebruikt om de gevoeligheid te behouden en verkrijgen echt kwantificeerbare en vergelijkbare metingen omvatten: 1) uitgebreide eiwit extractie uit weefselmonsters; 2) voorbereiding van het monster; 3) nauwkeurige eiwit loading, bepaald door de totale hoeveelheid eiwit analyse; 4) een optimale overdracht van eiwitten met behulp van I-Blot; 5) de voorbereiding van de primaire en secundaire antilichamen in het blokkeren van buffer die 0,1% Tween 20, en 6) de juiste visualisatie en analyse met behulp van een infrarood imager en bijbehorende software.
Infrarood fluorescentiedetectie werkelijk kwantitatief en geeft grotere gevoeligheid tegenover traditionele ECL detectietechnieken 3,11. Dit detectiesysteem is met meerdere facetten, en als zodanig is niet beperkt tot QFWB. Dit systeem kan beeldvorming van immunohistochemisch etikettering gering vermogen zodat visualisatie en kwantificatie van hele weefselsecties 12. Dit is een gebied van potentiële toekomstige ontwikkeling in termen van resolutie, die veel rood imaging kon zien rivaliserende conventionele immunofluorescentie capturing met conventionele microscopen in termen van kwantitatieve beoordeling.
Echter, met een grotere gevoeligheid voor subtiele veranderingen in pProtein expressie is het cruciaal om de variabiliteit te garanderen wordt tot een minimum beperkt en beheersmaatregelen zijn strenger met robuuste protocollen. Dit begint met rigoureuze eiwit extractie uit het weefselmonster gevolgd door de productie van totaal eiwit gekleurde gels om zekerheid te verschaffen dat monster laden is uniform, optimalisatie van de primaire en secundaire antilichamen om te bepalen of de detectie is echt en het testen van de richtlijnen van de fabrikant met betrekking tot de over te dragen keer om een efficiënte eiwit overdracht te verkrijgen.
Maar zelfs wanneer de omstandigheden voor WB geoptimaliseerd, kan er nog problemen die gepaard gaan met westerns die niet volledig zijn hier onderzocht. Deze omvatten maar zijn niet beperkt tot factoren zoals eiwitten oplosbaar en keuze extractiebuffer. Sommige buffers kunnen verstoren eiwitconcentratie assays en sommige weefsels zijn bijzonder moeilijk te lossen, die robuuster technieken zoals het gebruik van geautomatiseerde Macerating verzegelde containers zoals M buizen samen met een Macs dissociator. Daarnaast kunnen eenvoudige controlemaatregelen voor opslag van geëxtraheerde en niet-geëxtraheerde materiaal bij -80 ° C het verschil tussen het verkrijgen optimale labeling onmiddellijk na extractie en hebben slechte resultaten weken later.
Moderne QFWB methoden zijn bewezen gevoeliger voor het vastleggen van subtiele verschillen in eiwit expressie te zijn en zijn veelzijdiger waardoor simultane dual labeling 3 in vergelijking met de oudere technieken zoals ECL. Het is essentieel dat western blotting protocollen zijn robuust en gemakkelijk herhaalbare voor nauwkeurige kwantificering en statistische analyse. Dit protocol is gevoelig en robuust genoeg om routinematig gebruikt voor de detectie van proteïnen in een verscheidenheid van verschillende weefselmonsters en soorten 3 en maakt kwantificering van hoge en lage abundantie proteïnen in dezelfde QFWB derhalve gebruik van verbruiksartikelen en tijd per experiment 1 verlagen. 1 Daarnaast is de verhoogde gevoeligheid van deze techniek maakt validatie van steeds populairder - sche studies 9,14 echter de nauwkeurigheid is van cruciaal belang en integratie van passende controlemaatregelen moeten worden nageleefd daardoor foutieve data-acquisitie vermijden.
Acknowledgments
We willen graag bedankt de volgende voor financiële steun: BBSRC Instituut Strategisch Programma Financiering - CF & TMW; BBSRC Oosten Bio DTP financiering - LG; De Darwin Trust van Edinburgh - MLH. We willen ook graag Dr Barry McColl bedanken voor toestemming om de TREM2 optimalisatie in dit manuscript bevatten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
| M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
| iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life Technologies, UK | IB401001 | |
| MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life Technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
| SeeBlue Pre-stained protein standard | Life Technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
| NuPAge LDS Sample buffer 4x | Life Technologies, UK | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x) | Life Technologies, UK | NP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life Technologies, UK | NP0322BOX | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
| Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
| Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
| IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
| IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
| IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
| ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
| iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
| InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
| Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |
References
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).
- Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).
- Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).
- Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
- Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).
- Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
- Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
- Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5 (10), 95 (2013).
- Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.
- Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
- Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).
- Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).
- Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
- Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).
