De molekylære mekanismene som koordinere dannelsen av hemmende gabaergic synapser under ontogeny er i stor grad ukjent. For å studere disse prosessene, har vi utviklet en ko-kulturmodellsystem som inkorporerer embryoniske medium spiny GABAergiske neuroner dyrket sammen med stabilt transfekterte humane embryoniske nyre 293 (HEK293 celler) som uttrykker funksjonell GABAA-reseptorer.
Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.
GABA er en av de tidligste neurotransmittere som finnes i den embryoniske hjernen, forut for den mest rikelig eksitatoriske nevrotransmitteren glutamat 1. Under utviklingen depolariserer GABA og begeistrer umodne nevroner, som spiller en nøkkelrolle i å regulere cellevekst, migrasjon og dannelsen av nevrale nettverk uten å indusere eksitotoksisitet. I den voksne hjernen reverse potensialet for GABA A reseptor-kanaler forskjøvet til mer negative potensialer på grunn av en reduksjon i den intracellulære konsentrasjonen av klorid. Denne forskyvning er forårsaket av opp-regulering av kalium-klorid ko-transportør (KCC2), som transporterer kloridet ut av cellen, og, i parallell, nedregulering av natrium-kalium-klorid transportør (NKCC1), som har motsatt effekt 2.
I hjernen, GABA binder hovedsakelig GABA til enten A- eller B-GABA-reseptorer til å mediere rask eller langsom synaptisk inhibering, respektivly. GABA A Rs er en klasse av reseptorer også kjent som heteropentameric ionotropiske eller ligand-gated Cys-sløyfe ionekanaler. To molekyler av GABA er nødvendig for aktivering av reseptoren, som er gjennomtrengelig for kloridioner og i mindre grad, bikarbonationer. Økningen i klorid ledningsevne reduserer effektiviteten depolariserende, eksitatoriske hendelser i aktivere den postsynaptiske nevron tre.
Strukturelle mangfold av GABA A Rs har lenge vært anerkjent som en viktig faktor i å bestemme deres brede spekter av funksjonelle og farmakologiske egenskaper. Native GABA A Rs er hetero-pentamerer sammensatt av underenheter med flere isoformer klassifisert som: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π og θ 3, med en felles transmembrane topologi som omfatter et stort N-terminale ekstracellulære domene, fire transmembrandomener (TMS), og en større intracellulære domenet mellom minner 3 og 4 4. Denβ3 og γ2 underenhetene er avgjørende for synaptisk hemming og organisme overlevelse, fordi mus med genetisk sletting av disse underenhetene dør etter fødselen 5,6. I motsetning til dette individuelle isoformer av α subenhet er viktige for funksjonen av spesifikke synaptiske forbindelser i hjernen som er assosiert med forskjellige virkemåter som angst, sedasjon, opphisselse, og andre, men er ikke, individuelt, essensielle for liv 7-9. GABA A Rs er de viktigste stedene i handling for en rekke legemidler med potent beroligende, hypnotisk, angstdempende og antiepileptiske effekter, som for eksempel benzodiazepiner, barbiturater, neurosteroider og bedøvelsesmidler 7,10,11.
Synaptic GABA A Rs typisk inneholde en γ2 subenhet, to β-subenheter (oftest β2 eller β3) og to α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 12,13. Den dominerende klasse av ekstra-synaptiske reseptorer inneholder δ subenheten i kombinasjonα med to subenheter (α4 eller α6), og to β subenheter (β2 eller β3 14). Subcellulære lokalisering av GABAA-Rs på aksonene, dendritter eller soma, og innsetting inn i plasmamembranen er avhengig av tilstedeværelsen av β-subenheter 15,16. Imidlertid selektiv innlemmelse av forskjellige GABA A R subtyper inn i forskjellige typer av synapser korrelerer godt med tilstedeværelse av spesifikke α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 7,17,18. Viktigere, sletting av α1 eller α2 subenheten i mus forårsaker ultra endringer på hemmende synapser 19. Dette tyder på at GABA A RS selv kan spille en direkte rolle i å regulere synapse formasjon.
Mye tyder på at GABAergic synapse utvikling er en nøyaktig koordinert hendelsesforløp, hvor både nevronale mål kontaktet av ulike typer hemmende axoner og reseptorene som er gruppert påhver klasse av hemmende synapse er selektive og funksjonelt tilpasset 17,20-22. Denne grunnleggende prinsippet om spesifisitet på gabaergic synapser reiser spørsmålet om hvordan de pre- og postsynaptiske partnere gjenkjenne hverandre under den innledende synaptiske kontakter.
In vitro-ko-kulturanalyser har blitt anvendt med hell for å studere enkelte av mekanismene for synapse for å teste formasjonen og rollen til de enkelte synaptiske spalten-dekkende proteiner i denne prosessen. En av de vanligste trans-synaptiske samhandlende protein kombinasjoner som fungerer begge veier for å megle synapse dannelse og modning, er Neurexins (Nrxns) og Neuroligins (NLS). Nrxns er presynaptiske proteiner som viser alternativ spleising innenfor sine laminin-neurexin-sex hormonbindende protein domener, som gir opphav til mange forskjellige isoformer 23. Mens Nrxns også samhandle med andre proteiner, er NLS antatt å være deres allestedsnærværende postsynaptiske partners 24. Sammen disse proteinene bidra til å holde de presynaptiske og postsynaptiske membraner i tett og stiv apposition 25. De to mest forekommende isoformer er NL-1 og NL-2 som er til stede ved eksitatoriske synapser og hemmende, henholdsvis 26.. En av de tidligste ko-kultur modellsystemer, som er utformet for å undersøke trans-synaptiske protein interaksjoner, som anvendes forskjellige typer av ikke-neuronale celler, oftest udødelige cellelinjer så som humane embryonale nyre (HEK) 293-celler, til å over-uttrykte NL- 2. Når disse celler ble dyrket med pontinske neuroner, ble en opphopning av presynaptiske proteiner i umiddelbar nærhet til overflaten av HEK-celler observert, noe som indikerer dannelse av synapse-lignende kontakter. Tilsetting av løselig β-neurexin til disse co-kulturer hemmet dannelsen av kontakter, noe som tyder på at trans-synaptiske interaksjoner mellom Nrxns og NLS er nødvendig for synaptisk kontakt dannelse 27. Videre forbigående uttrykkav β-neurexin i COS (C V-1 (Simian) i O rigin, og bærer S V40 genetisk materiale) celler co-dyrket med dissosiert hippocampus glutamaterg og gabaergic nevroner indusert uttrykk for den postsynaptiske protein gephryin og av GABA A R subenheter γ2 og α2 på kontaktpunkter mellom disse to celletyper 28. Et annet eksempel på en ko-kulturmodell som brukes for å studere dannelsen synapse involvert HEK293-celler transient transfektert med GABA A R underenheter α2 / β3 / γ2 og NL-2, og en blandet populasjon av nerveceller 29 hypothalamus. Denne studien konkluderte med at uttrykket av NL-2 er et absolutt krav for dannelsen av hemmende synapser.
Men i den siste co-kultur studie, stabilt transfektert α1 / β2 / γ2 GABA A Rs i HEK293 celler ble funnet å være tilstrekkelig til å indusere funksjonelle synapser ved samtidig dyrket med gabaergic MedIUM spiny nevroner, uten behov for ytterligere trans-synaptiske eller postsynaptiske adhesjonsproteiner. Imidlertid ble en fremtredende økning i synapse formasjon og styrke observert når NL-2 ble co-uttrykkes med GABA A Rs 30. Dette indikerer at denne ko-kultur modellsystemet har fordeler fremfor tidligere beskrevne modellsystemer, mest tydeligvis en øket følsomhet og pålitelighet av synaptisk kontakt deteksjon. To viktige faktorer som bidrar til den totale forbedring i detektering av synaptiske kontakter er: i) Bruk av stabilt transfekterte HEK293-cellelinjer med høy og stabil ekspresjon av GABA A R-underenheter på overflaten av de enkelte celler. Dette konsistens forenkler kvantitative sammenligninger mellom ulike co-kultur forhold. ii) For bruk av en ren befolkning på gabaergic medium spiny nevroner dyrket fra embryonale striatum 31 fjerner komplikasjoner og uklarheter som følge av bruk av blandede nevronale populasjoner og allows, for eksempel utvelgelse av de mest hensiktsmessige postsynaptiske GABA A R typer som kan sammenlignes med hverandre under dannelse synapse.
Dannelse av synapser er tenkt å involvere mange trans-synaptiske signaler i pre- og postsynaptiske celle adhesjon komplekser. På grunn av den to-veis natur synaptiske signalering og de rene tall av celleadhesjonsmolekyler, er det vanskelig å identifisere de viktigste komponentene som er involvert i synapse formasjon. Således transfektere en enkelt celle adhesjon protein inn i en ikke-neuronal celle (i dette tilfellet er de to mest utbredte postsynaptiske mål for GABAergiske neuroner medium pigg in vivo, α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) sterkt reduserer kompleksiteten av trans-synaptiske signaler som er tilgjengelige på den postsynaptiske overflate og tillater presis kvantitativ analyse av effekten av dette proteinet i å fremme synapse formasjon.
Selv om denne protokollen ikke er teknisk vanskelig å utføre, er det flere viktige skritt som må følges for å oppnå de mest nøyaktige og repeterbare co-kultur analyser. For det første må dyrkede medium pigg neuroner bli sådd ut ved en optimal tetthet. Hvis altfor tynt utsådd, neuroner har en tendens til å utvikle seg meget langsomt og overlevelse er sterkt redusert. På den annen side, hvis podet altfor tett, nerveceller har en tendens til å aggregere som kompromitterer analyse av kontakter med HEK293-celler. For det andre er det anbefalt å forbigående uttrykke et fluorescerende reporter, GFP eller mCherry i HEK293 celler som stabilt uttrykker GABA A Rs, før platting dem inn i co-kultur. Dette gir pålitelig anerkjennelse av HEK293 celler, som kan bli kompromittert av likhet i form og størrelse mellom disse cellene og sjeldne overlevende gliaceller celle i nevronale kulturer. For å oppnå effektiv transfeksjon med GFP eller mCherry cDNA, HEK293-cellelinjer har til å være i den eksponensielle vekstfase, ogutsådd på passende tetthet i 6-brønns plater. Sparse poding, etterfulgt av transfeksjon vil føre cellene til å vokse dårlig, mens over-seeding vil hindre cellene fra å ta opp den cDNA. Ideelt sett bør celler bli sådd ut slik at de er mellom 70-90% konfluent på dagen for transfeksjon. For det tredje må transfeksjon være optimalisert for hver cellelinje som brukes, som noen cellelinjer er mer følsom enn de andre. Dette er fordi konstitutiv GABA A R ekspresjon i HEK293-celler reduserer celleoverlevelse og evne til å gjenopprette celler etter transfeksjon. Videre overlevelse avhenger av typen av GABA A Rs uttrykt i HEK293-celler, med noen cellelinjer være betydelig mer følsom enn de andre. Transfeksjon hjelp liposomal reagens er en optimal metode for å uttrykke fremmede proteiner i raskt voksende cellelinjer, noe som gir både høy transfeksjonseffektivitet og nivå av uttrykk. Imidlertid, denne reagensen forårsaker for mye skade på langsomt voksende cellelinjer, ettersom vi jevnlig bruke en ikke-liposomal transfeksjon reagens. Dette fungerer på en lignende måte til den liposomale reagens, men den mengde DNA som er nødvendig for effektiv transfeksjon blir betydelig redusert. Dette tillater større celleoverlevelse (omtrent 80-90% sammenliknet med 60% ved hjelp av liposomal reagens), men med lavere transfeksjonseffektivitet (60%). Til slutt, / β2 / γ2 HEK293-celler som uttrykker tilsatt til neuronale kulturer må antallet styre HEK293 eller α1 å bli optimalisert. Legge for få celler kompromitterer vellykket analyse av kontakter mellom HEK293 celler og nevroner, fordi de blir svært sjelden. Motsatt, å legge for mange HEK293 celler fører nevroncelledød innen få timer.
Embryonale medium spiny nevroner kulturer bør ideelt sett være forberedt ved hjelp av striatale vev dissekert fra embryonale alder 15 – 17. Men ofte skjer det at embryoer er litt yngre eller eldre enn den optimale alder. I dette tilfellet, utsådd i kultur antall neuroner viltrenger å bli variert. Vev som er yngre enn E15 kan trenge å bli sådd ut ved en noe lavere densitet, mens vev som er eldre enn E17 kan trenge å bli sådd ut ved en høyere tetthet, for å tillate optimal celleoverlevelse. Videre kan cytosin-arabinosid (Ara-C) trenger å bli tilsatt til eldre kulturer for å hindre vekst av gliaceller, som er mer tallrike i eldre vev.
Ved oppretting av ko-kulturer, er det viktig å plate den optimaliserte antall transfektert HEK293 / eller α1 β2 / γ2 HEK293-celler som uttrykker, som nevnt ovenfor. Imidlertid kan det være nødvendig å fastslå dette for hvert enkelt cellelinje, på grunn av forskjeller i deres overlevelse. Typisk 30.000 celler i et maksimalt volum på 50 ul bør tilsettes til hver brønn i en 24-brønners skål, som allerede inneholder 500 ul av neuronal kulturmedium, da dette sikrer at det kondisjonerte medium ikke neuronal fortynnes for mye og at betingelsene innenfor hvert godt holde seg noenlunde konstant, f.eks </em> Konsentrasjonen av vekstfaktorer. Legge volumer større enn 50 ul til hver brønn vil generelt drepe neuroner.
En av de store ulemper ved den ko-kultur teknikk er at de neuronale kulturer blir opprettet fra dissosierte celler dyrket som et monolag, slik at nervecellene er blitt fjernet fra sin normale mikromiljø, og er ikke i stand til å etablere sine normale anatomiske organisasjon. Derfor mangler de riktige tilkoblingene, innganger og skilles molekyler fra andre celler som kan påvirke den innledende fasen av synapse utvikling. For eksempel in vivo mellompigg neuroner er tett innervated av glutamaterge innganger fra cortex, thalamus og andre hjerneregioner 34, men i våre neuronale kulturer glutamaterge synapser ikke danner fordi disse innganger er skadet under dissekering av det striatale vev. Hvordan fravær av funksjonelle glutamaterge synapser i dyrkede mellom spiny nevroner AFFekter sin evne til å danne gabaergic synapser med hverandre og / eller HEK293 celler uttrykker GABA A Rs fortsatt et åpent spørsmål. Dette spørsmålet kan lett løses ved å dyrke mellom spiny nevroner sammen med kortikale glutamaterge nevroner og dermed gi dem til å danne funksjonelle synapser 35 før tillegg av HEK293 celler. En alternativ fremgangsmåte ville være å utforme en ko-kultur modellsystem basert på organotypiske skive kulturer, som opprettholder noe av cytoarchitecture noe som kan være viktig for modning og synapse formasjon. Men organotypic skive kulturer har tett og heterogen neuropil som kan kompromittere analysen gjøres her. En annen viktig ulempe ved bruk av ko-kultur-assays, er at GABA A Rs uttrykt på overflaten av HEK293-celler ikke er gruppert som de er i nerveceller, selv om dette ikke synes å være nødvendig for dannelse synapse gitt en høy nok overflateekspresjon 30. For eksempel, i rodent hjernen og i hippocampale kulturer, blir α1 GABA A R-subenheten finnes i de fleste synapser på GABAergiske alle postsynaptiske domener av pyramideceller. Imidlertid er α2 spesifikt plassert i en undergruppe av synapser på somata og dendritter, men er sterkt anriket på axon innledende segment, slik det er åpenbart ved immunofluorescens og 36 elektronmikroskopi. Gitt at synapse dannelse i ko-kulturene kan likevel pålitelig kan detekteres og analyseres 30, tyder dette på at tettheten av GABA A Rs på celleoverflaten til HEK293-celler kan være lik, eller til og med høyere enn tettheten av disse reseptorer i synaptisk klynger i nerveceller. Dette kan forklare, i det minste delvis, hvorfor synaptiske adhesjonsproteiner, slik som neuroligin, og postsynaptiske tetthet proteiner, slik som gephyrin, ikke er nødvendig for dannelsen synapse i ko-kulturer, hvis hensiktsmessig montert GABA A Rs er til stede i tilstrekkelig tetthet.
Det er godt dokumentert at GABA A Rs er strukturelt og funksjonelt heterogent, og at reseptor-underenhet-preparat bestemmer deres subcellulære lokalisering og farmakologiske egenskaper. For eksempel er innlemmelse av de to underenheter kjent for å være en forutsetning for den synaptiske lokalisering av GABAA-Rs mens subenhet er til stede i nesten utelukkende extrasynaptic GABAA-Rs. Reseptorene som inneholder kun αβ kombinasjoner er også antatt å være hovedsakelig lokalisert til extrasynaptic domener 12- 14. Hvorvidt dette spesifisitet opprettholdes i vår co-kultur system kan lett testes ved forbigående transfeksjon 2 eller subenheten cDNAs inn HEK293 cellelinjer stabilt uttrykker α og β-subenheter, før du legger dem til nevronale kulturer. Våre preliminære forsøk under anvendelse av denne tilnærmingen har antydet at synaptiske kontakter er lett dannes bare i nærvær av 2-subenhet, noe som indikerer at den specificity observert in vivo er egnet til å bli bevart in vitro (data ikke vist).
Videre er GABA A Rs som inkorporerer forskjellige subenheter α selektivt lokalisert til synaptiske kontakter dannet med bestemte typer av presynaptiske nerveceller. For eksempel, i globus pallidus, de α1-GABA A Rs er generelt funnet at striatopallidal (str-GP) og palliopallidal (GP-synapser GP), som er plassert på dendritter og somatiske regioner av de mellompigg neuroner, respektivt. De α3-GABA A Rs er lokalisert i perisomatic regioner i mellom spiny nevroner og blir kontaktet av lokale GP axon collaterals, mens α2-GABA A Rs ligger på distale dendritter av disse nevronene og kontaktet primært av innspill fra striatum 32. Uttrykket av spesifikke α subenheter i ulike typer synapser og i ulike nevrale avdelinger er også påvist i andre hjerneområder som hippocampus 21 og neocortex 18,20. Disse funnene reiser spørsmålet med hensyn til hvordan de spesifikke hemmende synapser er dannet i hjernen. Har vedheft av en bestemt type presynaptiske terminalen indusere innsetting av spesifikke GABA A R subtyper i kontaktpunktene? Prøver reseptorene trafikkert til spesifikke subcellulære steder i henhold til deres sammensetning subenhet, hvor deres plasmamembranen innsetting er en forutsetning for adhesjonen av aksonale terminaler av spesifikk opprinnelse? Til dags dato, disse spørsmålene forblir ubesvart. Bruken av reduserte modellsystemer som co-kultur modellsystem, tillate oss å begynne å svare på dette komplekse spørsmål fordi systemet er lett mottakelig for transfeksjon av DNA-konstruksjoner og bruk av reagenser, og enda viktigere, er det egnet for live cell imaging analyse 30. Således, ved hjelp av dette modellsystem kan vi begynne å teste rollen av individuelle molekyler, inkludert forskjellige typer av GABA A-Rs, vetn for å være til stede på synaptiske kontakter. En annen fordel er at synapser i dette modellsystemet skjemaet raskt, i løpet av minutter til timer, reduserer varigheten av forsøkene. Ligner co-kultur modellsystemer ble vellykket ansatt i det siste for å screene for de nye synaptogenic molekyler 27,37,38.
Forstå hvordan sentralnervesystemet utvikler, modnes og danner forbindelser mellom nevroner så intrikat til kontroll, for eksempel, atferd eller kognisjon, er av fundamental betydning. Dette fjernt mål kan kun oppnås ved opptegning av molekylære mekanismer som styrer de enkelte trinnene i anerkjennelse og celle-til-celle kommunikasjon under utvikling. På grunn av kompleksiteten, kan de molekylære detaljene i disse flere cellulære interaksjoner i dag bli studert med presisjon bare i reduserte systemer. Imidlertid, evnen til å øke kompleksiteten i disse systemer ved å uttrykke flere kombinasjoner av proteiner, og studere hvordande samvirker har noen fordeler i sammenligning med, for eksempel genetiske delesjons tilnærminger. Dette er fordi den nøyaktig tolkning av virkningene av et enkelt gen delesjon er ofte svekket av endringer forbundet med kompenserende mekanismer maske virkningene av original lesjoner, spesielt i utviklingen av hjernen. Den enkle, men informative co-kultur teknikken beskrevet her har tillatt et funn av den strukturelle rolle GABA A Rs i synapse formasjon og åpnet en mulighet til å undersøke hvordan GABA A Rs og andre celleadhesjonsmolekyler og / eller synaptiske matriksproteiner samhandle med hverandre under synaptogenesis. Synaptiske matriksproteiner er av spesiell interesse gitt at de har nylig vist seg å spille en nøkkelrolle i glutamaterg synapse formasjon 39. Videreutvikling av samarbeidskultur modeller er viktige fordi de har potensial til å fremme vår kunnskap om de molekylære mekanismene som styrer 'normal &# 8217; hjernens utvikling og dermed øke vår forståelse av hvordan disse mekanismene er endret i mange nevrologiske sykdommer, som epilepsi, schizofreni, autisme og mange andre.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke økonomisk støtte fra MRC UK (G0800498). Vi ønsker også å takke professor JM Fritschy, University of Zurich, for å gi GABA A -R subenhet spesifikke γ2 antistoff og professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, for å gi pcDNA 3.1 (+) ekspresjonsvektorene inneholder antibiotikaresistens gener for fremstilling av stabilt transfekterte HEK293-cellelinjer.
Name | Company/Individual | Catalog Number | Comments |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum) | Life Technologies | 11960-044 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Danger: irritant |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10106-169 | |
Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
HBSS (10X) | Life Technologies | 14180-046 | |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | |
PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) | Life Technologies | V790-20 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) | Life Technologies | V860-20 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) | Life Technologies | V870-20 | |
Stable HEKα1β2γ2 line | Sanofi-Synthelabo, Paris | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1149 | |
G418 disulfate salt (Geneticin) | Sigma-Aldrich | G5013 | Danger: irritant |
Phleomycin D1 (Zeocin) | Life Technologies | R25001 | |
Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | Danger: toxic, irritant and corrosive |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant. |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
100 μm Nylon Cell Strainer | VWR | 734-0004 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C1768 | Danger: Irritant |
Chelating agent (Versene) | Life Technologies | 15040-033 | |
liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). | Life Technologies | 15338-100 | Alternative transfection method: Effectene Reagent |
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) | Qiagen | 301425 | |
Reduced serum medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 11058-021 | |
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 | Synaptic Systems | 105311C5 | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | |
Sodium Chloride (NaCl) | VWR | 27810.364 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G1726 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody | Prof. Jean Marc Fritschy | N/A | |
(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H. | |||
J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995). | |||
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody | Merck Millipore | MAB351 | |
Mouse anti-synapsin antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) | Merck Millipore | MAB341 | |
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody | Professor Anne Stephenson | N/A | |
(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172. | |||
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody | Merck Millipore | AP1085 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Merck Millipore | AP124S | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody | Life Technologies | A31553 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody | Life Technologies | A21422 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies | A11008 | |
Mounting reagent (Prolong Gold) | Life Technologies | P36930 | Use at room temperature |