एक उदाहरण के रूप में सिस्टिक फाइब्रोसिस वायु-मार्ग का उपयोग करना, पांडुलिपि पशु-जुड़े नमूनों में सूक्ष्म और वायरल समुदायों को चिह्नित करने के लिए metagenomic और metatranscriptomic दृष्टिकोण का एक संयोजन शामिल एक व्यापक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है।
उच्च throughput अनुक्रमण की पहुंच जीव विज्ञान के कई क्षेत्रों में क्रांति ला दी है। बेहतर मेजबान जुड़े वायरल और सूक्ष्म समुदायों को समझने के लिए, डीएनए और आरएनए निकासी के लिए एक व्यापक कार्यप्रवाह विकसित किया गया था। कार्यप्रवाह समवर्ती अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए एक भी नमूना से वायरल और माइक्रोबियल metagenomes, साथ ही metatranscriptomes, उत्पन्न करता है। इन तरीकों से युग्मन वर्गीकरण विशेषताओं और समुदाय इनकोडिंग कार्यों दोनों के एक सिंहावलोकन प्रदान करता है। यह असाधारण चिपचिपा है और mucins की उच्च राशि, नि: शुल्क न्युट्रोफिल डीएनए, और अन्य अज्ञात संदूषकों क्योंकि इसमें प्रस्तुत तरीकों, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) थूक, एक समस्याग्रस्त नमूना प्रकार का उपयोग करें। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल इन समस्याओं को निशाना बनाने और सफलतापूर्वक न्यूनतम मानव डीएनए संदूषण के साथ वायरल और माइक्रोबियल डीएनए की वसूली। Metagenomics पढ़ाई के पूरक हैं, एक metatranscriptomics प्रोटोकॉल दोनों माइक्रोबियल ठीक करने के लिए अनुकूलित किया गया थाअपेक्षाकृत कुछ ribosomal शाही सेना (rRNA) दृश्यों में शामिल है कि और मेजबान mRNA के। डेटा विशेषताओं का अवलोकन विधियों की सफलता का आकलन करने के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा करने के लिए प्रस्तुत किया है। अतिरिक्त CF थूक के नमूने भी (मैं) एक ही मरीज के भीतर लगातार सात दिनों के पार microbiome प्रोफाइल के संगति का मूल्यांकन, और (ii) एक 16S ribosomal शाही सेना जीन के आधार पर क्रमबद्ध करने के लिए metagenomic दृष्टिकोण की स्थिरता तुलना करने के लिए एकत्र किए गए थे। परिणाम एंटीबायोटिक गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल प्रोफाइल के दैनिक उतार-चढ़ाव कम से कम था और आम CF-जुड़े बैक्टीरिया का वर्गीकरण प्रोफाइल के hypotonic सेल (एच) व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न -16 rDNA पुस्तकालयों और metagenomes के बीच अत्यधिक इसी तरह के थे कि पता चला है। Hypotonic lysis और धोने कदम केवल मानव व्युत्पन्न डीएनए को दूर नहीं में लाभ का सुझाव है कि हालांकि, 16S rDNA वर्गीकरण प्रोफाइल के बीच मतभेद कुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए से उत्पन्न, लेकिन यह भी extracellul माइक्रोबियल व्युत्पन्नवास्तविक माइक्रोबियल प्रोफाइल को गलत ढंग से पेश हो सकता है कि गिरफ्तारी के डीएनए।
मानव शरीर के साथ जुड़े वायरल और सूक्ष्म समुदायों अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों 1,2 के आवेदन के माध्यम से पिछले एक दशक में बड़े पैमाने पर जांच की गई है। परिणामों मानव स्वास्थ्य और रोग में महत्व रोगाणुओं की मान्यता के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। बड़ी पहल मानव त्वचा पर रहने वाले बैक्टीरिया का वर्णन करता है कि मानव microbiome परियोजना (और कुछ आर्किया) से आया है, और मौखिक गुहा, एयरवेज, मूत्रजननांगी पथ, और जठरांत्र संबंधी मार्ग तीन के भीतर। ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) 4,5 और nasopharyngeal swabs के 4 के माध्यम से स्वस्थ मानव एयरवेज के आगे microbiome पढ़ाई फेफड़ों के एक पर्यावरण नमूना डिवाइस, वायुमार्ग में क्षणिक माइक्रोबियल उपनिवेशन में परिणाम के रूप में सेवा कर सकते हैं कि पता चला है। हालांकि, बिगड़ा airway के सतहों में माइक्रोबियल उपनिवेशवाद के प्रभाव ऐसे सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) रोगियों में देखा उन के रूप में गंभीर और पुरानी फेफड़ों में संक्रमण, करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
टी "> सीएफ सिस्टिक फाइब्रोसिस Transmembrane नियामक (CFTR) में उत्परिवर्तन जीन 6 की वजह से एक घातक आनुवांशिक बीमारी है। ये परिवर्तन बदले में उपकला के शिखर सतह भर में transepithelial आयन परिवहन प्रभावित करने वाले दोषपूर्ण CFTR प्रोटीन को जन्म दे। रोग को प्रभावित करता है कई अंग प्रणालियों, लेकिन मृत्यु दर और रुग्णता के बहुमत सीएफ फेफड़ों के रोग 7 के कारण है। सीएफ फेफड़ों माइक्रोबियल उपनिवेशन के लिए एक अद्वितीय पारिस्थितिकी तंत्र प्रदान करता है। आयन परिवहन में दोष एरोबिक से मिलकर microenvironments बनाने, सीएफ एयरवेज में बनाने के लिए बलगम का कारण बनता है एक स्थिर पोषक तत्वों से भरपूर mucosal सतह द्वारा लंगर microaerophilic, और anaerobic डिब्बों। इस माहौल वायरल, बैक्टीरिया, और कवक सहित बसाना और रोगाणुओं के प्रसार, सुविधा। तीव्र और जीर्ण फेफड़े माइक्रोबियल संक्रमण है, जिसके परिणामस्वरूप निरंतर लेकिन अप्रभावी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए नेतृत्व व्यापक airway के remodeling, फेफड़े क्षमता की हानि, और अंततः pulmoआम विफलता।सीएफ फेफड़ों के साथ जुड़े बैक्टीरियल समुदायों में अच्छी तरह से 16S ribosomal शाही सेना (rRNA) जीन अनुक्रमण 8 और बन्दूक metagenomics 9,10 का उपयोग शामिल है जो दोनों संस्कृति-निर्भर और संस्कृति स्वतंत्र दृष्टिकोण, का उपयोग करते हुए वर्णित किया गया है। -16 RRNA आधारित दृष्टिकोण माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत श्रृंखला की विशेषताएँ और सामुदायिक विविधता में व्यापक बदलाव के कब्जा करने के लिए सक्षम है। हालांकि, यह समुदायों को परिभाषित करने में अपने संकल्प में सीमित है (। Claesson एट अल 2010 में 11 संक्षेप) और चयापचय क्षमता की भविष्यवाणियों पहचान taxa के लिए जाना जाता है उन सामान्य कार्यों के लिए सीमित कर रहे हैं। इसलिए, -16 rRNA जीन अनुक्रमण विधियों सीएफ फेफड़ों में मौजूद विविध माइक्रोबियल समुदायों के आवश्यक वर्गीकरण और कार्यात्मक विश्लेषणात्मक सटीकता के लिए अपर्याप्त हैं। यहाँ वर्णित metagenomic दृष्टिकोण अपनी सीमाओं पर काबू पा, -16 rRNA आधारित दृष्टिकोण का पूरक है, और एक अपेक्षाकृत प्रभावी तरीके से सक्षम बनाता हैमाइक्रोबियल समुदाय वर्गीकरण और CF फेफड़ों में आनुवंशिक सामग्री दोनों का विश्लेषण करने के लिए।
पशु-जुड़े नमूनों से पृथक माइक्रोबियल डीएनए अक्सर मेजबान डीएनए की एक बड़ी राशि शामिल है। 14 – सीएफ थूक या फेफड़े के ऊतकों के नमूनों आमतौर पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में न्यूट्रोफिल द्वारा जारी मानव डीएनए की एक बड़ी राशि, कुल डीएनए 12 की अक्सर 99% से अधिक होते हैं। कुछ बरकरार मानव कोशिकाओं में उपस्थित हो सकता है, इस डीएनए के सबसे समाधान में मुफ्त या रोगाणुओं की सतह पर adsorbed है। इसके अलावा, असाधारण चिपचिपा बलगम प्लग, सेलुलर मलबे, और अन्य अज्ञात contaminants की उपस्थिति आगे माइक्रोबियल कोशिकाओं के अलगाव को मुश्किल। कई तरीकों चुनिंदा मानव डीएनए 16, और MolYsis किट, सीमित सफलता के साथ सभी नीचा करने के लिए ethidium ब्रोमाइड monoazide माइक्रोबियल कोशिकाओं 15 से अलग मानव, DNase मैं के साथ इलाज करने के लिए Percoll ढ़ाल सहित मानव डीएनए के इन नमूनों, घट के लिए परीक्षण किया गया। सीएफ थूक के लिए सबसे प्रभावी माइक्रोबियल डीएनए शोधन प्रक्रिया तारीख करने के लिए Breitenstein एट अल द्वारा वर्णित प्रक्रिया के एक संशोधन किया गया है। (1995) 17। इस के साथ साथ hypotonic सेल (एच) पद्धति के रूप में जाना जाता है यह दृष्टिकोण, mucin डाइसल्फ़ाइड बांड, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के hypotonic सेल, और घुलनशील डीएनए 9 की DNase मैं उपचार को कम करने के लिए β-mercaptoethanol के एक संयोजन का उपयोग करता है। विकल्प की कमी के बावजूद एच एल विधि (i) के लिए कुछ चिंताएं अवांछित रोगाणुओं की सेल और से उत्पन्न संभव पूर्वाग्रहों उठाया (द्वितीय) समुदाय रचना 9,10 में मनाया उतार चढ़ाव नमूना प्रसंस्करण के साथ जुड़े रूपों का एक artifact कर रहे हैं। बन्दूक metagenomes की पीढ़ी के अलावा, हम कुल डीएनए और लगातार सात दिनों में एक भी मरीज से एकत्र थूक के नमूने का एक ही सेट का उपयोग एच एल विधि से निकाला माइक्रोबियल डीएनए के -16 rRNA जीन प्रोफाइल के तुलना करके इन मुद्दों का समाधान।
माइक्रोबियल समुदायों की तुलना में ईएनटी ">, जानवरों के साथ जुड़े वायरल समुदायों के लक्षण वर्णन सीमित 18,19 है सीएफ एयरवेज में वायरल समुदायों केवल न्यूनतम 20 विशेषता किया गया है -।। 22 सीएफ एयरवेज में वायरल समुदायों के डीएनए निस्र्पक पहले metagenomic अध्ययन सीएफ फेफड़ों के साथ जुड़े सबसे वायरस फगेस 20 कर रहे हैं कि पता चला है। सीएफ और गैर-सीएफ व्यक्तियों में फेज की चयापचय क्षमता का काफी अलग था। विशेष रूप से, सीएफ व्यक्तियों में फेज समुदायों सीएफ एयरवेज के शरीर क्रिया विज्ञान के लिए जीवाणु मेजबान रूपांतरों को प्रतिबिंबित करता जीन किया जाता है, और CF फेफड़े के ऊतकों में वायरस के बैक्टीरियल विषैलापन 20। इसके बाद metagenomic पढ़ाई संरचनात्मक क्षेत्रों में 22 के बीच वायरल समुदायों के अलग स्थानिक विविधता का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, सीएफ फेफड़े के ऊतकों किसी भी पारिस्थितिकी तंत्र के 22 में तारीख करने के लिए मनाया सबसे कम वायरल विविधता harbored। पहचाना अधिकांश वायरस फगेस थेक्षमता के साथ सीएफ रोगज़नक़ों को संक्रमित करने के लिए। हालांकि, इस तरह herpesviruses, एडिनोवायरस, और मानव पैपिलोमा वायरस (एचपीवी) के रूप में यूकेरियोटिक वायरस भी पता चला रहे थे। फेफड़े के ऊतकों में अल्सर विच्छेदन के दौरान मनाया गया, जहां एक घटना में, एक मानव पेपिलोमा वायरस जीनोम के 99% से अधिक मरीज को एक फेफड़े पेपिलोमा या कार्सिनोमा निदान के साथ कभी नहीं किया गया था, भले ही बरामद किया गया था। इस वायरल विविधता मौजूद ऊतकों को नुकसान की गंभीरता को दर्शाता है, लेकिन यह भी बेनकाब और एक अंतर्निहित uncharacterized रोग समझा जा सकता है कि न केवल इंगित करता है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मोटी बलगम, मेजबान और माइक्रोबियल कोशिकाओं, मुक्त डीएनए, साथ ही सेल मलबे की बड़ी मात्रा से मिलकर बनता है कि नमूनों से वायरल की तरह कणों (VLPs) को अलग करने के लिए एक सरल, अभी तक शक्तिशाली तरीका प्रदान करते हैं।Metagenomics पूरक, metatranscriptomics माइक्रोबियल समुदाय और मेजबान 9,23 भर में जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता पर नजर रखने के लिए किया जाता है। इस मामले में, दोनों माइक्रोबियल और अस्पतालटी mRNA के अधिमान्यतया चुने जाने की जरूरत है। बैक्टीरियल mRNAs polyadenylated नहीं कर रहे हैं, एक oligo-डीटी आधारित mRNA के पुल से नीचे विधि का शोषण नहीं किया जा सकता। नमूने यूकेरियोटिक mRNA की बड़ी मात्रा में शामिल करने के लिए जाना जाता है अगर polyadenylation निर्भर आरएनए प्रवर्धन मेजबान जुड़े नमूनों में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। सीएफ थूक सहित कई पशु-जुड़े नमूने, RNases शामिल है कि उच्च सेलुलर मलबे की मात्रा और न्युक्लिअसिज़ के अलावा कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व होते हैं। इसलिए, एक और चुनौती भरा काम metatranscriptome प्रसंस्करण के दौरान व्यापक आरएनए गिरावट को रोकने के लिए है। ज्यादातर मामलों में, सीएफ थूक से निकाले कुल शाही सेना निकाली गई शाही सेना के बहाव के अनुप्रयोगों और उपयोगिता सीमित, आंशिक रूप से अपमानित है। हाल के वर्षों में, rRNA कमी के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में रूपांतरित किया। इन तरीकों की प्रभावकारिता हालांकि विशेष रूप से आंशिक रूप से अपमानित rRNA 9,24 के साथ काम करते हैं, तो सीमित है। यहां नियोजित तरीके की अनुमति देते हैंकुशल बहाव के कुल rRNA हटाने के लिए उपयुक्त आंशिक रूप से अपमानित कुल शाही सेना की बहाली के लिए एड। दो अलग-अलग किट की तुलना आंशिक रूप से अपमानित कुल शाही सेना से rRNA हटाने में दक्षता का प्रत्यक्ष तुलना लिम एट अल द्वारा सचित्र था। (2012) 9।
कुल मिलाकर, इस पांडुलिपि के लक्ष्य के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रेरित थूक का नमूना का उपयोग करते हुए, एक भी पशु-जुड़े नमूना से, प्रोटोकॉल का एक पूरा सेट वायरल और माइक्रोबियल बन्दूक metagenomes उत्पन्न करने के लिए (चित्रा 1), और एक metatranscriptome प्रदान करना है। आण्विक प्रयोगशाला कार्यप्रवाह पार संदूषण को कम से कम करने के लिए अलग से पहले और बाद प्रवर्धन क्षेत्रों को शामिल करना चाहिए। विधियों ऐसे ऊतक 22, nasopharyngeal और मुखग्रसनीय swabs के 25, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) और मूंगा (अप्रकाशित डेटा) के रूप में अन्य प्रकार नमूना करने के लिए आसानी से निभा रहे हैं। प्रत्येक नमूना संग्रह पर तुरंत कार्रवाई की है, खासकर जब माइक्रोबियल metagenomics और मुलाकात की जानी चाहिएatranscriptomics पढ़ाई वांछित हैं। नमूने जमे हुए थे, तो यह संभावित सेल अखंडता को बाधित ठंड के रूप में माइक्रोबियल metagenomes के लिए बरकरार माइक्रोबियल कोशिकाओं के अलगाव की सीमा। हालांकि, ठंड metatranscriptomics और वायरल अलगाव, लेकिन फ्रीज पिघलना प्रक्रिया के माध्यम से प्रभावित किया जा सकता बरामद वायरल कणों की शाही सेना की गुणवत्ता और मात्रा को रोकता नहीं है। ऐसा लगता है कि प्रेरित थूक बाल भी आक्रामक हो सकता है के रूप में वयस्क सीएफ रोगियों और अन्य पुरानी फेफड़े के रोगों 26,27 के साथ जुड़े कई अध्ययनों में नमूने के प्राथमिक स्रोत के रूप में कार्य किया है नोट करना महत्वपूर्ण है। हमारे अध्ययन में, थूक के नमूने माउथवॉश और एक न्यूनतम करने के थूक के नमूने के भीतर मौखिक रोगाणुओं संदूषण रखने के लिए बाँझ खारा समाधान का उपयोग मौखिक गुहा के rinsing के बाद एक सावधान और लगातार नमूने विधि, यानी, के साथ एकत्र किए गए थे।
वायरल metagenomics
वायरल कणों पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) वर्षा या छोटी मात्रा संकेंद्रक का उपयोग कर केंद्रित कर रहे हैं। कुछ मामलों में, एकाग्रता की जरूरत नहीं किया जा सकता है, लेकिन पूर्व छानने का काम या कम गति centrifugation कदम यूकेरियोटिक और माइक्रोबियल कोशिकाओं को हटाने के लिए किया जाता है। वायरल lysates आगे समृद्ध और घनत्व ढाल ultracentrifugation 9,41 या छोटे आकार फिल्टर (जैसे, 0.45 माइक्रोन) यूकेरियोटिक और बड़े माइक्रोबियल कोशिकाओं 25 हटाने के लिए। का उपयोग कर शुद्ध किया जाएगा घनत्व ढाल ultracentrifugation आम तौर पर इस तरह की अलग और वायरल कणों 41 ध्यान केंद्रित करने की सूक्रोज या सीज़ियम क्लोराइड के रूप में घने लेकिन अक्रिय समाधान के साथ किया जाता है। भौतिक जुदाई आकार और वायरल कणों की प्रसन्नचित्त घनत्व पर आधारित है। इसलिए, फिल्टर छेद के आकार का उचित विकल्प और ढ़ाल के कठोर तैयारी के भौतिक वसूली की सफलता के रूप में, विशिष्ट वायरल समुदायों को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक हैंVLPs 41 (निष्कर्षण घनत्व के भीतर फिल्टर या गिरने के माध्यम से पारित नहीं है कि यानी, वायरल कणों metagenome में पता नहीं होगा) पृथक समुदाय को निर्धारित करता है। वायरल अलगाव और एकाग्रता के बाद, मुक्त न्यूक्लिक एसिड और माइक्रोबियल और कोशिकाओं के रूप में दोनों नमूने में गैर वायरल जीनोमिक सामग्री मौजूद दूषित हो सकता है। इसलिए, यह नमूनों में वायरल कणों की पवित्रता (आंकड़े 1 ए और 1 बी) को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। एक क्लोरोफॉर्म उपचार आमतौर पर पूर्व न्यूक्लिक एसिड निकासी के लिए स्वतंत्र न्यूक्लिक एसिड नीचा करने के लिए nuclease उपचार के बाद शेष कोशिकाओं, lyse करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
प्रस्तुत कार्यप्रवाह के लिए एक चेतावनी है कि यह CSCL ढाल दर्ज करने के लिए भी प्रसन्नचित्त हो सकता है कि छा वायरल कणों बाहर कर सकते हैं के रूप में वायरल कणों को अलग करने के घनत्व ढाल जुदाई का उपयोग किया गया था। एक वैकल्पिक "पकड़ सभी" विधि घनत्व ढाल separ न आना हैसमझना 0.45 माइक्रोन से समुदाय डीएनए अलग और – क्लोरोफॉर्म और DNase मैं इस दृष्टिकोण के साथ इलाज किया filtrates ऐसे swabs या रक्त प्लाज्मा से उन के रूप में छोटा सा नमूना संस्करणों को समायोजित करने के लिए भी उपयुक्त है। हालांकि, इस क्लोरोफॉर्म प्रतिरोधी जीवाणु संक्रमण और DNase मैं प्रतिरोधी कोशिकी डीएनए के उच्च राशि में हो सकता है।
उच्च डीएनए पैदावार अनुक्रमण विकल्प की एक व्यापक विकल्प प्रदान करते हैं जिससे वर्तमान अनुक्रमण प्रोटोकॉल एक एनजी अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए न्यूक्लिक एसिड की माइक्रोग्राम प्रति एक करने की आवश्यकता है। उत्पन्न viromes के डीएनए एकाग्रता अक्सर 200 से अधिक एनजी / μl के लिए सीमा का पता लगाने के नीचे से चलता है। बरामद वायरल न्यूक्लिक एसिड की मात्रा प्रत्यक्ष अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी के लिए अपर्याप्त हो सकती है। ऐसे मामलों में, न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन आवश्यक है। Linker प्रवर्धन बन्दूक पुस्तकालयों (LASLs) 2,42,43 और कई विस्थापन प्रवर्धन (एमडीए) के आधार पर पूरे जीनोम प्रवर्धन दो हैंविधियों सबसे सामान्यतः अनुक्रमण के लिए पर्याप्त डीएनए उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। ऐसे Phi29 डीएनए पोलीमरेज़ के आधार पर उन के रूप में एमडीए के तरीकों प्रवर्धन पूर्वाग्रहों से ग्रस्त करने के लिए जाना जाता है, और अधिमान्यतया गैर मात्रात्मक वर्गीकरण और कार्यात्मक लक्षण वर्णन 44,45, जिसके परिणामस्वरूप ssDNA और परिपत्र डीएनए बढ़ाना हो सकता है। LASLs दृष्टिकोण के एक अनुकूलित संस्करण, केवल न्यूनतम पूर्वाग्रहों को पेश करने के लिए दिखाया (सामग्री शुरू की छोटी मात्रा के लिए) उच्च संवेदनशीलता को बढ़ावा देता है, और आसानी से अलग अनुक्रमण प्लेटफार्मों 43 के लिए अनुकूलित किया गया है। हालांकि, दृष्टिकोण, कई कदम है डीएनए नुकसान को कम करने के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता है, और dsDNA टेम्पलेट्स के लिए सीमित है। हमारी प्रयोगशाला में, इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक ब्रोन्कोएल्वियोलर lavage-, coral- और समुद्र के पानी व्युत्पन्न VLPs (अप्रकाशित और हुर्वित्ज़ एट अल। 46) से निकाले डीएनए का पता लगाने योग्य और undetectable राशि बढ़ाना करने के लिए अनुकूलित किया गया है।
डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों का विकास सीएलए हैssically कारण वायरल समुदायों के अत्यधिक विविध और बड़े पैमाने पर अज्ञात प्रकृति के वायरल metagenomics विश्लेषण के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक रहा। तारीख वर्तमान वायरल डेटाबेस के लिए जीवमंडल में एक अनुमान के अनुसार 10 8 वायरल जीनोटाइप, जबकि वहाँ इस अनुमानित कुल वायरल विविधता के बारे में 1/100000 है जो ~ 4000 वायरल जीनोम, होते हैं। इसलिए, वायरल metagenomes में वर्गीकरण और कार्यात्मक काम के लिए (जैसे कि बम विस्फोट 47) के रूप में समानता आधारित खोजों निहित चुनौतियों के पास है। कई दृश्यों डेटाबेस में जीनोम के लिए महत्वपूर्ण समानताएं हैं विफल करने के लिए, और इसलिए, अज्ञात के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। अनुरूपता आधारित खोजों वर्गीकरण बताए के लिए सबसे महत्वपूर्ण आवेदन कर रहे हैं और डेटा दृश्य के लिए कार्य करते हैं, भले ही डेटाबेस स्वतंत्र विश्लेषण के आधार पर वैकल्पिक तरीकों 48- 50 विकसित किया गया है। Fancello एट अल। 51 वीरा में इस्तेमाल किया कम्प्यूटेशनल उपकरण और एल्गोरिदम की एक पूरी समीक्षा प्रदानएल metagenomics।
माइक्रोबियल metagenomics
आमतौर पर, hypotonic सेल इलाज माइक्रोबियल समुदायों (एच एल-डीएनए) से निकाले डीएनए की कुल राशि 20 एनजी से 5 माइक्रोग्राम प्रति को लेकर। उपज रोगी के स्वास्थ्य की स्थिति और इस अध्ययन (तालिका 2) में निकाली एच एल-डीएनए की कुल पैदावार में देखा विविधताओं जो बताते एकत्र थूक का नमूना की राशि है, पर अत्यधिक निर्भर है। महत्वपूर्ण कदम। अच्छी गुणवत्ता के अनुक्रम डेटा उत्पन्न अनुक्रमण पुस्तकालयों की गुणवत्ता पर भरोसा उत्पन्न दो एक enzymatic आधारित डीएनए विखंडन प्रक्रिया का उपयोग कर सीएफ थूक व्युत्पन्न माइक्रोबियल डीएनए से उत्पन्न अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए एक विशिष्ट आकार सीमा से पता चलता है करने के लिए। इष्टतम पुस्तकालय आकार अनुक्रमण मंच और आवेदन की पसंद पर निर्भर है, और यदि आवश्यक हो तो इसलिए, विखंडन प्रक्रिया ऐसे sonication के और nebulization के रूप में वैकल्पिक तरीकों के माध्यम से, अनुकूलित किया जा सकता है। निम्न के अलावाप्रस्तुत प्रतिनिधि परिणाम, कई समय अंक भर में कई रोगियों से एकत्र सीएफ थूक पर प्रस्तुत विधि की सफलता भी (2012) 9। लिम एट अल में सचित्र है और लिम एट अल। (2014) 10।
पिछले अध्ययनों 9,10 हर मरीज के उतार-चढ़ाव की वजह से इस तरह की एंटीबायोटिक उपचार के रूप में perturbations की संभावना है, जबकि जिससे समुदाय के भीतर प्रमुख खिलाड़ियों के हठ को दर्शाती है, समय के साथ बदलाव कि माइक्रोबियल समुदाय का एक अनूठा सेट बंदरगाहों का सुझाव है कि। इन उतार-चढ़ाव भी बाहरी perturbations के बिना या के कारण नमूना प्रक्रिया और नमूना प्रसंस्करण के लिए दैनिक घटित चाहे, सवाल में अब भी है। एच एल-डीएनए metagenomic और 16S rDNA amplicon के विश्लेषण के आधार पर, 7 दिन अनुदैर्ध्य नमूना से पता चलता है कि एंटीबायोटिक गड़बड़ी के बिना माइक्रोबियल प्रोफाइल के दैनिक उतार-चढ़ाव (दिवस 1, 2, और 3) किया गया था कम से कम (आंकड़े 3 ए और 3 बी)। पहचान होने परएंटीबायोटिक सिप्रोफ्लोक्सासिन ऐसे पी के रूप में जाना बैक्टीरियल रोगज़नक़ों के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को लक्षित करता है जबकि मौखिक एंटीबायोटिक दवाओं के लिए duction तुरंत दिन 3 नमूने के बाद, समुदाय प्रोफ़ाइल में परिवर्तन दिवस 4. पर स्पष्ट हो गया aeruginosa, स्ताफ्य्लोकोच्चुस, और स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया, उपचार पी के रिश्तेदार बहुतायत में वृद्धि हुई aeruginosa स्ट्रैपटोकोकस एसपीपी कटौती करते हुए। और पी melaninogenica। 6 दिन तक, समुदाय धीरे धीरे प्रारंभिक प्रारंभिक समुदाय संरचना को बरामद किया। परिणाम एक भी मरीज के भीतर माइक्रोबियल प्रोफाइल के उतार-चढ़ाव की वजह से वायुमार्ग में समुदाय perturbations के अधिक होने की संभावना है कि सलाह देते हैं।
एच एल व्युत्पन्न डीएनए से 16S rDNA पुस्तकालयों और metagenomes की माइक्रोबियल प्रोफाइल के बीच स्थिरता को देखते हुए हम इस अध्ययन में इस्तेमाल -16 rRNA प्राइमरों से होने वाले पूर्वाग्रहों से इंकार। -16 RDNA वर्गीकरण भर में देखा मतभेद के लिए एक संभावित व्याख्याकुल डीएनए और एच एल व्युत्पन्न डीएनए (3B चित्रा) से उत्पन्न अल प्रोफाइल के स्यूडोमोनास एसपीपी की उच्च मात्रा की मौजूदगी हो सकती है। एंटीबायोटिक उपचार के बाद कोशिकी डीएनए। यह इन मतभेदों को 7 दिन में सबसे अधिक स्पष्ट किया गया है कि निष्कर्षों द्वारा समर्थित है, तीन दिन स्यूडोमोनास एसपीपी जो लक्ष्य एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार के बाद। दूसरों के अलावा। सिप्रोफ्लोक्सासिन सामान्यतः सीएफ और जीर्ण पी के साथ रोगियों में पहली लाइन उपचार के रूप में प्रयोग किया जाता है गतिविधि के अपने स्पेक्ट्रम सबसे CF-जुड़े रोगज़नक़ों शामिल हैं, भले ही aeruginosa संक्रमण। हम एंटीबायोटिक उपचार स्ट्रैपटोकोकस एसपीपी सहित अतिसंवेदनशील समुदायों eradicates धारणा है कि। और इसलिए प्रतिरोधी पी द्वारा भरा एक जगह बनाने aeruginosa। Pseudomonas aeruginosa अपने biofilm समुदायों में वृद्धि के माध्यम से प्रतिरोध फायदा मिल सकता है और बाह्य डीएनए इसके biofilm वास्तुकला 52 के मुख्य संरचनात्मक समर्थन होना दिखाया गया है। यहां तक कि टी के रूप मेंवह समुदाय संरचना कोशिकी डीएनए सीएफ थूक में बने रहे हो सकता है, बरामद किया। इसलिए, इन आंकड़ों hypotonic lysis और संभवतः केवल मानव व्युत्पन्न डीएनए को दूर नहीं में लाभ इस कार्यप्रवाह में प्रस्तुत धोने कदम है, लेकिन यह भी माइक्रोबियल व्युत्पन्न कोशिकी डीएनए वास्तविक माइक्रोबियल प्रोफाइल को गलत ढंग से पेश कर सकता है कि सुझाव है कि।
Metatranscriptomics
एक उच्च गुणवत्ता metatranscriptome अपेक्षाकृत कुछ ribosomal शाही सेना (rRNA) दृश्यों होते हैं और समुदाय के टेप (mRNA) के एक निष्पक्ष नमूने का प्रतिनिधित्व करना चाहिए। कारण mRNA की कम आधा जीवन और सीमित मात्रा में करने के लिए, यह प्रोटोकॉल, यहाँ प्रस्तुत के रूप में बरामद टेप की संख्या को अधिकतम करने के लिए नमूना हैंडलिंग कि कम से कम महत्वपूर्ण है।
हाल के वर्षों में, rRNA कमी के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट में रूपांतरित किया। ये MICROB समृद्ध, Ribo-शून्य, और नमूना विशिष्ट व्यकलित ज शामिलybridizations oligonucleotide संकरण, और एक 5 'मोनोफास्फेट युक्त exonuclease enzymatic गतिविधि को लक्षित शाही सेना पर आधारित है कि mRNA केवल किट के आधार पर कर रहे हैं कि 53। इसके अलावा, इस तरह के अधिमान्यतया रैखिक आरएनए polyadenylates और amplifies कि MessageAmp द्वितीय जीवाणु किट के रूप में mRNA के संवर्धन के लिए कई दृष्टिकोण भी उपलब्ध हैं। इन तरीकों (जैसे, mRNA के केवल, MICROB ई Xpress और MessageAmp) में से कुछ इष्टतम दक्षता के लिए समवर्ती उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों में से सभी की प्रभावकारिता, आंशिक रूप से अपमानित rRNA के साथ काम कर के रूप में अक्सर CF के नमूने से निकाले कुल शाही सेना में मनाया है, खासकर जब सीमित हैं। Polyadenylation निर्भर आरएनए प्रवर्धन दोनों यूकेरियोटिक और प्रोकार्योटिक mRNA की मिलकर metatranscriptomes उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, पाली (ए) पूंछ उपयोगी अनुक्रम डेटा की मात्रा को कम कर देता मई दृश्यों के लिए कहा। Homopolymer हिस्सों के साथ क्षेत्रों कम गुणवत्ता स्कोर है करने के लिए करते हैं जाएगा, गकी एक महत्वपूर्ण संख्या ausing पाली बंद trimming के बाद अनुक्रमण और बाद अनुक्रमण सॉफ्टवेयर, और औसत उपयोगी पढ़ें लंबाई से बाहर फ़िल्टर करने पढ़ता (ए) पूंछ काफी 54 से कम हो जाएगा।
जटिल सीएफ माइक्रोबियल समुदायों और आंशिक रूप से अपमानित शाही सेना (आंकड़े -4 ए और 4C) के साथ लेनदेन, हमारे पिछले अध्ययन Ribo-जीरो गोल्ड किट द्वारा संकरण कब्जा विधि का उपयोग गठबंधन उपचार की तुलना में मानव और माइक्रोबियल rRNA दोनों को दूर करने में अधिक प्रभावी था कि पता चला अन्य किट 9 (3 टेबल)। परिणामी डेटा मानव मेजबान और माइक्रोबियल टेप दोनों की समवर्ती विश्लेषण की अनुमति देता है। उपज और शाही सेना की गुणवत्ता, साथ ही अनुक्रमण मंच की अंतिम विकल्प पर निर्भर करता है, सीडीएनए संश्लेषण कदम सहित इन प्रक्रियाओं के कई अनुक्रमण पुस्तकालय पीढ़ी के साथ सुव्यवस्थित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Ribo-जीरो इलाज किया आरएनए metatranscriptome अनुक्रमण तुला बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैशिक्षा संस्थानों ScriptSeq आरएनए Seq पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर।
पशु-जुड़े समुदायों के Metagenomic विश्लेषण मेजबान और उसके संबंधित समुदायों में शामिल है कि समग्र कार्यात्मक इकाई के लिए एक व्यापक प्रतिनिधित्व प्रदान करता है। यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह विशेष रूप से वांछित वायरल और माइक्रोबियल के अलावा मोटी बलगम, सेल मलबे, कोशिकी डीएनए, प्रोटीन और ग्लाइकोप्रोटीन परिसरों की उच्च मात्रा है, साथ ही मेजबान कोशिकाओं होते हैं कि उन जटिल पशु-जुड़े नमूनों की एक किस्म के लिए अनुकूल है कणों। वायरल और माइक्रोबियल कणों हर कदम पर खो दिया जा सकता है, अलगाव और शुद्धि मेजबान डीएनए की मात्रा को कम करने के लिए आवश्यक हैं कणों। Metagenomics डेटा की जांच समुदायों के चयापचय क्षमता प्रदान करता है, इनकोडिंग कार्यों 9 के अंतर अभिव्यक्ति खुलासा करके इस पूरक metatranscriptomics। जीनोमिक्स और टेप डेटा की एक व्यापक मूल्यांकन नई आईएनएस झुकेंगेसमुदाय बातचीत की गतिशीलता के लिए ights और सुधार लाने के उपचारों 9,10,55 के विकास की सुविधा।
The authors have nothing to disclose.
यह काम वन Rohwer सम्मानित करने के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (1 R01 GM095384-01) द्वारा समर्थित किया गया। हम Ribo-जीरो महामारी विज्ञान किट के लिए जल्दी पहुँच प्रदान करने के लिए Epicentre, एक Illumina कंपनी धन्यवाद। हम ultracentrifugation ट्यूब धारक के डिजाइन और उत्पादन के लिए मार्क Hatay धन्यवाद। हम फिल्माने की प्रक्रिया की सहायता के लिए महत्वपूर्ण रीडिंग और पांडुलिपि के विचार विमर्श के लिए एंड्रियास हास और बेंजामिन नोल्स धन्यवाद, और लॉरेन पॉल।
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer | Life Technologies | 10296-028 | TRIzol LS Reagent was used in this study |
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm | Cole-Parmer | YO-36270-62 | Zirconia-Silicate Beads were used in this study |
Dithiothreitol Molecular Grade (Dry Powder) | Promega | V3155 | Can be purchased from any other company |
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane | Millipore | SLHV033RS | |
DNase I enzyme | Calbiochem | 260913 | |
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-13 | Diameter: 25mm |
Ultra-Clear Centrifuge Tubes | Beckman | 344059 | 9/16 X 3 ½ in. (14X90mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation |
SW41 Ti Rotor | Beckman | 333790 | |
SS-34 Fixed Angle Rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
Phi29 DNA polymerase | Monserate Biotech | 4001 | 10 U/µl |
Phi29 Random Hexamer | Thermo Scientific | S0181 | Previously bought from Fidelity Systems |
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size | FisherScientific | 09-926-34 | Whatman Anodisc Filter Membranes were used in this study; Diameter 25mm |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain | Life Technologies | S-11494 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
RNase-free DNase I | NEB | M0303S | Can be purchased from any other company |
Glycogen, RNA grade | FisherScientific | FERR0551 | Can be purchased from any other company |
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes | FisherScientific | 05-562-16B | For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor |
Total rRNA removal kit | Epicentre | MRZE724 | ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation |
Cesium chloride | FisherScientific | BP1595-500 | |
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H5882-100G |