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Biology

불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

일례로서 낭포 성 섬유증을기도하여, 원고는 동물 시료에서 관련 미생물 및 바이러스를 특성화하기 위해 커뮤니티 metagenomic metatranscriptomic 및 방법의 조합을 포함하는 포괄적 인 흐름을 나타낸다.

Abstract

높은 처리량 시퀀싱의 접근성은 생물학의 여러 분야를 혁명을 일으켰다. 더 나은 호스트 관련 바이러스와 미생물 군집을 이해하기 위해서는, DNA와 RNA 추출을위한 포괄적 인 워크 플로우를 개발 하였다. 플로 동시에 차세대 시퀀싱 단일 샘플로부터 바이러스 및 미생물 metagenomes뿐만 아니라 metatranscriptomes를 생성한다. 이러한 방식의 커플 링은 분류 학적 특성과 사회 인코딩 기능 모두의 개요를 제공합니다. 그것은 매우 점성과 점액의 높은 양, 무료 호중구 DNA 및 기타 알 수없는 오염 물질을 포함하고 있기 때문에 제시된 방법은, 낭포 성 섬유증 (CF) 가래, 문제 샘플 유형을 사용합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이러한 문제를 대상으로 성공적 최소 인간 DNA의 오염 미생물 및 바이러스 성 DNA를 회수. 메타 지노믹스 연구를 보완하기 위해, metatranscriptomics 프로토콜은 모두 미생물을 복구하기 위해 최적화 된상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 호스트의 mRNA. 데이터 특성의 개요는 방법의 성공 여부를 평가하기위한 기준으로서 역할을 제시한다. 추가 CF 객담 샘플은 (i) 단일의 환자 내에서 연속 7 일에 걸쳐 마이크로 바이 프로파일의 일관성을 평가하고, (ⅱ) 16S 리보솜 RNA 유전자 기반 시퀀싱 metagenomic 방법의 일관성을 비교하기 위해 수집 하였다. 결과는 항생제 교란하지 않고 미생물의 프로필 매일 변동이 최소이고 일반적인 CF-관련된 박테리아의 분류 프로파일 저장성 용해 (HL) 유래 DNA로부터 생성 된 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes 사이에 매우 유사한 것으로 나타났다. 저장성 용해 및 세척 단계는 오직 인간 유래 DNA를 제거하지 시킨다는 이점이 제안하지만, 16S rDNA 염기 분류 학적 프로파일 간의 차이가 전체 DNA 및 HL 유래 DNA로부터 생성뿐만 아니라 extracellul을 미생물 유래실제 미생물 프로파일을 잘못 할 수있다 아칸소 DNA.

Introduction

인체와 관련된 바이러스 및 미생물 군집은 1,2- 시퀀싱 기술의 적용을 통해 지난 10 년간 광범위하게 연구되었다. 결과는 인간의 건강과 질병의 중요성 미생물의 인식으로 이어졌다. 주요 사업은 인간의 피부에있는 세균을 설명하는 인간 마이크로 바이 옴 프로젝트 (일부 고세균)에서 온, 구강 충치,기도, 비뇨 기관, 위장관 3 내. 기관지 폐포 세척액 (BAL) 4,5 인두 면봉 4을 통해 건강한 사람의기도의 또 마이크로 바이 옴의 연구는 폐 환경 샘플링 장치,기도에 과도 미생물 식민지의 결과로 역할을 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 장애인기도 표면의 미생물 식민지의 영향은 낭포 성 섬유증 (CF) 환자에서 본 것과 같은 심각한 만성 폐 감염으로 이어질 수 있습니다.

t는 "> CF는 낭포 성 섬유증 막 횡단 레귤레이터 (CFTR)의 돌연변이 유전자 (6)에 의한 치명적인 유전 질환이다. 이러한 돌연변이가 차례로 상피 세포의 꼭대기의 표면을 가로 질러 transepithelial 이온 수송에 영향을 미치는 결함이있는 CFTR 단백질에 상승을 제공합니다.이 질환에 영향을 미칩니다 여러 기관 시스템,하지만 사망률과 이환율의 대부분은 CF 폐 질환 (7) 때문이다. CF 폐 미생물 식민지의 고유 한 생태계를 제공한다. 이온 수송에 결함이 호기성으로 구성된 미세 환경을 생성, CF기도에 구축하는 점액의 원인 정적 영양이 풍부한 점막 표면에 의해 고정 호기성 및 혐기성 구획.이 환경은 바이러스, 박테리아, 곰팡이를 포함한 식민지 미생물의 증식을 촉진한다. 급성 및 만성 폐 미생물 감염의 결과로 일정하지만 효과가 면역 반응으로 이어질 광범위한기도 개형, 폐 용량 감소, 궁극적 pulmo어림 실패.

CF 폐와 관련된 세균 지역 사회는 물론 16S 리보솜 RNA (rRNA 유전자) 유전자 염기 서열 8 산탄 총 메타 지노믹스 (9, 10)를 사용하여 포함 모두 문화에 의존하는 문화 독립적 인 접근 방식을 사용하여 설명 하였다. 16S rRNA의 중심 접근법은 미생물 종의 다양한 특징 및 커뮤니티 다양성 넓은 변화를 포착 할 수있다. 그러나, 지역 사회를 정의의 해상도로 제한된다. (Claesson 등 2010 년 11 요약) 및 신진 대사에 영향을 미치는 잠재력의 예측은 확인 된 분류군에 대한 공지 된 일반적인 기능으로 제한됩니다. 따라서, 16​​S rRNA의 유전자 시퀀싱 방법은 CF 폐에 존재하는 다양한 미생물 지역 사회의 필요 분류 학적 및 기능적 분석의 정확성에 대한 불충분하다. 여기에 설명 metagenomic 접근은 그 한계를 극복, 16S rRNA 유전자 기반 접근법을 보완하고, 상대적으로 효율적인 방법을 가능하게미생물 군집의 분류 및 CF 폐 유전 적 내용을 모두 분석합니다.

동물 샘플들로부터 격리 관련된 미생물 DNA는 종종 숙주 DNA를 다량 포함. 14 - CF 객담 또는 폐 조직 샘플은 일반적으로 면역 반응에 의해 방출 인간 호중구 DNA 다량의 DNA (12)의 총 종종 99 % 초과를 함유한다. 일부 본래 인간 세포가 존재하더라도,이 DNA 용액의 대부분은 무료 또는 미생물의 표면에 흡착된다. 또한, 매우 점성 점액 플러그, 세포 잔해 및 다른 오염 물질이 미지의 존재는 상기 균체 분리 복잡. 여러 가지 방법을 선택적으로 인간의 DNA (16), 및 MolYsis 키트, 제한적인 성공에 모든 저하 에티 디움 브로마이드 모노 아자 미생물 균체 (15)에서 분리 된 인간의 DNase I 치료에 퍼콜 그라디언트를 포함하여 인간 DNA의 이러한 샘플을 파괴 시험 하였다. CF 객담에 가장 효과적인 미생물 DNA 정제 과정을 최신 것은 Breitenstein 등에 의해 기술 된 방법의 변형이었다. (1995) 17. 본원 저장성 용해 (HL)로 알려진 방법이 방법은, 점액 이황화 결합, 진핵 세포의 저장성 용해하고, 수용성 DNA의 DNase I (9)의 처리를 줄이기 위해 β 머 캅토 에탄올의 조합을 사용한다. 대안의 부족에도 불구하고 HL 방법으로 인해 (I)에 대한 몇 가지 우려 원치 않는 미생물의 분해 및 화상으로 인한 가능한 편견을 제기 (II) 지역 사회 조성 (9, 10)의 관찰 변동이 샘플 가공과 관련이 변화의 이슈인지. 샷건 metagenomes의 생성 외에, 우리는 전체 DNA 및 연속 7 일에 걸쳐 단일 환자로부터 수집 객담 샘플들의 동일한 세트를 사용하여 HL 방법에서 추출 미생물 DNA의 16S rRNA 유전자 프로파일을 비교함으로써, 이러한 문제를 해결한다.

미생물 군집에 비해 ENT는 ">, 동물과 관련된 바이러스 성 지역 사회의 특성은 제한 (18, 19)이다 CF기도의 바이러스 성 사회는 최소한 20 특성화되었다 -.. 22 CF기도의 바이러스 성 지역 사회의 DNA를 특징 짓는 첫 번째 metagenomic 연구 CF 폐와 관련된 대부분의 바이러스는 파지 20 있음을 보여 주었다. CF와 비 CF 개인의 파지의 대사 가능성이 크게 달랐다. 특히, CF 개인의 파지 사회가 CF기도의 생리에 박테리아 숙주 적응의 반사 유전자를 실시, 및 CF 폐 조직에서 바이러스의 세균 독성 (20). 이후 metagenomic 연구는 해부학 적 영역 (22) 사이의 바이러스 성 지역 사회의 고유 한 공간 이질성을 보여 주었다. 또한, CF 폐 조직은 어떤 생태계 22 일에 관찰 된 가장 낮은 바이러스 성 다양성을 숨겨. 확인 된 대부분의 바이러스는 파지했다가능성 CF 병원균에 감염. 그러나, 헤르페스 바이러스, 아데노 바이러스, 인간 유두종 바이러스 (HPV)와 같은 진핵 세포 바이러스도 검출되었다. 폐 조직에 낭종 해부 동안 관찰 한 경우에서는, 인간 유두종 바이러스 게놈의 99 % 이상이 환자는 폐 암 또는 유두종으로 진단되지 않았다하더라도, 회수 하였다. 이것은 바이러스 다이버 시티는 본 조직 손상의 정도를 반영 할뿐만 아니라 노출 및 하부지지 않은 질환을 설명 할 수있을뿐만 아니라 것을 나타낸다. 여기에 설명 된 프로토콜은 두꺼운 점액, 호스트와 균체, 자유 DNA뿐만 아니라 세포 파편 다량으로 구성 샘플로부터 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)를 분리하기 간단하지만 강력한 방법을 제공한다.

메타 지노믹스 보완, metatranscriptomics는 미생물 지역 사회와 호스트 9,23에서 유전자 발현의 역학을 모니터링하는 데 사용됩니다. 이 경우, 모두 미생물 및 호t mRNA를 우선적으로 선택해야합니다. 세균의 mRNA가 폴리아 데 닐화되지 않기 때문에, 올리고 dT를 기반 mRNA의 풀다운 방법으로 악용 할 수 없습니다. 샘플 진핵 mRNA를 다량 함유하는 것으로 알려진 경우, 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 호스트 관련된 샘플에서 사용될 수 없다. CF 객담 포함한 많은 동물 연관된 샘플은, RNases 포함 높은 세포 파편의 양 및 클레아 외에도 세포의 높은 농도를 포함한다. 따라서, 또 다른 도전 과제는 metatranscriptome 처리 중에 광범위한 RNA 분해를 방지하는 것이다. 대부분의 경우에, CF 객담에서 추출한 총 RNA는 RNA 유래의 하류 어플리케이션 및 유틸리티를 제한 부분적으로 저하된다. 최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이러한 방법의 효능은 그러나 특히 부분적으로 저하 rRNA의 9,24 작업을 할 때, 제한된다. 여기에 사용 된 방법은 허용효율적인 하류 총 rRNA의 제거에 적합 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA의 검색을 위해 에디션. 두 개의 서로 다른 키트를 비교 부분적으로 성능이 저하 된 총 RNA에서 rRNA 유전자 제거의 효율을 직접 비교는 임 등의 알에 의해 설명되었다. (2012) 9.

전반적으로,이 원고의 목적은 예를 들어 객담 샘플을 사용하여, 하나의 동물 연관된 샘플로부터의 프로토콜 세트 바이러스 및 미생물 샷건 metagenomes를 생성한다 (도 1), 및 metatranscriptome를 제공하는 것이다. 분자 실험실 워크 플로는 교차 오염을 최소화하기 위해 별도의 사전 및 사후 증폭 영역을 포함해야한다. 방법은 조직 (22), 인두 및 구강 인두 면봉 (25), 기관지 폐포 세척액 (BAL)와 산호 (게시되지 않은 데이터)와 같은 다른 종류의 시료에 쉽게 적응할 수 있습니다. 각 샘플 수령시 즉시 처리, 특히 미생물 메타 지노믹스와 만족하여야한다atranscriptomics 연구가 요구된다. 샘플을 동결하면 잠재적 셀 무결성을 방해로 동결 metagenomes 속담 미생물 균체의 분리를 제한한다. 그러나, 동결 metatranscriptomics과 바이러스 분리되지만, 동결 - 해동 과정을 통해 영향을받을 수있는 회수 된 바이러스 입자의 RNA의 질과 양을 배제하지 않는다. 그것은 그 객담이 BAL이 너무 침입 할 수있는 성인 CF 환자와 만성 폐 질환 (26, 27)과 관련된 많은 연구에서 샘플의 기본 소스 역임했다 주목하는 것이 중요하다. 우리의 연구에서, 객담 샘플을 구강 및 최소 객담 내 구강 미생물 오염을 유지하는 멸균 생리 식염수를 사용하여 구강 헹굼 다음 신중하고 일관된 샘플링 방법, 즉, 함께 수집 하였다.

Protocol

참고 : 유도 객담 샘플은 캘리포니아, 샌디에고 대학의 연구 코디네이터 (UCSD에 의해, 캘리포니아 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학 (HRPP 081500)와 샌디에고 주립 대학의 임상 시험 심사위원회 (2121 SDSU IRB 번호)에 따라 수집 ) 성인 CF 클리닉.

1. 샘플 수집 및 사전 처리 (수집 후 30 분 이내에 사전 치료 샘플)

  1. 앞서 샘플링 할 컬렉션, 라벨 네 15ml의 튜브의 (ⅰ) 바이러스 metagenome, (ⅱ) 미생물 metagenome, (ⅲ) metatranscriptome, 및 (ⅳ) 엑스트라 객담. 각 샘플에 대해 반복합니다. 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 기반의 RNA 용해 버퍼 (GITC-용해 버퍼)의 6 ml의 뒤에 "Metatranscriptome"라는 레이블이 붙은 튜브로 0.1 mm의 실리카 비드의 2 ML을 추가합니다.
  2. 시료를 수집하는 동안 구강 세균에 의한 오염을 최소화하기 위해 구강 세정액 등의 멸균 식염수 용액 (60 ml)로 사용한다. 이후 30 분 동안의 기간에 걸쳐 객담 샘플을 수집분무기를 통해 7 % 고장 성 식염수를 4 ml의 흡입. 프로세스는 즉시 시료로는 후술.
  3. 8 ml의 총 부피로 샘플을 희석.
    1. 전 시료 채취 후 빈 가래 컵의 무게에 의해 샘플 크기를 예측합니다.
    2. 샘플의 부피가 8 미만 ml의 경우, 적어도 8 ml의 총 샘플 부피를 생성하기 위해 0.02 μm의 필터 1X PBS 적절한 양을 첨가하는 것이 바람직하다.
    3. 눈에 보이는 덩어리가 객담 내에 남아 있지 않을 때까지 즉시 3 ML의 주사기로 시료를 균질화
    4. 가래 2 ㎖를 작성하여 1.4 단계로 바로 진행, 같은 주사기를 사용.
  4. 객담 샘플에서 총 RNA를 보존
    1. 실리카 비드 및 GITC - 용해 버퍼를 포함하는 "metatranscriptome"튜브에 단계 1.3.4 2 ml의 객담 샘플을 주입한다.
    2. 뚜껑을 닫고 누설을 방지하기 위해 파라 필름으로 안전하게 튜브를 밀봉.
    3. 10 마일에 대한 중간 속도 즉시 가래를 균질화N. 사용할 수있는 vortexer를에 따라 수평으로 튜브를 배치하고 필요한 경우 테이프로 고정합니다.
    4. 필요한 경우 실험실에 얼음 상자와 교통편 4 ° C에서 또는에서 튜브를 유지합니다.
  5. 같은 주사기, 나누어지는 "바이러스 성 metagenome"과 "미생물 metagenome"과 "추가 가래"로 표시된 튜브에 가래 컵에서 나머지 가래를 전송 레이블 튜브에 가래 2 ㎖를 각각 사용.
  6. 필요한 경우 실험실로 4 ° C의 또는 얼음 상자와 교통의 모든 튜브를 저장합니다.

2. 생성 바이러스 성 Metagenome

  1. 버퍼 및 솔루션의 준비
    1. 4 ° C에서 사전 및 저장소의 50 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 준비합니다. 이 2 주 동안 안정하다.
    2. 식염수 마그네슘 (SM) 버퍼 (250 ml)을 준비 : 1 M의 NaCl, 10 mM의 황산, 50 mM 트리스 - 염산을; 7.4 산도를 조정합니다. 실온에서 소독 필터 (0.02 ㎛의 공극 크기)에 저장. I Dornase 단위 / mg의 건조 중량에 의해 정의 된 활동에 따라 동결 건조 소 췌장의 DNase에서 (분자 수준의 물) 나는 100 U / μL로 효소의 DNase를 준비합니다.
    3. 완충액 I 10 배의 DNase (50 ㎖)을 준비 : 100 mM의의 MgCl 2, 20mM의 ​​염화칼슘 2; 6.5 산도를 조정합니다. 실온에서 소독 필터 (0.02 ㎛의 공극 크기)에 저장.
    4. 4 % 파라 포름 알데히드를 준비합니다.
    5. 200X TE 버퍼를 준비 : 2 M 트리스 - 염산 (PH 8.5), 0.2 M EDTA를. 실온에서 소독 필터 (0.02 ㎛의 공극 크기)에 저장.
    6. 분자 수준의 물을 사용하여 10 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 10 ㎖를 준비한다.
    7. 분자 수준의 물을 사용하여 50 ㎖ CTAB / 염화나트륨 (10 % CTAB. 700 mM의 NaCl을)를 준비합니다. CTAB에게 밤새 녹여. 침전물이 계속되면, 65 ° C에서 솔루션을 가열한다. 용액을 실온에서 고점도이다.
      주 : 0.02 μm의 필터를 사용하여 버퍼 여과 액내 바이러스 - 유사 입자의 제거를 허용 아니지만자유 핵산 오염.
  2. 샘플 전처리
    1. 신선한 6.5 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 적당량을 준비한다.
    2. 6 ml의 총 부피를 생성하기 위해 필터링 된 0.02 ㎛의 SM 완충액을 첨가하여 균질 희석.
    3. 샘플 6.5 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 같은 부피 (6 ml)에 추가, 점액 용해에 도움, 소용돌이 적극적으로 혼합하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다.
    4. 소용돌이 10 ° C에서 치료를 적극적으로 시료와 스핀, 15 ~ 20 분 동안 3,056 XG.
    5. 새로운 15 ML 튜브에 뜨는을 수집합니다.
    6. 단계를 반복 2.2.3과 다음 샘플 2.2.5.
    7. 이전 및 새로운 15ml의 튜브 내로 주사기에 장착 0.45 μm의 필터로 상청액을 필터.
      참고 : 필터 막힘, 주사기에서 샘플을 검색하고 여과 단계를 생략합니다.
    8. 참조 (0.45 μm의 필터 샘플의 100 μL의 표본을 가지고 클로로포름의 DNase I 처리를 수행 그 자체ction의 2.3.12-2.3.15) 등) 표면 형광 현미경 (그림 2A에 대한 샘플을 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    9. "캐치 모든"바이러스 입자 농축 방법은 (토론 참조), 세슘, 염화 구배 초 원심을 기반으로 바이러스 입자 선택을 생략 할 2.3.12 단계로 이동합니다. 그러나,이 클로로포름 내성 세균 오염과 바이러스 해물 호스트 DNA의 양이 더 발생할 수 있습니다.
  3. 바이러스 - 유사 입자 (VLP를) 농축 및 정제
    1. 원하는 농도로 비 여과 SM 완충액 CsCl과 적당량 용해시켜 개별 염화 세슘 (CsCl과) 용액을 준비 (1.7 g / ml의 1.5 g / ㎖, 1.35 g / ㎖, 1.2 g / ㎖). 사용하기 전에 0.02 μm의 필터를 통해 각각의 솔루션을 필터링합니다.
    2. 도 2b에 도시 한 바와 같이, 웹 기반 협동 학습 그라데이션을 설정합니다.
    3. 로드 1ml의 1.7 g / ml의 각 튜브, 하중 1.5 1 ㎖로 g / ml의 각 튜브,로드 1ml를 1.35 g으로각각의 튜브에 / ㎖, (선택 사항) 각 튜브에 부하 1.2 g / ㎖, 그리고 마지막으로 각각의 튜브에 6-8 ml의 샘플을로드합니다. 마크 각 층은 각 분획의 위치를​​ 나타 내기 위해.
    4. 1 mg의 내부에 튜브의 각 반대 쌍의 균형을.
    5. 조심스럽게 스핀 양동이에 각 튜브를로드합니다. 비어있는 경우에도 모든 버킷 스핀. 회 전자에 스핀 양동이를로드합니다.
    6. 2 시간 4 ° C에서 82,844 XG에 원심 분리기.
    7. 원심 분리 후, 조심스럽게 밀도 구배를 방해하지 않고 홀더에서 튜브를 제거합니다.
    8. 18 G 바늘 3 ML의 주사기를 사용하여, 단지 1.5 g / ml의 밀도 층 아래 (그림 2, 빨간색 화살표) 튜브를 관통하고 주사기에 1.5 ~ ㎖를 당깁니다.
    9. 천천히 바늘을 제거하고, 나머지 튜브에서 분획 천자를 통해 새로운 15ml를 튜브에 적하시킴으로써 상부 분획을 수집한다. "상단 부분 폐기물"로이 레이블.
    10. 1.5 g / ㎖ fractio 수집N 개의 새로운 미세 원심 분리 튜브에 내용물을 토출하여 주사기로부터 (VLPs를 함유).
    11. 모든 샘플 단계를 반복 2.3.8-2.3.10.
    12. , 바이러스 농축에 클로로포름의 0.2 볼륨을 추가 흔들어, 5 분 최대 속도로 10 분, 스핀 RT에서 부화, 수성 단계를 수집합니다.
    13. 클로로포름 처리 바이러스 농축에 10 배의 DNase 버퍼와의 DNase I (최종 농도 = 2.5 U / μL)를 추가하고, 1.5 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
    14. 15 분 동안 65 ° C에서 DNase의 활성을 비활성화한다.
    15. 새로운 튜브에 클로로포름 -과의 DNase I-처리 바이러스 부분의 15 μl를 제거하고 표면 형광 현미경 샘플을 해결하기 위해 15 μL 4 % 파라 포름 알데히드를 추가합니다.
  4. DNA 추출
    1. 세척 및 멸균 50 ㎖ 오크 리지 초고속 원심 튜브에 각 샘플로부터 바이러스 농축 풀.
    2. 의 1 ㎖ 당 10 μl의 0.5 M EDTA 0.1 볼륨 200X TE 버퍼 다음 추가충분한, 포름 아미드의 1 부피, 10 μL의 글리코겐. 잘 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양한다.
    3. 새 볼륨 사용, 상온 100 % 에탄올 2 볼륨을 추가합니다. 잘 혼합하고 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 품어.
    4. SS-34 로터를 사용하여 4 ℃에서 20 분 동안 17,226 XG에서 튜브를 회전시켜 펠렛의 DNA.
    5. 혈청 학적 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다. 빙냉 70 % 에탄올로 펠렛을 두번 세척한다.
    6. 가능한 한 많은 액체를 제거하고 15 분 동안 실온에서 공기 건조시킨 펠렛을 허용한다.
    7. 1X TE 완충액 (pH 8.0) 567 μL의 DNA 펠렛을 재현 탁.
      참고 : 상온에서 완전한 재 부유 적어도 15 분을 허용합니다. 추가 처리 할 때까지 4 ° C에서 하룻밤 재현 탁 DNA를 저장합니다.
    8. 새로운 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 재 부유 DNA 용액 전체 567 μl를 전송합니다. (20) _ (미리 예열 10 % SDS 30 μL와 단백질 분해 효소 K의 3 μl를 추가6; g / mL)로 잘 혼합하고 56 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. 65 ° C에서 CTAB / NaCl을 사전 따뜻한.
    9. 5 M의 NaCl 100 μl를 첨가하고 잘 혼합한다. 미리 예열 CTAB / NaCl 용액, 소용돌이의 80 μl를 추가하고 65 ° C에서 10 분 동안 품어.
    10. 5 분 동안 16,100 XG에서 클로로포름, 믹스 소용돌이, 스핀의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    11. 새로운 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송합니다. 5 분 동안 16,100 XG에서 페놀 / 클로로포름, 믹스 소용돌이, 스핀의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    12. 새로운 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송합니다. 5 분 동안 16,100 XG에서 클로로포름, 믹스 소용돌이, 스핀의 동일한 볼륨을 추가합니다.
    13. 새로운 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 뜨는을 전송합니다. 상기 상청액 분획에 동일 부피의 이소프로판올을 추가 혼합하고, 적어도 30 분 동안 -20 ℃에서 배양한다.
    14. 4 ℃에서 15 분 동안 16,100 XG에서 DNA, 스핀을 펠렛. 조심스럽게 상층 액을 피펫과 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올로 두 번 펠렛을 씻는다. 짧은 스핀을 수행하고 튜브에 남아있는 에탄올을 제거합니다. 공기는 15 분 동안 펠렛을 건조.
    15. 용출 완충액 (5 mM 트리스, pH를 8.5) 50 μL와 DNA 펠렛을 재현 탁. 펠렛은 실온에서 5 분 이상 재수 할 수 있습니다.
    16. 고감도 형광 계 분석을 이용하여 DNA 정량화.
  5. Phi29 중합 효소를 사용하여 증폭 (선택 사항)
    1. 80 mM 트리스 -HCl (pH 8.0), 20 mM의의 MgCl 2 : 2 × 어닐링 완충액을 준비한다.
    2. 5 U / μL에 Phi29 DNA 중합 효소를 희석.
    3. 50 ㎕의 랜덤 헥사 머 프라이머 (100 μM) 125 ㎕를 2 × 어닐링 완충액 25 μL 물 이루어진 프리믹스 샘플 완충액. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
    4. 사전 믹스 반응 100 μL Phi29 10 배 버퍼 구성 버퍼, 40 ㎕의 10 mM의 dNTPs를, 560 μL 물. -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
    5. 4 μL 샘플 버퍼에 1 μL 템플릿 DNA를 추가합니다.
    6. 일을 품어전자 3 분 95 ° C에서 혼합물과 얼음에 멋진.
    7. , 2.4.4에서 혼합물에 반응 버퍼의 14 μl를 추가로 pipetting 아래로 섞는다.
    8. , Phi29 DNA 중합 효소 1 μl를 추가하고 아래로 피펫 팅하여 혼합하고, 10 분 동안 65 ° C 다음 18 시간 동안 30 ° C에서 배양한다.
    9. 게놈 DNA의 열 또는 페놀 / 클로로포름과 에탄올 침전을 사용하여 반응을 정리합니다.
  6. 표면 형광 현미경 (하스 등을 참조하십시오. 2014 년 28 여과 시스템 설정을위한)
    주 : 핵산 염료 단리 및 정제, 표면 형광 현미경 다음은 샘플 바이러스 입자의 존재 및 순도 (도 2A 및 2C)을 확인하는데 사용될 수있다. 샘플의 자유 DNA 높은 배경 형광을 발생시킬 수있다. 따라서, 샘플 DNase의 현미경 사진에 대한 고정 및 염색하기 전에 내가 처리해야한다.
    1. 산 용액을 제조 (0.1 % 아스 코르 빈산, 50 % 글리세롤). 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 4.9 ml의 10 % 아스코르브 산 100 μL를 추가, 철저히 혼합한다. 상기 혼합물을 100 % 글리세롤 5 mL를 추가하고 잘 혼합 "장착"로 레이블 튜브.
    2. 필터는 -20 ° C에서 0.02 μm의 알루미나 매트릭스 일회용 주사기 필터, 미세 원심 튜브로 나누어지는, 저장을 사용하여 마운트합니다.
    3. 나누어지는 100 새로운 미세 원심 튜브에 샘플의 μL 및 VLP를 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드의 동일한 볼륨을 추가합니다. 적어도 10 분 동안 실온에서 혼합물을 배양한다.
    4. 0.02 μm의 정수 된 물을 800 μl를 추가하여 1 ml의에 볼륨을 확인합니다. 튜브에 SYBR 골드 스테인 1 μl를 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양한다.
    5. -9 -10 PSI (-62.1 및 -68.9 kPa의) 사이의 진공 펌프를 켜서 여과 시스템을 설정합니다.
    6. 물 받침대를 세척하고 필터 받침대에 환상 폴리 프로필렌 지원 반지와 0.02 μm의 알루미나 매트릭스 필터를 배치.
    7. 클램프 필터 및 보안과 필터 받침대 위에 필터 타워를 놓습니다.
    8. 샘플을 통해 필터링하는 데 몇 분 정도 필터 타워에 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브의 내용을 피펫하고 있습니다.
    9. 현미경 슬라이드에 마운트 시약의 레이블 및 피펫 10 μL.
    10. 필터 타워와 클램프를 제거하는 동안의 진공을 남겨주세요.
    11. 조심 필터 지지대에서 필터를 제거하고 킴 와이프로 필터의 바닥을 가릴 후 현미경 슬라이드 마운트 위에 직접 필터를 배치했다.
    12. 필터에 장착 시약의 또 다른 10 μl를 피펫 필터를 통해 커버 슬립을 배치합니다.

3. 생성 미생물 Metagenome

  1. 버퍼 및 솔루션의 준비
    1. 1X DNase의 완충액 50㎖를 준비는 50mM NaAc, 10mM의의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를하는 단계; 6.5 산도를 조정합니다. 필터 소독 (0.22 μm의) 및 저장실온에서 첨가 하였다.
    2. I Dornase 단위 / mg의 건조 중량에 의해 정의 된 활동에 따라 동결 건조 소 췌장의 DNase에서 (분자 수준의 물에) I 1000 U / μL로 효소의 DNase를 준비합니다.
    3. SE 버퍼 100 ml의 준비 : 75 mM의 염화나트륨, 25 mM의 EDTA를; pH를 7.5로 조정합니다. 실온에서 필터 소독 (0.22 μm의) 및 저장.
  2. DNA 추출에 샘플 전처리 이전
    1. 0.22 μm의 필터 1X PBS의 5 볼륨을 추가하여 균질 희석. 예를 들어, 샘플 2 ㎖에 1X PBS 10 ㎖를 추가합니다.
    2. 2 % (v / v)의 최종 농도 β-머 캅토 에탄올을 추가합니다. 실온에서 2 시간 동안 (화학 후드) 혼합물 락.
    3. 10 ° C에서 샘플을 돌리고 15 분 동안 3,056 XG하고, 상층 액을 버린다.
    4. 분자 수준의 물 10 ㎖ (0.22 μm의 여과수)에 펠​​렛을 재현 탁하고, 15 분 동안 실온에서 배양한다.
    5. 반복 한 번 3.2.3와 3.2.4 단계를 반복합니다.
    6. SPI는10 ° C에서 n을 15 분 동안 3,056 XG하고, 상층 액을 버린다.
    7. 5 ㎖ DNase의 1X 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 시료 1 ㎖ 당 15 μL의의 DNase I (1000 U / μL)을 추가한다.
    8. 2 시간 동안 혼합 반복 37 ° C에서 품어.
    9. 15 분 동안 65 ° C에서 DNase의 활성을 비활성화한다.
    10. 10 ° C에서 스핀과 15 분 동안 3,056 XG하고, 상층 액을 버린다. 10 ㎖ SE 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
    11. 단계를 반복 3.2.10.
    12. 10 ° C에서 스핀과 15 분 동안 3,056 XG하고, 상층 액을 버린다.
    13. 2 ml의 SE 버퍼에 펠렛을 재현 탁, 두 개의 미세 원심 튜브에 전송할 수 있습니다.
    14. 미세 원심 분리 튜브에 세포를 펠렛. 실온에서 15 분 동안 16,100 XG에 튜브 스핀.
    15. 상층 액을 제거하고 게놈 DNA 추출 키트, 그람 양성 변화 프로토콜을 사용하여 펠렛 세포에서 DNA를 추출.

4. 생성 Metatranscriptome

  1. 샘플 사전-treatment
    1. 즉시 샘플 수집 및 균질화 한 후 GITC - 용해 버퍼 비드 구타에 의한 세포의 기계적 용해를 수행합니다. 단계 1.4를 참조하십시오.
    2. 실리카 비드 펠렛 5 분 동안 4 ° C에서 혼합물 600 XG에 스핀.
    3. 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다.
    4. 객실 10 분 동안 온도, 스핀 4 ° C에서 15 분 동안 3,056 XG에서 품어, 사용 GITC - 용해 버퍼의 모든 750 ㎕를 위해 클로로포름 200 μl를 추가 15 초 동안 손을 흔들어. 이 15 분 동안 스핀, 스텝 4.2을 준비.
    5. 15 분 스핀 (수성 상 간기 - 유기 상 형태의 명확한 분리) 한 후, 새의 RNase없는 튜브 (들)에 (계면을 방해하지 않고) 성상의 압축을 풉니 다.
      참고 : 수성 단계는 RNA가 포함되어 있습니다. 다음 단계까지 얼음에 튜브를 유지합니다.
  2. 시판의 칼럼 기반 RNA 정제 키트를 사용하여 또는 conve 총 RNA의 추출 및 정제를 수행하여ntional 이소프로판올 기반 RNA 침전.
    1. 실리카 컬럼 기반의 RNA 정제
      1. 얻어진 수성 분획의 총 부피를 측정한다.
      2. 샘플과 잘 혼합하는 RNA 결합 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다.
      3. 제조 업체의 프로토콜에 따라 결합 상태를 적절한하는 혼합물을 조정합니다. 잘 섞어 짧은 회전을한다.
      4. RNA-열에 혼합물을로드합니다. 많은 양의 샘플은 여러로드를 사용하여 4 배 각 열을로드. 그렇지 않으면, 각 샘플에 대해 여러 열을 사용하는 것이 좋습니다.
      5. 제조업체의 프로토콜에 따라 적절하게 열을 씻으십시오.
      6. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 적어도 30 μL와 RNA를 용출시켰다. 두 번 용출 약간 RNA의 수율을 증가시킬 것이다. 그러나, 이는 RNA 농도를 희석한다.
      7. RNA 농도를 측정하고의 DNase I 처리로 직접 진행합니다. RNA의 품질을 확인하기 위해 Bioanalyzer을 사용하십시오 (권장 사항).
      8. RNA 강수량
        1. 이소프로판올 동일 부피 추가 (예를 들면, 수성 분획을 500 μL에 500 μL의 이소프로판올) 및 샘플 10 ㎍ / μL의 RNase가없는 글리코겐 2 μL.
        2. 10 분 동안 실온에서 혼합물을 인큐베이션.
        3. 12,000 XG에 스핀 15 분 동안 4 ° C.
        4. 조심스럽게 뜨는을 제거 된 RNase없는 75 % 에탄올 1 ㎖를 추가합니다. 펠렛은 그대로 있는지 확인하기 위해 7,500 XG, 5 분 동안 4 ℃에서 혼합물을 스핀.
        5. 조심스럽게 에탄올을 제거합니다.
        6. 반복 한 번 4.2.2.4 및 4.2.2.5 단계를 반복합니다.
        7. 공기는 10 분 동안 펠렛을 건조.
        8. 의 RNA 분해 효소가없는 물을 50 μL의 펠렛을 재수, 5 분 동안 55 ° C에서 부화와 DNase를 처리를 진행할. RNA의 품질을 확인하기 위해 Bioanalyzer를 사용합니다 (권장).
        9. -20 ° C, 또는 장기간 저장을 위해 -80 ℃에서 분취 량에 보관 RNA.

Representative Results

바이러스 성 Metagenomes

CF 가래는 매우 점성과 점액 무료 DNA (그림 2A)의 높은 금액을 포함, 밀도 구배 초 원심 분리는 숙주 유래의 DNA (도 2B)의 제거를 용이하게한다. 제시된 흐름으로부터 발생 여덟 viromes를 도시 9 이전 연구의 결과는 다음과 (표 1)를 나타내었다. 세븐 샘플 (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A 및 CF5-B; 표 1) 2. 생성 된 viromes가 조금 포함 된 섹션에 설명 된대로 (0.02 처리 된 % -3.7 %) 단 하나의 예외 (70 %)을 가진 인간 유래 서열. CF4-A는 밀도 구배 초 원심 분리 공정 (CF4-A) 및> 97 %의 인간 유래 서열 (표 1).도 2를 함유 이러한 특정 샘플로부터 생성 virome 생략 하였다는 전형적인의 표면 형광 현미경 화상의 예를 도시 CF sputum 샘플 (도 2A) 및 이전 (도 2C) 밀도 구배 초 원심 분리 후. 클리어 바이러스 - 유사 입자 (VLP를)는 밀도 구배 분리없이 다음 큰 입자 현미경에서 관찰되었다. VLP를 DNA를 추출 후, 세균 오염은 종종 VLP를 DNA 시퀀싱의 16S rDNA 염기 전에 증폭을 이용하여 테스트된다.

미생물 Metagenomes

여기에 제시된 일곱 객담 샘플을 연속 7 일간에 걸쳐 하나의 CF 환자에서 수집되었다. 가래가 수집 된 후 환자는 3 일에 경구 항생제 (시프로플록사신과 독시 싸이클린)에 시작했다. 이 환자로부터 수집 된 각 가래 시료의 부피는 칠일에 걸쳐 15 ml의이었다; 따라서, PBS는 샘플에 추가되지 않았습니다. 이 샘플링 이벤트의 목적은 미생물 커뮤니티 구조의 일일 변동의 평가 (I)에 의해 흐름이 제시 프로토콜을 평가하는, 및 (ii) 비교메타 지노믹스와 16S rDNA의 염기 서열 사이의 미생물 군집 구조와 해상도. 따라서, 전체 DNA 및 HL-DNA는 각각의 샘플에서 추출 하였다.

DNA 추출은 다음 각 가래 시료 HL-DNA 농도는 표 2에 제시되어있다. HL-DNA의 총 수율은> 5㎍을 ng 내지 210이었다. 일루미나 시퀀싱 라이브러리는 (1)의 전체 원료를 각각의 샘플 (도 3) 미국 ng를 생성 하였다. 메타 지노믹스 데이터의 특성을 표 2. 모두에 제시되어 있지만, 하나의 라이브러리가 100 만 이상 서열과 85 % 이상의 높은 품질 서열 29 PRINSEQ 소프트웨어를 사용하여 데이터 전처리에 유지 수득 하였다. 모든 데이터 세트를 먼저 추가 검사 및 DeconSeq (30)를 사용하여 인간 유래의 서열을 제거하여 중복 및 품질이 낮은 (25의 최소 품질 평가 점수)의 시퀀스를 제거하는 전처리 하였다. 인간 드의 양유래 한 시퀀스 오염 시료 특성에 따라 크게 좌우됩니다. 여기서, 인간 유래 서열의 총량은 14-46 % (표 2)에서 ranged. 사전 처리 순서는 다음 Metaphlan (31) 파이프 라인뿐만 아니라 MG-RAST (32) 서버를 사용하여 주석이되었다.

metagenomes 이외에, 16S rDNA의 증폭 물 라이브러리는 16S rRNA 유전자 (33, 34)에 V1-V2 가변 영역의 약 300 bp의 타겟팅을 통해 프라이머 총 DNA 및 HL-DNA 모두로부터 생성 하였다. 개별 샘플들로부터 PCR 제품은 표준화되었고 MiSeq 플랫폼상에서 수행 일루미나 500 사이클 쌍의 엔드 시퀀싱을 이용하여 시퀀싱 풀링. 짝 엔드 16S rDNA의 증폭 물 시퀀스는 파이썬 스크립트를 사용하여 바코드를 통해 샘플으로 분류하고 페어링이를 phrap (35, 36)를 사용하여 조립 된 읽기. 조립 순서의 끝은 평균 품질 점수 ≥20 5 NT 창을 사용하여 때까지 손질했다. 잠재적 인 키메라가 있었다N SILVA 38 레퍼런스 시퀀스의 키메라 프리 서브 세트에 대해 Uchime 37를 사용하여 제거. 고품질 실바 (38) 데이터베이스에서 418,497 세균 시퀀스를 사용하여 SINA 39 (버전 1.2.11)과 읽기에 Taxanomy가 할당되었다. 동일한 분류 학적 과제와 시퀀스는 운영의 분류 학적 단위 (OTUs)을 생산하는 클러스터했다. 이 과정은 16 샘플 (:; : 72603, 최대 : 127,113 분 103,455 시퀀스 / 샘플 평균 크기)에 대한 1,655,278 시퀀스를 생성합니다. 중간 제품 범위 점수, 염기 서열의 완전성의 측정은, ≥ 99.9 %였다. 소프트웨어 패키지 Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org)를 분석하고 그림 생성을 위해 사용되었다. 알파 - 다이버 시티 (인트라 샘플) 및 베타 - 다이버 시티 (샘플 간)는 부트 스트랩 (100)의 재 샘플링과 72,603​​ 시퀀스들의 희박 Explicet 포인트에서 계산 하였다.

본 연구의 대상이 첫 번째 질문은 저장성 용해 preferenti 여부였다(즉, 우선적으로 유지 또는 lyses) 미생물의 특정 그룹에 대한 동맹국 선택합니다. 첫 번째 저장성 용해 후, 다시 정지 펠렛 세포는 두 번째 저장성 용해 (CF1-1and CF1-2) 후 동일한 샘플을 비교하는 처음 두 샘플 (CF1-1A * 및 CF1-2A *)에서 서브 샘플링했다. 모든 샘플 DNA 추출 및 시퀀싱 파이프 라인이어서 동등 즉, 종래 I DNA 추출의 DNase 처리에 처리 하였다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 미생물 부 표본의 프로필은 두 저장성 용해 처리 후의 시료에 매우 유사하다. 또한, 제 2 저장성 용해는 metagenomes (표 2) 내의 6-17%하여 비 - 인간 서열의 분율을 증가시킨다.

metagenomic- 및 16S rDNA의 기반 프로파일 사이의 미생물 조성의 차이를 테스트하고 이전에 우리의 스터드 사이 본의 차이를 설명 할 수있을 전에 저장성 용해 후 변경하려면이거 다른 사람들은 박테리아의 16S rDNA 염기 서열 라이브러리는 전체 DNA와 HL-유래 DNA (그림 4B) 모두에서 발생했다. 속 수준에서, 같은 슈도모나스 (Pseudomonas),와 Stenotrophomonas, 프레 보 텔라 (Prevotella), Veillonella 및 연쇄상 구균과 같은 일반적인 CF-관련된 박테리아의 분류 프로파일은 HL-유도 된 DNA로부터 생성 된 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes 사이의 매우 유사했다. 그러나, 16S rDNA의 라이브러리의 Rothia 감지 metagenomic 라이브러리와만큼 풍부하지 않았다. 총 DNA 및 HL 유래 DNA로부터 생성 된 16S rDNA 염기 분류 학적 프로파일을 비교하면, 차분이 슈도모나스 날 (3)로부터 유래 DNA HL 개시에 비해 전체 DNA로 표현 하였다.

Metatranscriptomes

통상적으로, CF 객담 추출 총 RNA 부분적 저하되고 크기가 25-4,000 BPS (도 5a 내지 및 등. 2012 9 년에 출판되었다. 비 - 고갈 metatranscriptomes 내의 rRNA 유전자의 분획 27-83% 범위와 rRNA 유전자의 상대적인 농축 샘플에 걸쳐 변화 (표 3]. 림 등 (9)로부터 데이터를 추출). 그러나 리보 제로 키트 고갈은 샘플 CF1-F를 제외하고 1-5 %로 rRNA 유전자의 rRNA만이 상대적으로 풍부 감소했다. rRNA 유전자 제거의 효과의 변화는 프로브 하이브리드 9 rRNA만이의 추출 RNA의 품질, 또는 차이 미생물 군집의 존재에 따라서 접근성을 반영 할 수있다. 리보 제로 rRNA 유전자 제거 키트를 사용하여 성공적으로 (그림 5B)과 실패 (그림 5D) rRNA 유전자 제거의 electropherograms이되는 rRNA의 피크가 실패 제거에 볼 수 있습니다 다릅니다.

의 cDNA의 크기 범위는 GE를 라이브러리를nerated 종종 출발 RNA 샘플의 크기 범위를 반영한​​다. 여기에 소개 된 cDNA 라이브러리는 로슈 454 시퀀싱 라이브러리 준비 (9) 다음 rRNA의 고갈에 따라 전체 사체 증폭 키트 (WTA2)로 생성되었다. cDNA를 (임 등. 2012) 50-4,000 BPS (그림 5E 및 5 층)에 이르기까지 조각을 포함 생성 된 샘플에서 매우 일치한다 (9). 다른 플랫폼 특정 RNA-SEQ 라이브러리 준비 키트의 가용성은 현재 한 최적의 조건에서 cDNA 합성 및 시퀀싱 라이브러리의 준비를 결합하기 위해 더 많은 다른 옵션을 제공합니다. 지금까지 하나의 권장 옵션은 위의 권장 rRNA 유전자 제거 시약 및 RNA-SEQ 라이브러리 준비 키트를 결합 ScriptSeq 전체 골드 키트입니다.

그림 1
그림 1 : 준비를위한 워크 플로우virome, 마이크로 바이 옴, 그리고 metatranscriptome 시퀀싱 등의 객담 샘플과 같은 호스트 관련 샘플의 aration.

그림 2
그림 2 : 세슘 염화물 밀도 구배 초 원심은 세포 DNA와 큰 입자 (A)의 제거를 용이하게하고, CF 객담에서 바이러스 같은 입자의 최적의 분리를 위해 할 수 있습니다. 각 구배 밀리리터 중 하나는 전처리 된 샘플 (B)를 로딩하기 전에 서로의 상단에 적층된다. 이어 입자를 분리 및 정제, 예컨대 금 SYBR 핵산 염료 표면 형광 현미경은 시료에서 바이러스 입자의 존재 및 순도를 확인하는 데 사용된다. 클리어 바이러스 - 유사 입자 (C; 흰색 화살표)가 CF 객담 샘플의 밀도 구배 분리 다음 관찰 하였다.


그림 3 :. 모든 편차없이 제조 업체 프로토콜에 설명 된대로 CF 객담 microbiomes 결과 HL-DNA의 1 NG에서 생성 Nextera XT 라이브러리의 크기 분포의 예 풀링 도서관 정상화 및 로딩 양을 시행 하였다.

그림 4
그림 4 : 하나의 CF 환자를 세로 방향으로 수집 아홉 샘플에서 미생물 군집의 분류 학적 분석 저장성 용해 방법 기반의 DNA에서 생성 된 metagenomic 라이브러리를 기반으로 (A) 미생물 프로파일.. 종 할당은 낮은 품질과 인간의 서열 유사성과 중복 및 시퀀스를 제거 Metaphlan 파이프 라인을 다음과 같은 데이터 전처리에 근거했다. 그 두 성을 보여주기 위해저장성 용해 우선적하지 않았다 처음 저장성 용해가 포함 된 후 미생물, 서브 샘플 (*)의 특정 그룹에 대한 선택 주당 순이익. (B) 미생물 프로파일 전체 DNA (T)과 저장성 용해 방법에서 16S rRNA 유전자 염기 서열의 V1V2 지역에 따라 기반 DNA (HL). 이 자료는 이전에 발표되지 않았다.

그림 5
그림 5 : RNA (AD)과의 cDNA (EF)의 애질런트 2100 Bioanalyzer의 electropherograms의 예는 각각 RNA 피코와 고감도 dsDNA 칩을 사용, metatranscriptomic 라이브러리를 생성합니다. (A)와 (C)는 rRNA의 제거 절차 전에 electropherograms의 예를 나타낸다. 전체 rRNA의 제거 키트를 사용하여 성공적으로 (B)의 electropherograms 실패한 (D) rRNA의 제거 절차는 약간 다를피크를 rRNA의 t은 실패한 제거에 볼 수 있습니다. cDNA를 크기 범위 (EF)이 전체 사체 증폭 키트 (시그마 - 알드리치) 출발 rRNA 유전자 결핍 RNA의 크기 범위와 유사하고, 두 개의 다른 샘플들에 걸쳐 높은 일관성을 이용하여 생성. 보려면 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
전체 수 읽기 224859 87891 106189 93301 140020 1,558 272552 217438
전처리 읽기 109389 73624 67070 82011 68617 1,137 215808 158432
49 % 84 % 63 % 88 % 49 % 73 % 79 % 73 %
염기의 수 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
읽기 길이를 평균 (432) (453) (431) (337) (428) (215) (441) 439
호스트 시퀀스 (B) (240) (526) (28) 79774 (13) 797 (585) 5,859
0.21 % 0.71 % 0.04 % 97.27 % 0.02 % 70.10 % 0.27 % 3.70 %
바이러스 성 명중 C 7,214 23550 4,070 (737) 4,642 (22) 6,466 5,981
6.59 % 31.99 % 6.07 % 0.90 % 6.77 % 1.93 % 3.00 % 3.78 %
할당되지 않음 D를 읽어 103888 60490 32780 1,935 68440 (311) 105612 119551
94.97 % 82.16 % 48.87 % 2.36 % 99.74 % 27.35 % 48.94 % 75.46 %
데이터 사전 proce을 한 후 읽어PRINSEQ (29)에 의해 ssing.
B 인간은 DeconSeq (30)에 의해 식별 플러스 문 척색에 가장 BLASTN 히트 (NCBI 염기 데이터베이스)를 읽고 읽습니다.
C tBLASTx 사내 바이러스 게놈 데이터베이스에 대해 안타. 백분율은 판독 전처리의 총 개수를 사용하여 산출 하였다.
d는 NCBI의 뉴클레오티드 데이터베이스에 대해 충돌없이 BLASTN으로 읽습니다. 백분율은 판독 전처리의 총 개수를 사용하여 산출 하였다. NCBI의 뉴클레오티드 데이터베이스에 대해 히트 더 BLASTN가 tBLASTx 분석에서 단백질 수준에서 바이러스로 확인되지 않았다 일부는 읽습니다.

표 1. 제시 워크 플로우를 사용하여 객담 샘플에서 생성 된 여덟 viromes 도서관 특성이 테이블은 임 <에서 추출EM> 등. (2012) 9. 작은 (0.02 %를 포함 viromes를 2 절에서 설명하고 생성 된 세븐 샘플 (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A 및 CF5-B)가 처리 된 - 3.7 %) 한 가지 예외 (70 %)로 서열을 인간 유래. CF4-A는> 97 %의 인간 유래 서열을 포함 밀도 구배 초 원심 분리 공정 (CF4-A) 및 생성 virome에서 생략 하였다.

견본 집중 총 생산량 총 번호 읽고 총 번호 읽고 (가공 B) 인간이 아닌 시퀀스
(NG / μL) (NG) (원시) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74 %
CF1-1 (13) 1,300 2212756 1958910 1574520
80 %
CF1-2A * 2.1 (210) 672878 588106 407530
69 %
CF1-2 5.2 (520) 1944012 1697010 1455174
86 %
CF1-3 28.8 2,880 1048304 896756 560852
63 %
CF1-4 24.1 2,410 1154922 984702 621098
63 %
CF1-5 33.6 3,360 1029622 888630 481548
54 %
CF1-6 43.2 4,320 1434016 1256504 725858
58 %
CF1-7 57.8 5,780 1000174 872036 565376
65 %
* 샘플 1mL를 CF1에서 서브 샘플링 된 두 번째 저장성 용해 절차 전에 먼저 저장성 용해 단계 (단계 3.1.5) 다음 -1 CF1-2. 수정없이 나머지 프로토콜을 통해 3.1.7에 설명하고 진행하는 세포를 스핀 다운되었다.
처리되지 않은 일루미나는 2 × 300 염기쌍의 MiSeq 시퀀싱 실행에서 읽습니다.
B는 평가를 손질하고, 토론에 설명 된대로 품질과 길이에 따라 제거 읽습니다.

표 2 :. 제시 플로를 사용 객담 시료로부터 생성 microbiomes의 특징 100 μL 용출 완충액 (5 mM 트리스 / 염산, pH를 8.5) 및 시퀀스 데이터의 특성에 각 샘플의 DNA 농도가 제시된다. 1ng의 총 Nextera XT 라이브러리 제조 키트를 사용하여 개인 라이브러리를 생성하기 위해 사용되었다.

0 "fo를 : 유지-together.within 페이지를 ="항상 "> 견본 CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C 치료 없음 리보 제로 없음 리보 제로 없음 리보 제로 없음 리보 제로 전처리 읽기 2,088 1,991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 읽기 길이를 평균 (275) (245) (262) (270) (233) 259 (240) 267 총 rRNA의 읽기 1,737 (91) 29499 17267 5,285 (291) 16371 1,761 83.20 % 4.60 % 72.20 % 68.40 % 26.80 % 0.90 % 51.50 % 4.90 % 미생물 rRNA의 1,414 (32) 19978 12035 (23) (227) 6,916 1,076 67.70 % 1.60 % 48.90 % 47.70 % 0.10 % 0.70 % 21.80 % 3.00 % Eukaryota rRNA의 (323) 59 9,520 5,232 5,262 (64) 9,455 (683) 15.50 % 3.00 % 23.30 % 20.70 % 26.70 % 0.20 % 29.70 % 1.90 % % rRNA를 제거 * 0 % 95 % 0 % 5 % 0 % 97 % 0 % 91 % 비 rRNA의 읽기 351 (16.8 %) 1,900 (95.4 %) 11,377 (27.8 %) 7,971 (31.6 %) 14,443 (73.2 %) 32,446 (99.1 %) 15,420 (48.5 %) 34,411 (95.1 %) 총 NR 히트 102 (4.9 %) 691 (34.7 %) 3327 (8.1 %) 2,857 (11.3 %) 4,938 (25.0 %) 10,751 (32.8 %) 5,905 (18.6 %) 15,766 (43.6 %) 진핵 (74) (407) 2,790 2,524 4,614 10227 4,553 8,274 세균의 (26) (283) (520) (312) 287 (471) 1,326 7,442 할당되지 않은 읽기 249 (11.9 %) 1,209 (60.7 %) 8,050 (19.7 %) 5,114 (20.3 %) 9,505 (48.2 %) 21,695 (66.3 %) 9,515 (29.9 %) 18,645 (51.5 %) * rRNA 유전자의 양은 비 - 고갈 분취 량에 존재하는 양의 비율로서 표현 제거.

표 3 :.와 rRNA의 고갈없이 metatranscriptomes 도서실 특성 데이터 임 등으로부터 추출한다 (2012) 9, 추가적인 다른 rRNA 유전자 제거 키트의 비교 종래 시퀀싱 라이브러리 제조 cDNA에 분무의 효과를 갖는다..

Discussion

바이러스 성 메타 지노믹스

바이러스 입자는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 석출이나 소량 농축기를 이용하여 농축된다. 일부의 경우, 농도는 필요하지 않을 수도 있지만, 미리 여과 또는 저속 원심 분리 단계가 진핵 미생물 세포를 제거하는데 사용된다. 바이러스 성 용 해물을 더욱 풍부하고 밀도 구배 초 원심 9,41 또는 작은 크기의 필터 (예를 들면 0.45 μm의)가 진핵 미생물 및 대형 셀 (25)을 제거하기 위해.하여 정제 될 밀도 구배 초 원심 분리는 일반적으로 바이러스 성 입자 (41)를 집중 수크로오스 또는 세슘 클로라이드와 같은 조밀하지만 불활성 해법 행한다. 물리적 분리는 바이러스 입자 크기와 밀도의 부력에 기초한다. 따라서, 필터의 기공 크기를 적절히 선택과 구배 엄격한 제제의 물리적 회복 성공으로, 특정 바이러스 커뮤니티를 분리하는 데 필수적인VLP를 41 (추출 밀도 내에서 필터 또는 가을에 통과하지 않는 즉, 바이러스 입자 metagenome에서 검출되지 않습니다)을 고립 지역 사회를 결정합니다. 바이러스의 분리 및 농축 후에, 무료 핵산 미생물 및 진핵 세포의 형태 모두 샘플 비 바이러스 게놈 물질 본 오염이있을 수있다. 따라서 시료에서 바이러스 입자의 순도 (도 1a 및도 1b)을 확인하는 것이 중요하다. 클로로포름 처리는 일반적으로 종래의 핵산 추출법 자유 핵산을 저하 클레아 처리하여 잔여 세포를 용해하기 위해 사용된다.

제시된 워크 플로우에 대한주의는 웹 기반 협동 학습 그라데이션를 입력 너무 낙관적 일 수있다 포락선 바이러스 입자를 제외 할 수 있으므로 바이러스 입자를 분리하는 밀도 기울기 분리를 사용했다. 대안은 "포괄"방법은 밀도 구배 separ를 생략하는 것입니다ATION는 0.45 μm의에서 지역 사회 DNA 분리 및 - 클로로포름의 DNase I.이 방법으로 처리 여과 액을 같은 면봉 또는 혈장에서 그와 같은 작은 샘플 볼륨을 수용하는 것이 적절하다. 그러나,이 클로로포름 내성 세균 오염과의 DNase I-내성 세포 DNA의 양이 더 발생할 수 있습니다.

높은 DNA 수율은 시퀀싱 옵션의 폭 넓은 선택을 제공함으로써 현재 시퀀싱 프로토콜은 1 NG 시퀀싱 라이브러리 준비를위한 핵산의 μg의 1이 필요합니다. 생성 viromes의 DNA 농도는 종종 200 이상 NG / μL로 검출 한계 이하의 범위. 회수 된 바이러스 핵산의 양은 직접 염기 서열 라이브러리 제조에 불충분 할 수있다. 이러한 경우, 핵산 증폭은 필수적이다. 링커 증폭 산탄 라이브러리 (LASLs) 2,42,43 복수 변위 증폭 (MDA)에 기초하여 전체 게놈 증폭 두 아르방법은 가장 일반적으로 충분한 DNA 시퀀싱을 생성하기 위해 사용될. 이러한 Phi29 DNA 폴리머 라제에 기초한 것과 MDA 방법은 증폭 바이어스 겪을 공지되어 있으며, 비 정량적 우선적 분류 학적 및 기능적 특성화 44,45 결과, ssDNA를 원형 DNA를 증폭 할 수있다. LASLs 접근법의 최적화 된 버전은 최소한의 바이어스를 소개 도시 (출발 물질이 소량에 대해) 더 높은 민감도를 촉진하고, 용이하게 다른 시퀀싱 플랫폼 (43)하도록되어있다. 그러나, 방법은 많은 단계가 DNA 손상을 최소화하기 위해 특수 장비를 필요로하고, dsDNA 템플릿에 한한다. 우리 연구실에서는이 방법이 성공적으로 기관지 lavage-, coral-과 바다 물에서 파생 된 VLP를 (미 출판과 Hurwitz의 등. 46)에서 추출 된 DNA의 검출 및 탐지 양을 증폭하도록하고있다.

데이터 분석 파이프 라인을 개발하는 것은 CLA를 가지고ssically 인해 바이러스 성 지역 사회의 매우 다양하고 대부분 알 수없는 특성으로 바이러스 메타 지노믹스 분석의 가장 어려운 문제 중 하나가되었습니다. 날짜 현재 바이러스 데이터베이스에 생물권에 약 10 8 바이러스 유전자형이가 있지만,이 대략 전체 바이러스 성 다양성의 약 1 / 100,000입니다 ~ 4000 바이러스 게놈가 포함되어 있습니다. 따라서, 바이러스 성 metagenomes의 분류 및 기능 할당 (예 : BLAST 47) 유사성 기반 검색은 고유의 과제를 가지고있다. 많은 서열은 게놈 데이터베이스의 상당한 유사성을 실패하고, 그러므로, 미지로 분류된다. 상동 기반 검색이 분류법을 할당을위한 가장 중요한 애플리케이션은 데이터 시퀀스를 작동하더라도, 데이터베이스 분석에 근거하여 독립적 인 대안 적 방법은 48 (50)이 개발되었다. Fancello 등. (51)은 비라에 사용되는 계산 도구와 알고리즘의 전체 리뷰를 제공리터의 메타 지노믹스.

미생물 메타 지노믹스

일반적으로, 저장성 용해 처리 된 미생물 군집 (HL-DNA)에서 추출 된 DNA의 총량은 20 ng의 5 μg의 범위. 수율은 환자의 건강 상태 및 본 연구 (표 2)에 추출 된 HL-DNA의 총 수율에 변화를 보이는 설명 수집 객담 시료의 양에 크게 의존한다. 중요한 단계는. 양질 시퀀스 데이터 생성 순서 라이브러리의 질에 의존 생성 2 효소 기반 DNA 단편화 절차를 이용하여 CF 객담 유래의 미생물 DNA로부터 생성 순서 라이브러리의 전형적인 크기 범위를 도시도. 최적 라이브러리 크기는 시퀀싱 플랫폼 및 애플리케이션의 선택에 의존하며, 따라서, 필요한 경우, 단편화와 같은 절차를 초음파 분무 같은 대체 방법을 통해 최적화 될 수있다. 이외에도제시된 대표적인 결과는, 여러 시점에 걸쳐 다수의 환자에서 수집 CF 객담에 제시된 방법의 성공은 또한 (2012) 9. 임 등의 알에서 설명하고 임 외. (2014) 10.

이전의 연구 9,10 모든 환자가 변동으로 인해 이러한 항생제 치료 등의 섭동 가능성시키면서 지역 사회 내 주요 선수의 지속성을 반영, 시간이 지남에 따라 이동 미생물 군집의 고유 한을 품고있는 것이 좋습니다. 이러한 변동도 외부 교란하지 않거나 인해 샘플링 절차 및 샘플 처리에 매일 발생 여부, 질문에 아직도있다. HL-DNA의 metagenomic 및 16S rDNA의 증폭 물 분석에 기초하여, 7 일 종 샘플링 보여준다 항생제 섭동없이 미생물 프로필 일일 변동 (주 1, 2, 3) 하였다 최소 (도 3a 및도 3b). 소개시항생제 시프로플록사신은 P.으로 알려진 세균성 병원균의 광범위한 스펙트럼을 대상으로하는 동안 경구 용 항생제의 duction 즉시 3 일 샘플링 한 후, 지역 사회 프로파일의 변화는 일 4. 명백하게되었다 녹농균, 황색 포도상 구균, 폐렴 구균 및은 치료 P.의 상대적인 농축 증가 녹농균은 연쇄상 구균 종을 감소한다. 및 P. melaninogenica. 6 일함으로써, 지역 사회 천천히 초기 시작 사회 구조에 회복되었다. 결과는 한 명의 환자 내에서 미생물 프로파일의 변동으로 인해기도에 지역 사회의 동요에 더 많은 가능성이 있음을 시사한다.

HL-유도 된 DNA로부터 16S rDNA의 라이브러리와 metagenomes의 미생물 프로파일 사이의 일관성을 감안할 때, 우리는이 연구에서 사용 된 16S rRNA 유전자 프라이머에서 발생하는 편견을 배제. 16S rDNA 염기 분류에 걸쳐 본의 차이점에 대한 한 가지 가능한 설명총 DNA 및 HL-유래 DNA (그림 3B)에서 생성 된 알 프로파일은 슈도모나스 종 다량의 존재 일 수있다. 항생제 치료 후 세포 DNA. 이것은 이러한 차이는 7 일에서 가장 명백한 있다고 연구 결과에 의해 지원됩니다, 삼일 슈도모나스 종을 대상으로 항생제 치료 후. 다른 이외에. 시프로플록사신 일반적 만성 P. CF 환자에서 제 치료제로서 사용 활동의 스펙트럼이 가장 CF-관련된 병원체를 포함하더라도 녹농균 감염. 우리는 항생제 치료가 연쇄상 구균 종을 포함하여 취약 지역 사회를 근절한다는 가설을 세웠다. 따라서 내성 P.에 의해 채워 틈새를 만들어 녹농균. 녹농균은 생물막 지역 사회를 증가를 통해 저항을 얻을 수 있으며, 세포 외 DNA는 생물막 구조 (52)의 주요 구조 지원 될 것으로 나타났다. 심지어 t으로그는 사회 구조는 세포 외 DNA는 CF 객담에 남아있을 수있다, 회복되었다. 따라서 이러한 데이터는 저장성 용해 잠재적으로 만 인간 유래 DNA를 제거하지에 도움이 워크 플로에 제시된 세척 단계뿐만 아니라, 미생물 유래의 세포 외 DNA는 실제 미생물 프로파일을 잘못 수 있음을 시사한다.

Metatranscriptomics

고품질 metatranscriptome는 상대적으로 적은 리보솜 RNA (rRNA의) 시퀀스를 포함하고 지역 사회 성적 증명서 (의 mRNA)의 편견 샘플링을 대표한다. 인해 mRNA를 짧은 반감기 및 제한된 양으로, 이는 프로토콜이 여기에 제시된 바와 같이, 회수 된 전 사체의 수를 최대화하기 위해 시료 처리를 최소화하는 것이 중요하다.

최근, rRNA의 고갈을위한 여러 접근법이 개발되어 시판 키트에 장치. 이들은 MICROB 풍부하게, 리보 제로 및 샘플 별 감산 시간을 포함ybridizations 올리고 뉴클레오티드 하이브리드 화, 및 5 '모노 포스페이트를 함유하는 엑소 뉴 클레아 제 효소 활성 표적 RNA에 기초-ONLY mRNA의 키트에 기초 53아르. 또한, 이러한 우선적으로 선형 RNA를 polyadenylates 및 증폭 MessageAmp II-박테리아 키트와 같은 mRNA의 부화에 대한 몇 가지 접근 방식도 사용할 수 있습니다. 이러한 방법 (예를 들면, mRNA의 전용 MICROB E의 XPRESS 및 MessageAmp)의 일부는 최적의 효율을 동시에 사용된다. 그러나 이러한 접근 방법 모두의 효능은, 부분적으로 저하 rRNA의 작업을 자주 CF 샘플에서 추출 된 총 RNA에서 관찰 특히, 제한된다. 폴리아 데 닐화 - 의존성 RNA 증폭 원핵 및 진핵 세포 모두에의 mRNA 이루어진 metatranscriptomes을 생성하기 위해 사용될 수 없다. 또한, 폴리 (A) 꼬리에 유용 시퀀스 데이터의 양을 줄일 수있는 서열에 첨가 하였다. 단독 뻗어와 지역의 품질이 저하 점수를하는 경향이, C상당수를 ausing 것은 폴리을 트리밍 한 후 시퀀싱 및 후 시퀀싱 소프트웨어, 평균 판독 유용한 길이에 의해 여과 될 판독한다 (A) 꼬리 (54)가 크게 감소 될 것이다.

복잡한 CF 미생물 지역 사회와 부분적으로 저하 RNA (도 4A 및 4C) 다루기, 우리의 이전 연구는 리보 제로 골드 키트에 의한 하이브리드 캡처 방법을 사용하여 결합 치료에 비해 인간과 미생물 rRNA를 모두 제거에 더 효과적인 것으로 나타났다 다른 키트 9 (표 3). 결과 데이터는 인간 숙주와 미생물 성적 증명서 모두를 동시에 분석 할 수 있습니다. 수율 및 RNA의 질뿐만 아니라 시퀀싱 플랫폼의 최종 선택에 따라 cDNA를 합성하는 단계를 포함하여 이들 공정 중 많은 시퀀싱 라이브러리 생성하여 간소화 될 수있다. 예를 들어, 리보 제로 처리 된 RNA는 metatranscriptome 시퀀싱 천칭을 만들기 위해 사용될 수있다RIES ScriptSeq RNA-SEQ 도서관 준비 키트를 사용하여.

동물 관련 커뮤니티의 Metagenomic 분석은 호스트와 관련된 지역 사회를 포함하는 전체 기능 엔티티의 포괄적 인 표현을 제공합니다. 여기에 제시된 플로 특히, 원하는 바이러스 및 미생물에 더하여 두꺼운 점액 세포 파편, 세포 DNA, 단백질 및 당 단백질 복합체의 높은 양뿐만 아니라, 숙주 세포를 포함하는 것과 복잡한 동물 연관된 다양한 시료에 적용 할 수있다 입자. 미생물 및 바이러스 성 입자는 모든 단계에서 손실 될 수있다하더라도, 분리 및 정제가 숙주 DNA의 양을 최소화하는 것이 필수적이다 입자. 메타 지노믹스 데이터가 조사 된 지역 사회의 대사 잠재력을 제공하지만, 인코딩 기능 9의 발현 차이를 공개하여이를 보완 metatranscriptomics. 유전체 및 전 사체 데이터의 포괄적 인 평가는 새로운 기능을 나왔고지역 사회 상호 작용의 역학에 ights 및 개선 치료 9,10,55의 개발을 용이하게한다.

Acknowledgments

이 작품은 숲 Rohwer에게 수여 국립 보건 연구소 (1 R01 GM095384-01)에 의해 지원되었다. 우리는 리보 제로 역학 키트 조기 액세스를 제공하기위한 Epicentre, Illumina의 회사를 감사합니다. 우리는 초 원심 튜브 홀더의 설계 및 생산에 대한 마크 하타 감사합니다. 우리는 촬영 과정을 지원을위한 중요한 판독하고 원고의 토론 안드레아스 하스와 베냐민 놀즈 감사, 로렌 폴.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

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References

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분자 생물학 문제 94 virome 마이크로 바이 옴 메타 지노믹스 metatranscriptomics 낭포 성 섬유증 점막 표면
불순한 정화 : 연속 Metagenomes 및 Metatranscriptomes을 복잡한 동물 관련 샘플에서
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Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

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