Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان.

Abstract

إمكانية الوصول إلى الإنتاجية العالية التسلسل قد أحدثت ثورة العديد من مجالات علم الأحياء. من أجل فهم أفضل المجتمعات الفيروسية والميكروبية المصاحبة المضيفة، وقد تم تطوير سير عمل شامل لاستخراج DNA و RNA. سير العمل في وقت واحد يولد metagenomes الفيروسية والجرثومية، وكذلك metatranscriptomes، من عينة واحدة للجيل المقبل من التسلسل. اقتران هذه النهج يوفر لمحة عامة عن كل من الخصائص التصنيفية وظائف المجتمع المشفرة. طرق عرض استخدام التليف الكيسي (CF) البلغم، وهو نوع العينة إشكالية، لأنه لزج بشكل استثنائي ويحتوي على كمية عالية من mucins، DNA العدلات الحرة، وغيرها من الملوثات غير معروفة. بروتوكولات الموصوفة هنا تستهدف هذه المشاكل وبنجاح استعادة الحمض النووي الفيروسي والجرثومي مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي البشري. لاستكمال الدراسات metagenomics، تم تحسين بروتوكول metatranscriptomics لاسترداد كل من الجراثيمومرنا المضيف الذي يحتوي على عدد قليل نسبيا من RNA الريباسي (الرنا الريباسي) متواليات. ويقدم لمحة عامة عن خصائص البيانات لتكون بمثابة مرجعية لتقييم نجاح الأساليب. تم جمع عينات البلغم CF إضافية أيضا إلى (ط) تقييم اتساق ملامح microbiome عبر سبعة أيام متتالية داخل مريض واحد، و (ثانيا) مقارنة اتساق النهج ميتاجينومية إلى القائم على التسلسل الجيني RNA الريباسي 16S. وأظهرت النتائج أن التذبذب اليومي لمحات الميكروبية دون اضطراب المضادات الحيوية كان في حده الأدنى، وكانت ملامح تصنيف البكتيريا الشائعة المرتبطة CF-مماثل إلى حد كبير بين المكتبات 16S rDNA وmetagenomes المتولدة من تحلل منخفض التوتر (HL) DNA -derived. ومع ذلك، فإن الاختلافات بين 16S rDNA ملامح تصنيفية ولدت من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة تشير إلى أن تحلل منخفض التوتر والخطوات غسل تستفيد ليس فقط إزالة DNA المستمدة من الإنسان، ولكن أيضا extracellul الميكروبية المشتقةDNA AR التي قد تحريف لمحات الميكروبية الفعلية.

Introduction

وقد تم التحقيق في المجتمعات الفيروسية والجرثومية المرتبطة جسم الإنسان على نطاق واسع في العقد الماضي من خلال تطبيق تقنيات التسلسل 1،2. وقد أدت النتائج إلى الاعتراف الميكروبات أهمية في صحة الإنسان والمرض. وجاءت مبادرة رئيسية من المشروع الإنساني microbiome التي تصف البكتيريا (وبعض العتيقة) المقيمين على جلد الإنسان، وداخل تجاويف الفم والمجاري التنفسية والجهاز البولي التناسلي، والجهاز الهضمي 3. وقد أظهرت الدراسات microbiome مزيد من الخطوط الجوية البشرية السليمة من خلال غسل القصبات (BAL) 4،5 ومسحات البلعوم 4 أن الرئة يمكن أن تكون بمثابة جهاز أخذ العينات البيئية، والنتائج في الاستعمار الميكروبي عابرة في الشعب الهوائية. ومع ذلك، فإن تأثير الاستعمار الميكروبي في السطوح مجرى الهواء ضعاف يمكن أن يؤدي إلى التهابات الرئة الحادة والمزمنة، مثل تلك التي ظهرت في التليف الكيسي (CF) من المرضى.

ر "> CF هو مرض وراثي مميت الناجمة عن طفرة في التليف الكيسي عبر الغشاء منظم (CFTR) الجينات 6. هذه الطفرات تؤدي إلى البروتينات CFTR المعيبة التي تؤثر بدورها على نقل أيون بطريق الظهارة عبر سطح قمية من ظهارة. ويؤثر هذا المرض نظم الجهاز متعددة، ولكن الغالبية العظمى من الوفيات والمراضة تعزى إلى أمراض الرئة CF 7. ويوفر CF الرئة نظام بيئي فريد من نوعه للاستعمار الميكروبي. وخلل في نقل أيون يسبب المخاط لبناء في الشعب الهوائية CF، وخلق microenvironments تتكون من الهوائية ، microaerophilic، ومقصورات اللاهوائية الراسية التي كتبها ثابت الغنية بالمغذيات سطح الغشاء المخاطي. تسهل هذه البيئة الاستعمار وانتشار الميكروبات، بما في ذلك الفيروسية والبكتيريا والفطريات. الحادة والالتهابات الرئوية المزمنة الميكروبية يؤدي إلى استجابات مناعية مستمرة ولكن غير فعالة، مما أدى إلى إعادة عرض واسعة مجرى الهواء، وفقدان القدرة الرئوية، وpulmo في نهاية المطاففشل نارى.

المجتمعات البكتيرية المرتبطة CF الرئة وقد وصفت جيدا باستخدام كل الأساليب التي تعتمد على ثقافة والثقافة المستقلة، والتي تشمل استخدام 16S RNA الريباسي (الرنا الريباسي) التسلسل الجيني 8 و metagenomics بندقية 9،10. النهج القائم على الرنا الريباسي-16S قادر على تميز مجموعة واسعة من الأنواع الميكروبية والتقاط تحولات واسعة في تنوع المجتمع. ومع ذلك، فإنه يقتصر في قرارها في تحديد المجتمعات (تلخيصها في كلايسون وآخرون. 2010 11 و) والتنبؤات من إمكانات التمثيل الغذائي تقتصر على تلك الوظائف العامة المعروفة لالأصناف التي تم تحديدها. ولذلك، 16S الرنا الريباسي طرق التسلسل الجيني غير كافية لالضرورية التصنيفية والوظيفية دقة تحليلية من المجتمعات الميكروبية المتنوعة الموجودة في CF الرئتين. النهج ميتاجينومية الموصوفة هنا يكمل النهج القائم على الرنا الريباسي-16S، يتغلب على حدودها، وتمكن وسيلة فعالة نسبيالتحليل كل من التصنيف المجتمع الميكروبي ومحتويات الوراثية في CF الرئتين.

DNA الميكروبات المعزولة من عينات المرتبطة الحيوان غالبا ما يحتوي على كمية كبيرة من الحمض النووي المضيف. تحتوي البلغم أو أنسجة الرئة عينات CF عادة كمية كبيرة من الحمض النووي البشري الصادرة عن العدلات في الاستجابة المناعية، في كثير من الأحيان أكثر من 99٪ من إجمالي DNA 12-14. ورغم أن بعض الخلايا البشرية سليمة قد تكون موجودة، ومعظم هذه DNA هو حر في حل أو كثف على سطح الميكروبات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن وجود شمعات لزجة استثنائي المخاط، والحطام الخلوي، وغيرها من الملوثات غير معروفة تزيد من تعقيد عزل الخلايا الميكروبية. تم اختبار عدة طرق لالمستنفدة هذه عينات من الحمض النووي البشري، بما في ذلك التدرجات Percoll إلى الإنسان منفصل عن الخلايا الميكروبية 15، والمعاملة مع الدناز I، إيثيديوم بروميد monoazide أن تتحلل بشكل انتقائي DNA البشري 16، وعدة MolYsis، مع كل نجاح محدود. حتى الآن إجراء تنقية الحمض النووي الميكروبي الأكثر فعالية لCF البلغم وكان التعديل من عملية وصفها بريتنستاين وآخرون (1995) 17. هذا النهج، والمعروف هنا كما منخفض التوتر طريقة تحلل (HL)، يستخدم مزيجا من β المركابتويثانول للحد من الميوسين السندات ثاني كبريتيد، تحلل منخفض التوتر من الخلايا حقيقية النواة، والدناز I علاج DNA للذوبان 9. وعلى الرغم من عدم وجود بدائل أثارت طريقة HL بعض المخاوف نظرا ل(ط) التحيزات المحتملة الناتجة عن تحلل غير المرغوب فيها من الميكروبات و (ب) ما إذا كانت التقلبات الملحوظة في تكوين المجتمع 9،10 هي قطعة أثرية من الاختلافات المرتبطة تجهيز العينات. بالإضافة إلى توليد metagenomes بندقية، نعالج هذه القضايا من خلال مقارنة ملامح الجينات 16S الرنا الريباسي من الحمض النووي DNA الكلي والجراثيم المستخرجة من طريقة HL باستخدام نفس مجموعة من عينات البلغم التي تم جمعها من مريض واحد في سبعة أيام متتالية.

والأنف والحنجرة "> وبالمقارنة مع المجتمعات الميكروبية، وتوصيف المجتمعات الفيروسية المرتبطة مع الحيوانات محدود 18،19 اتسمت المجتمعات الفيروسية في CF الهوائية فقط الحد الأدنى 20 - 22 أول دراسة ميتاجينومية تميز DNA المجتمعات الفيروسية في CF الهوائية أظهرت أن معظم الفيروسات المرتبطة CF الرئتين هي فاجات 20، وكانت إمكانات التمثيل الغذائي من فج في CF والأفراد غير CF-اختلافا كبيرا. على وجه التحديد، قامت المجتمعات فج في الأفراد CF الجينات تعكس التعديلات المضيف البكتيرية لفسيولوجيا CF الهوائية، وأظهرت البكتيرية الفوعة 20. ميتاجينومية الدراسات اللاحقة للفيروسات في أنسجة الرئة CF التنوع المكاني واضح في المجتمعات الفيروسية بين المناطق التشريحية 22. وبالإضافة إلى ذلك، تؤوي الأنسجة CF الرئة أدنى التنوع الفيروسي لوحظ حتى الآن في أي نظام إيكولوجي 22. وكانت معظم الفيروسات التي تم تحديدها فاجاتمع احتمال أن تصيب مسببات الأمراض CF. ومع ذلك، تم الكشف أيضا الفيروسات مثل فيروس الهربس حقيقية النواة، الفيروسات الغدية، والفيروسات الورم الحليمي البشري (HPV). في حدث واحد، حيث لوحظت الخراجات في أنسجة الرئة أثناء تشريح، تم استرداد أكثر من 99٪ من الجينوم الورم الحليمي البشري، على الرغم من أن المريض تم تشخيص أبدا مع الورم الحليمي الرئوي أو سرطان. هذا يدل على أن التنوع الفيروسي الحاضر يعكس ليس فقط من شدة تلف الأنسجة، ولكن يمكن أيضا أن يعرض ويفسر مرض uncharacterized الأساسي. بروتوكولات الموصوفة هنا توفر طريقة بسيطة، لكنها قوية لعزل الجزيئات الفيروسية مثل (VLPs) من العينات التي تتكون من كميات كبيرة من المخاط السميك، المضيف والخلايا الميكروبية، DNA مجانا، فضلا عن الحطام الخلية.

واستكمالا لmetagenomics، يتم استخدام metatranscriptomics لمراقبة ديناميكية في التعبير الجيني في جميع أنحاء المجتمع الميكروبي والمضيف 9،23. في هذه الحالة، سواء الميكروبية وملتحقار مرنا تحتاج إلى أن يتم اختيار تفضيلي. منذ لا مذيل بعديد الأدينيلات من mRNAs البكتيرية، لا يمكن استغلال مرنا طريقة المنسدلة مقرها بنسبة ضئيلة من DT. تعتمد على تذييل بعديد الأدينيلات RNA التضخيم لا يمكن أن تستخدم في عينات المرتبطة المضيفة إذا ما يعرف العينات تحتوي على كميات كبيرة من مرنا حقيقية النواة. كثير من العينات المرتبطة الحيوان، بما في ذلك CF البلغم، وتحتوي على كثافة عالية من الخلايا، بالإضافة إلى كميات كبيرة من الحطام الخلوي وnucleases التي تشمل RNases. ولذلك، مهمة صعبة أخرى هي لمنع تدهور RNA واسعة النطاق خلال metatranscriptome المعالجة. في معظم الحالات، الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من البلغم CF هو المتدهورة جزئيا، مما يحد من التطبيقات المصب وفائدة من الحمض النووي الريبي مشتقة. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة نهج لاستنزاف الرنا الريباسي وتكييفها في مجموعات المتاحة تجاريا. فعالية هذه النهج ولكن يقتصر، وخاصة عند العمل مع متدهورة جزئيا الريباسي 9،24. الأساليب المستخدمة هنا تسمحإد لاسترجاع الحمض النووي الريبي مجموع المتدهورة جزئيا مناسبة للكفاءة التحويلية الإجمالية إزالة الرنا الريباسي. وقد تجلى المقارنة المباشرة من كفاءة في إزالة الرنا الريباسي من الحمض النووي الريبي مجموع المتدهورة جزئيا المقارنة بين اثنين من مجموعات مختلفة من قبل ليم وآخرون (2012) 9.

وعموما، فإن الهدف من هذا المخطوط هو توفير مجموعة كاملة من البروتوكولات (الشكل 1) لتوليد metagenomes بندقية الفيروسية والجرثومية، وmetatranscriptome، من عينة المرتبط حيوان واحد، وذلك باستخدام عينة البلغم الناجم عن كمثال على ذلك. وينبغي أن تتضمن سير العمل مختبر الجزيئية مناطق منفصلة قبل وبعد التضخيم للحد من التلوث المتبادل. أساليب قابلة للتكيف بسهولة إلى أنواع أخرى مثل عينة الأنسجة 22، البلعوم والفم والبلعوم مسحات 25، غسيل القصبات (BAL) والمرجان (بيانات غير منشورة). يجب معالجة كل عينة فور جمع وخصوصا عندما metagenomics الميكروبية والتقىوالمطلوب atranscriptomics الدراسات. إذا تم تجميد العينات، أنه يحد من عزل الخلايا الميكروبية سليمة لmetagenomes الميكروبي عن تجميد يحتمل تعطيل سلامة الخلية. ومع ذلك، لا يمنع تجميد metatranscriptomics والعزلة الفيروسية، ولكن نوعية من الحمض النووي الريبي وكمية من الجسيمات الفيروسية تعافى قد تتأثر من خلال عملية تجميد ذوبان الجليد. من المهم أن نلاحظ أن البلغم قد خدم يسببها كمصدر أساسي للعينات في العديد من الدراسات المرتبطة مع المرضى CF الكبار والأمراض الرئوية المزمنة الأخرى 26،27 كما BAL يمكن أن يكون الغازية أيضا. في دراساتنا، تم جمع عينات البلغم مع طريقة أخذ العينات دقيق وثابت، أي بعد غسول الفم والشطف من تجويف الفم باستخدام محلول ملحي معقم للحفاظ على تلوث الميكروبات عن طريق الفم داخل عينات البلغم إلى أدنى حد ممكن.

Protocol

تم جمع عينات البلغم المستحث وفقا لجامعة كاليفورنيا مجلس المراجعة المؤسسية (HRPP 081500) وجامعة ولاية سان دييغو مجلس المراجعة المؤسسية (IRB SDSU # 2121)، من قبل منسق الأبحاث في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو (جامعة كاليفورنيا سان دييغو: ملاحظة ) CF الكبار عيادة.

1. جمع العينات وما قبل المعالجة (عينات ما قبل علاج في غضون 30 دقيقة بعد مجموعة)

  1. قبل أخذ عينات جمع وتسمية أربعة 15 مل أنابيب على النحو التالي: (ط) metagenome الفيروسي، (ب) metagenome الميكروبي، (ج) metatranscriptome، و (د) البلغم إضافية. كرر لكل عينة. إضافة 2 مل من الخرز السيليكا 0.1 ملم في أنبوب المسمى "Metatranscriptome"، تليها 6 مل من مقرها ثيوسيانات-غوانيدين عازلة RNA تحلل (عازلة GITC-تحلل).
  2. أثناء جمع العينات، واستخدام محلول ملحي معقم (60 مل)، وشطف الفم للحد من التلوث عن طريق الميكروبات عن طريق الفم. جمع عينات البلغم على مدى فترة زمنية 30 دقيقة بعداستنشاق 4 مل من 7٪ ملحي مفرط التوتر عن طريق البخاخات. عينات العملية مباشرة، كما هو موضح أدناه.
  3. تمييع العينة إلى إجمالي حجم 8 مل.
    1. تقدير حجم العينة وزنها فارغة كوب البلغم قبل وبعد جمع العينات.
    2. إذا كان حجم العينة أقل من 8 مل، إضافة كمية مناسبة من تصفيتها ميكرون 0.02 برنامج تلفزيوني 1X لتوليد حجم العينة الكلي لللا يقل عن 8 مل.
    3. التجانس على الفور العينة مع حقنة 3 مل حتى لا تظل كتل مرئية داخل البلغم
    4. باستخدام نفس الحقنة، ووضع 2 مل من البلغم والشروع فورا إلى الخطوة 1.4.
  4. الحفاظ على مجموع RNA من البلغم عينة
    1. حقن 2 مل عينة البلغم من الخطوة 1.3.4 في "metatranscriptome" أنبوب يحتوي على حبات السيليكا وعازلة GITC-تحلل.
    2. إغلاق الغطاء وختم الأنبوب بشكل آمن مع بارافيلم لتجنب تسرب.
    3. التجانس البلغم فورا على سرعة متوسطة لمدة 10 ميلن. اعتمادا على vortexer المتاحة، ووضع أنبوب أفقيا وآمنة مع الشريط إذا لزم الأمر.
    4. إبقاء الأنبوب في 4 ° C أو في مربع الجليد والنقل إلى المختبر إذا لزم الأمر.
  5. باستخدام نفس الحقنة، قسامة 2 مل من البلغم كل في أنابيب المسمى "metagenome الفيروسي" و "metagenome الميكروبي" ونقل البلغم المتبقية من كأس البلغم في أنبوب المسمى "البلغم اضافية".
  6. تخزين جميع الأنابيب في 4 درجات مئوية أو مربع الجليد والنقل إلى المختبر إذا لزم الأمر.

2. توليد الفيروسية Metagenome

  1. إعداد مخازن والحلول
    1. إعداد 50 ملي dithiothreitol (DTT) في وقت مبكر وتخزينها في 4 ° C. هذا هو مستقر لمدة 2 أسابيع.
    2. إعداد المالحة المغنيسيوم (SM) عازلة (250 مل): 1 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgSO 4، 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. فلتر تعقيم (0.02 ميكرون حجم المسام) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. إعداد الدناز I انزيم إلى 100 U / ميكرولتر (في الماء الصف الجزيئية) من مجفف بالتجميد البقري البنكرياس الدناز I حسب النشاط يحددها دورناز وحدة / ملغ الوزن الجاف.
    3. إعداد 10X الدناز أنا العازلة (50 مل): 100 ملم MgCl 2 و 20 ملي CaCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.5. فلتر تعقيم (0.02 ميكرون حجم المسام) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    4. إعداد بارافورمالدهيد 4٪.
    5. إعداد 200X TE العازلة: 2 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.5)، 0.2 M EDTA. فلتر تعقيم (0.02 ميكرون حجم المسام) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    6. إعداد 10 مل من 10٪ من الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) باستخدام الماء الصف الجزيئية.
    7. تجهيز 50 مل CTAB / كلوريد الصوديوم (10٪ CTAB 700 مم كلوريد الصوديوم) باستخدام الماء الصف الجزيئية. حل CTAB بين عشية وضحاها. إذا استمرت الرواسب، وتسخين الحل عند 65 درجة مئوية. الحل هو لزج جدا في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إن الترشيح من المخازن المؤقتة باستخدام 0.02 ميكرون فلتر يسمح إزالة الجسيمات الفيروسية مثل داخل الحل، ولكن ليستلوث الحمض النووي مجانا.
  2. عينة ما قبل المعالجة
    1. إعداد كمية مناسبة من الطازجة 6.5 ملي dithiothreitol (DTT).
    2. تمييع جناسة بإضافة تصفيتها ميكرون 0.02 عازلة SM لتوليد الحجم الكلي لل6 مل.
    3. للمساعدة في حل المخاط، إضافة حجم مساو (6 مل) من 6.5 ملي dithiothreitol (DTT) على عينة، دوامة بقوة لخلط واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
    4. دوامة العينة تعامل بقوة وتدور في 10 ° C، 3،056 x ج لمدة 15-20 دقيقة.
    5. جمع طاف في أنبوب جديد 15 مل.
    6. كرر الخطوة 2.2.3 و2.2.5 للعينة القادمة.
    7. نقل وتصفية طاف مع 0.45 ميكرون فلتر شنت على الحقنة في أنبوب جديد 15 مل.
      ملاحظة: إذا كان انسداد فلتر، استرداد عينات من حقنة أو تهمل الخطوة الترشيح.
    8. أخذ عينة فرعية 100 ميكرولتر من العينة التي تمت تصفيتها ميكرون 0.45، نفذ الكلوروفورم والدناز I العلاج (انظر حد ذاتهاction 2.3.12-2.3.15) وإضافة حجم مساو من بارافورمالدهيد 4٪ لإصلاح عينة لالمجهر epifluorescence (الشكل 2A).
    9. لنهج التخصيب الجسيمات الفيروسية "اللحاق جميع" (انظر مناقشة)، انتقل إلى الخطوة 2.3.12 لحذف الجسيمات الفيروسية اختيار على أساس السيزيوم كلوريد التدرج تنبيذ فائق. ومع ذلك، فإن هذا قد يؤدي إلى التلوث الجرثومي مقاومة للالكلوروفورم ومبلغ أعلى من الحمض النووي المضيفة في المحللة الفيروسي.
  3. الجسيمات الفيروسية مثل (VLPs) إثراء وتنقية
    1. إعداد الأفراد كلوريد السيزيوم (CSCL) حلول عن طريق إذابة كمية مناسبة من CSCL مع العازلة غير مفلتر SM لكثافة المطلوب (1.7 غرام / مل، 1.5 غرام / مل، 1.35 جم / مل، و 1.2 غرام / مل). تصفية كل حل من خلال مرشح 0.02 ميكرون قبل استخدامها.
    2. إعداد CSCL التدرج كما هو مبين في الشكل 2B.
    3. تحميل 1 مل من 1.7 غرام / مل في كل أنبوب، تحميل 1 مل من 1.5 غرام / مل في كل أنبوب، تحميل 1 مل من 1.35 ز/ مل في كل أنبوب، تحميل 1.2 غرام / مل في كل أنبوب (اختياري)، وأخيرا تحميل عينة 6-8 مل في أنبوب المعنيين. طبقات الفردية علامة للدلالة على موقع كل جزء.
    4. تحقيق التوازن بين كل زوج معارضة من الأنابيب لفي حدود 1 ملغ.
    5. تحميل بعناية كل أنبوب في دلو زيادة ونقصان. تدور كل دلاء حتى لو كانت فارغة. تحميل دلو تدور على الدوار.
    6. الطرد المركزي في 82844 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
    7. بعد الطرد المركزي، وإزالة بعناية الأنابيب من حامل دون تعطيل تدرجات الكثافة.
    8. باستخدام حقنة 3 مل مع إبرة G 18، يخترق أنبوب أسفل ز / مل طبقة كثافة 1.5 (الشكل 2، السهم الأحمر) وسحب ~ 1.5 مل في حقنة.
    9. جمع جزء العلوي عن طريق إزالة ببطء الإبرة والسماح للجزء المتبقي في الأنبوب أن يتقطر في أنبوب جديد 15 مل من خلال ثقب. تسمية هذا ب "النفايات جزء العلوي".
    10. جمع 1.5 غرام / مل fractioن (التي تحتوي على VLPs) من الحقنة قبل إخراج محتويات إلى قسمين أنابيب microfuge جديدة.
    11. كرر الخطوة 2.3.8-2.3.10 لجميع العينات.
    12. إضافة 0.2 حجم الكلوروفورم في التركيز الفيروسي، ويهز بقوة، في احتضان RT لمدة 10 دقيقة، وتدور في أقصى سرعة لمدة 5 دقائق، وجمع المرحلة المائية.
    13. إضافة العازلة 10X الدناز والدناز I (تركيز النهائي = 2.5 U / ميكرولتر) في التركيز الفيروسي المعالجة الكلوروفورم، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة.
    14. تعطيل النشاط الدناز عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    15. إزالة 15 ميكرولتر من chloroform- والدناز I المعاملة جزء الفيروسي في أنبوب جديد وإضافة 15 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ لإصلاح عينة لالمجهر epifluorescence.
  4. استخراج الحمض النووي
    1. تجمع مركزات الفيروسية من كل عينة إلى 50 مل أوك ريدج عالية السرعة أنبوب الطرد المركزي تنظيفها وتعقيمها.
    2. إضافة ما يلي: 0.1 حجم 200X TE العازلة، 10 ميكرولتر 0.5 M EDTA لكل مل من لياليوافرة، 1 حجم الفورماميد، و 10 ميكرولتر الجليكوجين. تخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    3. باستخدام وحدات تخزين جديدة، إضافة 2 مجلدات من درجة حرارة الغرفة 100٪ من الإيثانول. تخلط جيدا واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    4. DNA التكوير من خلال الدوران الأنبوب في 17226 x ج لمدة 20 دقيقة، في 4 درجات مئوية باستخدام SS-34 الدوار.
    5. تجاهل طاف بعناية باستخدام ماصة المصلية. يغسل بيليه مرتين مع الثلج الباردة الايثانول 70٪.
    6. إزالة أكبر قدر من السائل ممكن والسماح للبيليه إلى الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    7. Resuspend وبيليه الحمض النووي في 567 ميكرولتر من 1X TE العازلة (درجة الحموضة 8.0).
      ملاحظة: اسمحوا 15 دقيقة على الأقل لإعادة تعليق كامل في درجة حرارة الغرفة. تخزين DNA معلق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.
    8. نقل كامل 567 ميكرولتر من محلول الحمض النووي معلق في أنبوب جديد 1.5 مل microfuge. إضافة 30 ميكرولتر من قبل تحسنت بنسبة 10٪ SDS و 3 ميكرولتر من بروتين K (20 _6؛ ز مل /)، تخلط جيدا واحتضان لمدة 1 ساعة على 56 درجة مئوية. قبل دافئة CTAB / كلوريد الصوديوم عند 65 درجة مئوية.
    9. إضافة 100 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم وتخلط جيدا. إضافة 80 ميكرولتر من حل CTAB / كلوريد الصوديوم قبل تحسنت، دوامة، واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
    10. إضافة حجم مساو من كلوروفورم، دوامة خلط، وتدور في 16،100 x ج لمدة 5 دقائق.
    11. طاف لنقل 1.5 مل microfuge أنبوب جديد. إضافة حجم مساو من الفينول / الكلوروفورم، دوامة خلط، وتدور في 16،100 x ج لمدة 5 دقائق.
    12. طاف لنقل 1.5 مل microfuge أنبوب جديد. إضافة حجم مساو من كلوروفورم، دوامة خلط، وتدور في 16،100 x ج لمدة 5 دقائق.
    13. طاف لنقل 1.5 مل microfuge أنبوب جديد. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول إلى جزء طاف، مزيج، واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    14. بيليه DNA، وتدور في 16،100 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. ماصة قبالة طاف بعناية ويغسل بيليه مرتين مع الثلج الباردة الايثانول 70٪. أداء تدور القصير وإزالة الإيثانول المتبقية من الأنبوب. الهواء الجاف بيليه لمدة 15 دقيقة.
    15. Resuspend وبيليه الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من شطف العازلة (5 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.5). السماح بيليه لترطيب لمدة 5 دقائق على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
    16. قياس الحمض النووي باستخدام مقايسة على أساس مضان ذات حساسية عالية.
  5. التضخيم باستخدام Phi29 البلمرة (اختياري)
    1. إعداد 2X عازلة الصلب: 80 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، و 20 ملي MgCl 2.
    2. تمييع Phi29 DNA بوليميريز إلى 5 U / ميكرولتر.
    3. قبل المزيج عينة العازلة، التي تتألف من 50 عشوائي ميكرولتر التمهيدي مسدوس (100 ميكرومتر)، 125 عازلة الصلب 2X ميكرولتر و 25 ميكرولتر المياه. قسامة وتخزينها في -20 ° C.
    4. قبل المزيج رد فعل العازلة، التي تتألف من 100 ميكرولتر Phi29 10X العازلة، 40 ميكرولتر 10 ملي dNTPs، و 560 ميكرولتر المياه. قسامة وتخزينها في -20 ° C.
    5. إضافة 1 ميكرولتر الحمض النووي القالب إلى 4 ميكرولتر عينة العازلة.
    6. احتضان عشرخليط ه في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وباردة على الجليد.
    7. إضافة 14 ميكرولتر من رد فعل العازلة في خليط من 2.4.4، مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    8. إضافة 1 ميكرولتر من Phi29 DNA البلمرة، مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 18 ساعة تليها 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    9. تنظيف ردود الفعل باستخدام أعمدة الحمض النووي الجيني أو الفينول / الكلوروفورم والأمطار الايثانول.
  6. المجهر epifluorescence (راجع هاس وآخرون. 2014 28 لإعداد نظام الترشيح)
    ملاحظة: بعد عزل وتنقية، المجهري epifluorescence مع الأصباغ الحمض النووي يمكن استخدامها للتحقق من وجود ونقاء من الجسيمات الفيروسية في عينات (أرقام 2A و 2C). DNA مجانا في العينة يمكن أن تؤدي إلى ارتفاع مضان الخلفية. لذلك، يجب أن تكون عينة الدناز I المعاملة قبل التثبيت وتلطيخ للالميكروسكوب.
    1. يعد حل جبل (0.1٪ حمض الاسكوربيك، 50٪ الجلسرين). إضافة 100 ميكرولتر من 10٪ حمض الاسكوربيك إلى 4.9 مل من الفوسفات 1X مخزنة المالحة (PBS)، تخلط جيدا. إضافة 5 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ إلى الخليط، وتخلط جيدا وتسمية أنبوب باسم "جبل".
    2. مرشح جبل باستخدام 0.02 ميكرون مصفوفة الألومينا مرشح الحقنة، قسامة في أنابيب microfuge، وتخزينها في -20 ° C.
    3. قسامة 100 ميكرولتر من العينة في أنبوب microfuge جديدة وإضافة حجم مساو من بارافورمالدهيد 4٪ لإصلاح VLPs. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    4. جعل يصل حجم 1 مل وذلك بإضافة 800 ميكرولتر من 0.02 ميكرون تصفية المياه. إضافة 1 ميكرولتر من SYBR الذهب وصمة عار في أنبوب ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    5. إعداد نظام الترشيح عن طريق تشغيل المضخة فراغ بين -9 -10 ورطل (-62.1 -68.9 كيلو باسكال و).
    6. غسل التمثال مع الماء ومكان 0.02 ميكرون تصفية الألومينا مصفوفة مع عصابة دعم البولي بروبلين الحلقي إلى قاعدة التمثال فلتر.
    7. وضع برج مرشح على رأس التمثال فلتر مع فلتر وآمنة مع المشبك.
    8. ماصة المحتويات من 1.5 مل microfuge أنبوب في برج التصفية، والسماح لبضع دقائق لعينة لتصفية من خلال.
    9. التسمية وماصة 10 ميكرولتر من جبل الكاشف في شريحة مجهرية.
    10. ترك الفراغ في حين إزالة البرج مرشح والمشبك.
    11. إزالة بعناية مرشح من قاعدة التمثال تصفية وصمة عار على الجزء السفلي من التصفية مع Kimwipe، ثم وضع فلتر مباشرة على قمة جبل على الشريحة المجهرية.
    12. ماصة 10 ميكرولتر آخر من جبل الكاشف على مرشح ووضع ساترة على التصفية.

3. توليد الميكروبية Metagenome

  1. إعداد مخازن والحلول
    1. تجهيز 50 مل من العازلة 1X الدناز: 50 ملي NaAc، 10 ملي MgCl 2، 2 مم CaCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 6.5. فلتر تعقيم (0.22 ميكرون) وتخزينهافي درجة حرارة الغرفة.
    2. إعداد الدناز I انزيم إلى 1000 U / ميكرولتر (في الماء الصف الجزيئية) من مجفف بالتجميد البقري البنكرياس الدناز I حسب النشاط يحددها دورناز وحدة / ملغ الوزن الجاف.
    3. إعداد 100 مل من SE عازلة: 75 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي EDTA. ضبط درجة الحموضة إلى 7.5. فلتر تعقيم (0.22 ميكرون) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. عينة ما قبل المعالجة قبل استخراج الحمض النووي
    1. تمييع جناسة عن طريق إضافة 5 مجلدات من تصفيتها ميكرون 0.22 برنامج تلفزيوني 1X. على سبيل المثال، إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى 2 مل من العينة.
    2. إضافة β المركابتويثانول إلى 2٪ (ت / ت) التركيز النهائي. صخرة الخليط (في غطاء محرك السيارة الكيميائية) في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    3. تدور العينة في 10 ° C و3،056 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل طاف.
    4. Resuspend وبيليه في 10 مل من الماء الصف الجزيئية (أو 0.22 ميكرون تصفية المياه)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    5. كرر الخطوات من 3.2.3 و3.2.4 مرة واحدة.
    6. الصبانن في 10 ° C و3،056 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل طاف.
    7. Resuspend وبيليه في 5 مل 1X الدناز العازلة وإضافة 15 ميكرولتر الدناز I (1،000 U / ميكرولتر) لكل مل من العينة.
    8. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الخلط المتكرر لمدة 2 ساعة.
    9. تعطيل النشاط الدناز عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    10. تدور في 10 ° C و3،056 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 10 مل SE العازلة.
    11. كرر الخطوة 3.2.10.
    12. تدور في 10 ° C و3،056 x ج لمدة 15 دقيقة، وتجاهل طاف.
    13. Resuspend وبيليه في 2 مل SE العازلة، ونقل إلى اثنين من أنابيب microfuge.
    14. بيليه الخلايا في أنابيب microfuge. تدور الأنابيب في 16،100 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
    15. إزالة طاف واستخراج DNA من الخلايا مكعبات باستخدام الحمض النووي عدة استخراج الجينومية، والبروتوكول الاختلاف إيجابية الجرام.

4. توليد Metatranscriptome

  1. عينة قبل، علاج
    1. أداء تحلل الميكانيكية من الخلايا عن طريق الضرب حبة في المخزن GITC-تحلل مباشرة بعد جمع العينة والتجانس. راجع الخطوة 1.4.
    2. تدور الخليط في 4 درجات مئوية و 600 x ج لمدة 5 دقائق لتكوير حبات السيليكا.
    3. نقل طاف في أنبوب جديد.
    4. إضافة 200 ميكرولتر من كلوروفورم لكل 750 ميكرولتر من العازلة GITC-تحلل المستخدمة، ويهز بقوة باليد لمدة 15 ثانية، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة، وتدور في 4 ° C و3،056 x ج لمدة 15 دقيقة. خلال هذه 15 دقيقة تدور، وإعداد للخطوة 4.2.
    5. بعد دقيقة تدور 15 (فصل واضح من أشكال المرحلة مرحلة الطور البيني العضوية المائية)، واستخراج المرحلة المائية (بدون تعطيل البيني) في جديد خال من ريبونوكلياز أنبوب (ق).
      ملاحظة: المرحلة المائية تحتوي على الحمض النووي الريبي. إبقاء الأنابيب على الجليد حتى الخطوة التالية.
  2. أداء الكلي استخراج الحمض النووي الريبي وتنقيتها باستخدام أدوات تنقية RNA المتاحة تجاريا القائم على عمود أو conventional القائم على الأيزوبروبانول RNA هطول الأمطار.
    1. RNA تنقية القائمة على العمود السيليكا
      1. قياس الحجم الكلي للجزء مائي الحصول عليها.
      2. إضافة حجم مناسب من العازلة ملزم RNA لعينة وتخلط جيدا.
      3. ضبط المزيج على المناسبة شرطا ملزما وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة. تخلط جيدا والقيام تدور القصير.
      4. تحميل الخليط في عمود RNA. لعينة كبيرة الحجم، استخدم تحميل متعددة وتحميل كل عمود حتى 4x. خلاف ذلك، والنظر في استخدام أعمدة متعددة لكل عينة.
      5. غسل العمود بشكل مناسب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      6. أزل RNA مع لا يقل عن 30 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه. سوف المزدوج شطف زيادة طفيفة العائد من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، وهذا سوف يخفف من تركيز الحمض النووي الريبي.
      7. قياس تركيز الحمض النووي الريبي والانتقال مباشرة إلى الدناز I العلاج. استخدام Bioanalyzer للتحقق من الجودة من الحمض النووي الريبي (مستحسن).
      8. RNA الهطول
        1. إضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول (على سبيل المثال، 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى 500 ميكرولتر من جزء مائي) و 2 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / ميكرولتر ريبونوكلياز خالية الجليكوجين للعينة.
        2. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
        3. تدور في 12،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
        4. إزالة بعناية طاف، إضافة 1 مل من ريبونوكلياز خالية 75٪ من الإيثانول. تدور الخليط في 7،500 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للتأكد من بيليه سليمة.
        5. إزالة الإيثانول بعناية.
        6. كرر الخطوات من 4.2.2.4 4.2.2.5 ومرة ​​واحدة.
        7. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة.
        8. ترطيب بيليه في 50 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه، في احتضان 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والانتقال مباشرة إلى العلاج الدناز. استخدام Bioanalyzer للتحقق من الجودة من الحمض النووي الريبي (مستحسن).
        9. متجر الحمض النووي الريبي في aliquots في -20 درجة مئوية، أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

Representative Results

Metagenomes الفيروسية

CF البلغم اللزج هو استثنائي ويحتوي على كمية عالية من الميوسين وDNA الحر (الشكل 2A)؛ وتنبيذ فائق الكثافة التدرج يسهل القضاء على المشتقة المضيف DNA (الشكل 2B). وتتلخص النتائج من دراسة سابقة تبين 9 ثمانية viromes الناتجة عن سير العمل المقدمة هنا (الجدول 1). تم معالجتها كما هو موضح في القسم الوارد 2. viromes ولدت قليلا (0.02، سبع عينات (الجدول 1 CF1-D، CF1-E، CF1-F، CF4-B، CF4-C، CF5-A، وCF5-B) ٪ -3.7٪) تسلسل المستمدة الإنسان مع استثناء واحد فقط (70٪). CF4-A حذفت من الخطوة كثافة التدرج تنبيذ فائق (CF4-A) وvirome المتولدة من هذه العينة المحددة الواردة> 97٪ تسلسل المستمدة البشرية (الجدول 1). يبين الشكل 2 مثالا للصورة المجهر epifluorescence من نموذجي CF sputuم عينة قبل (الشكل 2A) وبعد (الشكل 2C) الكثافة التدرج تنبيذ فائق. وقد لوحظت الجسيمات الفيروسية مثل اضحة (VLPs) في الميكروسكوب دون الجزيئات الكبيرة عقب فصل كثافة التدرج. بعد استخراج الحمض النووي VLPs، وغالبا ما يتم اختبار التلوث البكتيري باستخدام 16S rDNA التضخيم قبل تسلسل VLPs DNA.

الميكروبية Metagenomes

تم جمع سبع عينات البلغم المقدمة هنا من مريض CF واحد في سبعة أيام متتالية. بدأ المريض على المضادات الحيوية عن طريق الفم (سيبروفلوكساسين ودوكسي) يوم 3 بعد أن تم جمع البلغم. وكان حجم كل عينة البلغم تم جمعها من هذا المريض 15 مل طوال 7 أيام؛ وبالتالي، لم يتم إضافة PBS للعينة. وكان الهدف من هذا الحدث أخذ العينات لتقييم البروتوكولات التي قدمت في هذا العمل من قبل (ط) تقييم التذبذب اليومي للبنية المجتمع الميكروبي، و (ثانيا) مقارنةبنية المجتمع الميكروبي وقرار بين metagenomics و16S rDNA التسلسل. ولذلك، تم استخراج DNA الكلي وHL-DNA من كل عينة.

يتم تقديم تركيز الحمض النووي HL من كل عينة البلغم التالية استخراج DNA في الجدول 2. العائد الكلي للHL-DNA تراوحت من 210 نانوغرام إلى> 5 ميكروغرام. تم إنشاؤها المكتبات التسلسل البورشيد بمادة انطلاق إجمالية قدرها 1 نانوغرام لكل عينة (الشكل 3). وتعرض خصائص البيانات metagenomics في الجدول 2. ولكن جميع أسفرت عن مكتبة واحدة تم الإبقاء أكثر من 1 مليون متواليات وأكثر من 85٪ تسلسل جودة عالية على تجهيزها البيانات باستخدام برنامج PRINSEQ 29. تم preprocessed جميع قواعد البيانات أولا لإزالة التكرارات ومتواليات من جودة منخفضة (درجة لا تقل جودة 25)، تليها مزيد من الفحص وإزالة متواليات المستمدة الإنسان باستخدام DeconSeq 30. كمية البشري ديتلوث تسلسل rived يعتمد اعتمادا كبيرا على خصائص العينة. هنا، تراوح المبلغ الإجمالي للتسلسل المستمدة الإنسان 14-46٪ (الجدول 2). وكان تسلسل preprocessed ثم المشروح باستخدام خط أنابيب Metaphlan 31 وكذلك MG-32 RAST الخادم.

بالإضافة إلى metagenomes، تم إنشاء المكتبات amplicon 16S rDNA من كل من DNA الكلي وHL-DNA عبر الاشعال تستهدف ما يقرب من 300 نقطة أساس في منطقة متغيرة V1-V2 في الجينات 16S الرنا الريباسي 33،34. كانت منتجات PCR من عينات فردية تطبيع ومجمعة للتسلسل باستخدام البورشيد 500 دورة إقران نهاية التسلسل التي تجرى على منصة MiSeq. تم فرز تقرن نهاية 16S rDNA تسلسل amplicon من قبل عينة عن طريق الباركود باستخدام برنامج نصي الثعبان ويقرأ تم تجميعها المقترنة باستخدام phrap 35،36. وقلص نهايات تسلسل تجميعها حتى كان متوسط ​​درجات الجودة ≥20 باستخدام إطار 5 الإقليم الشمالي. كانت الوهم المحتملةن إزالتها باستخدام Uchime 37 ضد مجموعة فرعية خالية من الوهم من متواليات إشارة SILVA 38. كلف Taxanomy إلى جودة عالية يقرأ مع SINA 39 (الإصدار 1.2.11) باستخدام تسلسل البكتيرية 418497 من قاعدة البيانات SILVA 38. تم تجميع سلاسل مع مهام التصنيفية متطابقة لإنتاج وحدات تصنيفية التشغيلية (OTUs). وولدت هذه العملية 1655278 متواليات ل16 عينة (متوسط ​​حجم: 103455 متواليات / العينة؛ دقيقة: 72603، ماكس: 127113). وكانت السلع الوسيطة درجة التغطية، وهو مقياس لاكتمال التسلسل، ≥ 99.9٪. تم استخدام حزمة البرامج Explicet 40 (v2.9.4، www.explicet.org) للتحليل وتوليد الرقم. تم حساب التنوع ألفا (داخل عينة) والتنوع بيتا (بين العينة) في Explicet عند نقطة والفراغ من 72603 متواليات مع 100 التمهيد إعادة عينات.

كان السؤال الأول مستهدفة من قبل هذه الدراسة ما إذا نقص الضغط تحلل preferentiحليف يختار ل(أي، يحتفظ أو lyses تفضيلي) مجموعات معينة من الميكروبات. بعد أول تحلل منخفض التوتر، تم subsampled خلايا مكعبات إعادة معلقة من العينتين الأولى (CF1-1A * وCF1-2A *) للمقارنة مع نفس العينات بعد تحلل منخفض التوتر الثاني (CF1-1and CF1-2). تم علاج جميع العينات بالتساوي، أي، وتعامل مع الدناز I قبل استخراج الحمض النووي، تليها استخراج الحمض النووي وخط أنابيب التسلسل. كما هو مبين في الشكل (4)، لمحات الميكروبية من العينات الفرعية متشابهة للغاية للعينات بعد اثنين من العلاجات تحلل ناقص التوتر. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحلل منخفض التوتر الثاني يزيد من جزء من تسلسل غير البشرية من قبل 6-17٪ في غضون metagenomes (الجدول 2).

لاختبار الاختلافات في التركيب الميكروبي بين metagenomic- والتنميط القائم rDNA-16S، وإجراء تغييرات قبل وبعد تحلل منخفض التوتر التي قد تفسر الاختلافات التي شوهدت في السابق بين عشيق لديناالمنشأ وغيرها، وقد تم توليد البكتيرية المكتبات التسلسل 16S rDNA من كل من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة (الشكل 4B). على مستوى جنس، كانت ملامح التصنيف من البكتيريا المرتبطة CF الشائعة مثل الزائفة، Stenotrophomonas، Prevotella، الفيونيلة، والعقدية مماثلة إلى حد كبير بين المكتبات 16S rDNA وmetagenomes المتولدة من DNA المستمدة HL. ومع ذلك، كان الكشف الروثية في المكتبات 16S rDNA يست وفيرة كما مع المكتبات ميتاجينومية. وعند مقارنة ملامح تصنيفية 16S rDNA المتولدة من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة، الزائفة كانت ممثلة بشكل مختلف في DNA الكلي مقارنة الحمض النووي انطلاق المستمدة HL من يوم 3.

Metatranscriptomes

عادة، والحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من البلغم CF هو المتدهورة جزئيا وحجم يتراوح بين 25-4،000 نقطة أساس (أرقام 5A و وآخرون 2012 9. جزء من الرنا الريباسي داخل metatranscriptomes غير المنضب يتراوح 27-83٪، والوفرة النسبية للالريباسي تنوعت عبر عينات (الجدول 3؛ البيانات المستخرجة من ليم وآخرون 9). ومع ذلك، واستنزاف مع RIBO-صفر طقم انخفض rRNAs الوفرة النسبية للالريباسي إلى 1-5٪ باستثناء عينة CF1-F. الاختلاف في فعالية إزالة الرنا الريباسي يمكن أن تعكس نوعية من الحمض النووي الريبي المستخرج، أو الاختلافات في الميكروبي الحاضر مجتمع وبالتالي الوصول إلى rRNAs للتحقيقات التهجين 9. وelectropherograms من ناجحة (الشكل 5B) وغير ناجحة (الشكل 5D) الريباسي إجراء الإزالة باستخدام إزالة عدة RIBO-صفر الريباسي تختلف، وعند هذه القمم الريباسي مرئية في إزالة ناجحة.

نطاق حجم [كدنا المكتبات جنرال الكتريكغالبا ما يعكس nerated مدى حجم عينة الحمض النووي الريبي ابتداء. تم إنشاء مكتبات [كدنا المعروضة هنا مع كامل طقم Transcriptome على التضخيم (WTA2) عند نضوب الريباسي تليها روش-454 إعداد مكتبة التسلسل 9. ولدت [كدنا] يحتوي على شظايا تتراوح بين 50-4،000 نقطة أساس (أرقام 5E و5F) وغير متسقة للغاية عبر عينات (ليم وآخرون 2012) 9. توافر RNA تسلسل مجموعات أخرى إعداد مكتبة منصة محددة توفر حاليا المزيد من الخيارات البديلة لأحد أن الجمع بين التوليف [كدنا وإعداد مكتبة التسلسل في الظروف المثلى. خيار واحد الموصى بها لتاريخ هو ScriptSeq كيت الذهب كاملة الجمع بين الريباسي الكواشف إزالة الموصى بها أعلاه وRNA يليها إعداد مكتبة و.

الشكل (1)
الشكل 1: سير العمل لالإعدادية aration العينات المرتبطة المضيفة، مثل عينة البلغم، لvirome، microbiome، وmetatranscriptome التسلسل.

الشكل 2
الشكل 2: السيزيوم كلوريد التدرجات كثافة تنبيذ فائق تسهيل القضاء على DNA خارج الخلية والجزيئات الكبيرة (A)، والسماح لعزل المثلى من الجسيمات الفيروسية مثل CF-من البلغم. والطبقات واحد ملليلتر من كل التدرج فوق بعضها قبل البعض لتحميل عينة معاملة ما قبل (B). وتستخدم الجسيمات التالية العزل والتنقية، والمجهر epifluorescence مع الأصباغ الحمض النووي مثل SYBR الذهب للتحقق من وجود ونقاء من الجسيمات الفيروسية في العينات. وقد لوحظت بعد التدرج الكثافة فصل CF عينة البلغم، الجسيمات الفيروسية مثل اضحة (السهم الأبيض C).

المحافظة على together.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
وقد تم مثال لتوزيع حجم المكتبات Nextera XT المتولدة من 1 نانوغرام من HL-DNA التي أسفرت عن microbiomes البلغم CF تطبيع مكتبة، وتجميع، وتحميل كمية كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة دون أي انحراف: الرقم 3.

الشكل (4)
الشكل 4: تحليل التصنيفية من المجتمعات الميكروبية في تسع عينات تم جمعها طوليا من CF واحد مريض (A) لمحات الميكروبية على أساس المكتبات ميتاجينومية الناتجة عن تحلل منخفض التوتر DNA القائم على الأسلوب.. واستند الاحالة الأنواع على Metaphlan تجهيزها بيانات خط أنابيب التالية التي تعمل على إزالة التكرارات وتسلسل مع جودة منخفضة والتماثل تسلسل البشري. من أجل إظهار أن اثنين من الحاديEPS تحلل منخفض التوتر لم تفضيلي يختار لفئات معينة من الميكروبات، العينات الفرعية (*) بعد أدرجت أول تحلل منخفض التوتر. (B) لمحات الميكروبية استنادا إلى المنطقة V1V2 من 16S الريباسي التسلسل الجيني من إجمالي DNA (T) وطريقة تحلل منخفض التوتر DNA المستندة إلى (HL). هذه البيانات لم تنشر سابقا.

الرقم 5
الشكل 5: أمثلة من 2100 اجيلنت Bioanalyzer electropherograms من الحمض النووي الريبي (AD) وكدنا] (EF) ولدت لمكتبات metatranscriptomic، وذلك باستخدام بيكو RNA وذات حساسية عالية رقائق dsDNA على التوالي. (A) و (C) تظهر أمثلة من electropherograms قبل إجراءات عزل الرنا الريباسي. وelectropherograms من النجاح (B) وغير ناجحة (D) الريباسي إجراء الإزالة باستخدام الكلية عدة إزالة الرنا الريباسي تختلف قليلا،ر الذي الريباسي قمم مرئية في إزالة ناجحة. نطاق حجم كدنا] (EF) ولدت استخدام عدة التضخيم كامل Transcriptome على (سيغما الدريخ) مشابهة للمجموعة وحجم بدءا-المنضب الريباسي RNA، وبما يتفق إلى حد كبير عبر اثنين من عينات مختلفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
إجمالي عدد يقرأ 224859 87891 106189 93301 140020 1،558 272552 217438
Preprocessed يقرأ 109389 73624 67070 82011 68617 1،137 215808 158432
49٪ 84٪ 63٪ 88٪ 49٪ 73٪ 79٪ 73٪
عدد القواعد 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
يعني طول للقراءة 432 453 431 337 428 215 441 439
تسلسل المضيف ب 240 526 28 79774 13 797 585 5،859
0.21٪ 0.71٪ 0.04٪ 97.27٪ 0.02٪ 70.10٪ 0.27٪ 3.70٪
يضرب الفيروسية ج 7214 23550 4،070 737 4،642 22 6،466 5،981
6.59٪ 31.99٪ 6.07٪ 0.90٪ 6.77٪ 1.93٪ 3.00٪ 3.78٪
غير المعينة يقرأ د 103888 60490 32780 1،935 68440 311 105612 119551
94.97٪ 82.16٪ 48.87٪ 2.36٪ 99.74٪ 27.35٪ 48.94٪ 75.46٪
ويقرأ بعد بيانات ما قبل صناعة تجssing من قبل PRINSEQ 29.
ب يقرأ الإنسان التي حددها DeconSeq 30 زائد يقرأ مع أفضل ضرب BLASTn (قاعدة بيانات النوكليوتيدات NCBI) إلى الأسرة في اللغات الحبليات.
ج tBLASTx يضرب ضد قاعدة بيانات الجينوم الفيروسي في المنزل. تم حساب نسبة استخدام العدد الإجمالي للpreprocessed يقرأ.
د يقرأ مع أي BLASTn ضرب على قاعدة بيانات النوكليوتيدات NCBI. تم حساب نسبة استخدام العدد الإجمالي للpreprocessed يقرأ. بعض يقرأ مع وتم تحديد أي BLASTn ضرب على قاعدة بيانات النوكليوتيدات NCBI كما الفيروسية في مستوى البروتين في التحليل tBLASTx.

الجدول 1: خصائص المكتبة من ثمانية viromes المتولدة من عينات البلغم باستخدام سير العمل المعروضة يتم استخراج هذا الجدول من ليم <م> وآخرون (2012) 9. تم معالجتها كما هو موضح في القسم 2 ولدت viromes التي تحتوي على القليل (0.02٪ سبع عينات (CF1-D، CF1-E، CF1-F، CF4-B، CF4-C، CF5-A، وCF5-B) - 3.7 تسلسل المستمدة الإنسان و٪) مع استثناء واحد (70٪). CF4-A حذفت من الخطوة كثافة التدرج تنبيذ فائق (CF4-A) ولدت virome التي تحتوي> 97٪ تسلسل المستمدة الإنسان.

عينة تركيز إجمالي العائد إجمالي عدد القراءات إجمالي عدد القراءات (المجهزة ب) متواليات غير البشرية
(نانوغرام / ميكرولتر) (نانوغرام) (أ الخام) (٪)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74٪
CF1-1 13 1،300 2212756 1958910 1574520
80٪
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69٪
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86٪
CF1-3 28.8 2،880 1048304 896756 560852
63٪
CF1-4 24.1 2،410 1154922 984702 621098
63٪
CF1-5 33.6 3،360 1029622 888630 481548
54٪
CF1-6 43.2 4،320 1434016 1256504 725858
58٪
CF1-7 57.8 5،780 1000174 872036 565376
65٪
* تم subsampled 1 مل من عينة من CF1 -1 وCF1-2 بعد أول خطوة تحلل ناقص التوتر (الخطوة 3.1.5) قبل إجراء تحلل منخفض التوتر الثاني. تم نسج الخلايا أسفل كما هو موضح في 3.1.7 والمضي قدما من خلال بروتوكول المتبقية دون أي تعديل.
وغير المجهزة البورشيد يقرأ من 2 × 300 نقطة أساس المدى MiSeq التسلسل.
ب يقرأ تم تقييم، قلص، وإزالتها على أساس الجودة وطول كما هو موضح في المناقشة.

وتعرض خصائص microbiomes المتولدة من عينات البلغم باستخدام سير العمل قدمت تركيز الحمض النووي من كل عينة في 100 ميكرولتر شطف العازلة (5 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.5) وخصائص البيانات تسلسل: الجدول 2. تم استخدام ما مجموعه 1 نانوغرام لتوليد مكتبة الفردية باستخدام Nextera XT إعداد المكتبة عدة.

0 "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> عينة CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C علاج لا شيء RIBO-صفر لا شيء RIBO-صفر لا شيء RIBO-صفر لا شيء RIBO-صفر Preprocessed يقرأ 2،088 1،991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 يعني طول للقراءة 275 245 262 270 233 259 240 267 إجمالي الريباسي يقرأ 1،737 91 29499 17267 5285 291 16371 1،761 83.20٪ 4.60٪ 72.20٪ 68.40٪ 26.80٪ 0.90٪ 51.50٪ 4.90٪ الميكروبية الريباسي 1،414 32 19978 12035 23 227 6،916 1،076 67.70٪ 1.60٪ 48.90٪ 47.70٪ 0.10٪ 0.70٪ 21.80٪ 3.00٪ Eukaryota الريباسي 323 59 9،520 5،232 5،262 64 9455 683 15.50٪ 3.00٪ 23.30٪ 20.70٪ 26.70٪ 0.20٪ 29.70٪ 1.90٪ ٪ الريباسي إزالة * 0٪ 95٪ 0٪ 5٪ 0٪ 97٪ 0٪ 91٪ غير الريباسي يقرأ 351 (16.8٪) 1،900 (95.4٪) 11377 (27.8٪) 7971 (31.6٪) 14443 (73.2٪) 32446 (99.1٪) 15420 (48.5٪) 34411 (95.1٪) مجموع الزيارات NR 102 (4.9٪) 691 (34.7٪) 3،327 (8.1٪) 2،857 (11.3٪) 4،938 (25.0٪) 10751 (32.8٪) 5،905 (18.6٪) 15766 (43.6٪) حقيقية النواة 74 407 2،790 2،524 4،614 10،227 4،553 8،274 بكتيريا 26 283 520 312 287 471 1،326 7،442 يقرأ غير المعينة 249 (11.9٪) 1،209 (60.7٪) 8،050 (19.7٪) 5114 (20.3٪) 9505 (48.2٪) 21695 (66.3٪) 9515 (29.9٪) 18645 (51.5٪) * كمية الرنا الريباسي أخرجت كنسبة مئوية من المبلغ الحالي في قسامة غير المنضب.

الجدول 3: خصائص مكتبة metatranscriptomes مع وبدون استنزاف الريباسي يتم استخراج البيانات من ليم وآخرون (2012) 9، والتي لديها مقارنة إضافية من غيرها من مستلزمات إزالة الرنا الريباسي وتأثير [كدنا إرذاذ قبل إعداد مكتبة التسلسل.

Discussion

Metagenomics الفيروسية

وتتركز الجسيمات الفيروسية باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) هطول الأمطار أو مركزات حجم الصغيرة. في بعض الحالات، قد لا تكون هناك حاجة إلى تركيز، ولكن تستخدم ما قبل الترشيح أو منخفضة الخطوات سرعة الطرد المركزي لإزالة الخلايا حقيقية النواة والميكروبية. وسيتواصل إثراء لست] الفيروسية وتنقيتها باستخدام التدرج الكثافة تنبيذ فائق 9،41 أو مرشحات صغيرة الحجم (على سبيل المثال، 0.45 ميكرون) لإزالة الخلايا الميكروبية حقيقية النواة والكبيرة 25. وعادة ما يتم تنفيذ كثافة التدرج تنبيذ فائق مع حلول كثيفة ولكن الخاملة مثل السكروز أو السيزيوم كلوريد لعزل والتركيز الجسيمات الفيروسية 41. ويستند الفصل المادي على حجم وكثافة الطفو من الجسيمات الفيروسية. لذلك، واختيار المناسب لحجم مرشح المسام وإعداد دقيق للالتدرجات ضرورية لعزل المجتمعات الفيروسية محددة، ونجاح التأهيل البدني للVLPs يحدد المجتمع معزولة 41 (أي الجسيمات الفيروسية التي لا تمر عبر مرشح أو يدخل في كثافة استخراج لن يتم الكشف في metagenome). بعد العزلة الفيروسية والتركيز، قد يكون هناك تلوث غير الفيروسية الحاضر المواد الجينومية في العينة سواء في شكل الأحماض النووية حرة والجراثيم والخلايا حقيقية النواة. لذا، فمن الأهمية بمكان للتحقق من نقاء الجسيمات الفيروسية في عينات (أرقام 1A و 1B). ويستخدم العلاج الكلوروفورم عادة لليز الخلايا المتبقية، تليها العلاج نوكلياز للحط من الأحماض النووية المجانية قبل استخراج الحمض النووي.

وكان التحذير لسير العمل قدم استخدام كثافة الفصل المتدرج لعزل الجزيئات الفيروسية لأنها قد تستبعد الجسيمات الفيروسية يلفها التي قد تكون مزدهرة جدا لدخول التدرج CSCL. بديل "الصيد الجميع" طريقة لحذف separ كثافة التدرجأوجه وعزل DNA المجتمع من 0.45 ميكرون - الرواشح تعامل مع الكلوروفورم والدناز I. هذا النهج هو أيضا مناسبة لاستيعاب حجم عينة صغيرة مثل تلك التي من مسحات أو بلازما الدم. ومع ذلك، فإن هذا قد يؤدي إلى التلوث الجرثومي مقاومة للالكلوروفورم ومبلغ أعلى من الحمض النووي خارج الخلية مقاومة للI الدناز.

بروتوكولات التسلسل الحالية تتطلب 1 نانوغرام إلى 1 ميكروغرام من الأحماض النووية لإعداد مكتبة التسلسل حيث توفر عوائد أعلى DNA خيارات أوسع من الخيارات التسلسل. تركيز الحمض النووي من viromes الناتجة غالبا ما يتراوح بين أقل من الحد الكشف لأكثر من 200 نانوغرام / ميكرولتر. كمية الأحماض النووية الفيروسية تعافى قد لا تكون كافية لإعداد مكتبة التسلسل المباشر. في مثل هذه الحالات، والتضخيم الحمض النووي أمر ضروري. رابط التضخيم بندقية المكتبات (LASLs) 2،42،43 وكله تضخيم الجينوم على أساس تعدد التضخيم النزوح (MDA) هي اثنينطرق الأكثر شيوعا لتوليد DNA كافية لالتسلسل. ومن المعروف طرق MDA مثل تلك القائمة على Phi29 DNA بوليميريز تعاني من التحيز التضخيم، ويمكن تضخيم تفضيلي ssDNA وDNA دائري، مما أدى إلى تصنيفية غير الكمي وتوصيف وظيفي 44،45. وقد تبين لإصدار الأمثل للنهج LASLs لإدخال فقط الحد الأدنى من التحيزات، ويعزز حساسية أعلى (لكميات صغيرة من المواد ابتداء)، ويتم تكييف بسهولة لمنصات مختلفة تسلسل 43. ومع ذلك، فإن النهج العديد من الخطوات، يتطلب معدات متخصصة لتقليل الخسائر DNA، ويقتصر على القوالب dsDNA. في المختبر لدينا، وقد تم تكييف هذا النهج بنجاح لتضخيم كمية كشفها وغير قابل للكشف من الحمض النووي المستخرج من lavage- القصبات، VLPs المرجان والبحر المستمدة من المياه (غير منشورة وهرويتز وآخرون 46).

تطوير خطوط أنابيب تحليل البيانات لديها CLAكان ssically واحدة من أصعب جوانب التحليل metagenomics الفيروسي بسبب الطبيعة المتنوعة للغاية وغير معروفة إلى حد كبير من المجتمعات الفيروسية. في حين أن هناك ما يقدر بنحو 10 8 التراكيب الوراثية الفيروسية في المحيط الحيوي، حتى الآن قواعد البيانات الفيروسية الحالية احتواء ~ 4،000 الجينومات الفيروسية، وهي عبارة عن 1/100000 من مجموع هذا التنوع الفيروسي تقريبي. لذلك، وعمليات التفتيش القائم على التشابه (مثل BLAST 47) لاحالة التصنيف وظيفية في metagenomes الفيروسي تمتلك التحديات الكامنة. تفشل العديد من متواليات أن هناك أوجه شبه كبيرة لالجينوم في قاعدة البيانات، وبالتالي، تصنف على أنها غير معروفة. على الرغم من عمليات البحث على أساس التماثل هي أهم التطبيقات لتعيين التصنيف وتعمل لتسلسل البيانات، تم وضع النهج البديلة على أساس تحليل قاعدة بيانات مستقلة 48- 50. Fancello وآخرون. 51 تقديم استعراض كاملة من الأدوات والخوارزميات الحسابية المستخدمة في فيراmetagenomics لتر.

الميكروبية Metagenomics

عادة، فإن المبلغ الإجمالي من الحمض النووي المستخرج من المجتمعات ناقص التوتر المعالجة تحلل الميكروبية (HL-DNA) تتراوح من 20 نانوغرام إلى 5 ميكروغرام. العائد يعتمد اعتمادا كبيرا على الحالة الصحية للمريض وكمية عينة البلغم التي تم جمعها، وهو ما يفسر الاختلافات ينظر في العائد الكلي للHL-DNA المستخرج في هذه الدراسة (الجدول 2). الخطوات الحاسمة لتوليد تعتمد البيانات تسلسل نوعية جيدة على نوعية المكتبات تسلسل ولدت. ويبين الشكل 2 مجموعة حجم نموذجية لمكتبات التسلسل المتولدة من الحمض النووي الميكروبي المستمدة البلغم-CF باستخدام إجراء تجزئة الحمض النووي القائم على الأنزيمية. حجم مكتبة الأمثل يعتمد على اختيار منصة التسلسل والتطبيق، وبالتالي، يمكن أن يكون الأمثل الإجراء التجزؤ، وإذا لزم الأمر، من خلال النهج البديلة مثل صوتنة وإرذاذ. بالإضافة إلىنتائج تمثيلية المقدمة، ويتضح نجاح الطريقة المعروضة على البلغم CF جمعها من المرضى متعددة عبر نقاط زمنية متعددة أيضا في ليم وآخرون (2012) 9 وليم وآخرون (2014) 10.

الدراسات السابقة 9،10 تشير إلى أن كل مريض المرافئ مجموعة فريدة من المجتمع الميكروبي أن التحولات بمرور الوقت، مما يعكس استمرار اللاعبين الرئيسيين في المجتمع في حين من المرجح تقلبات بسبب الاضطرابات مثل العلاج بالمضادات الحيوية. إذا ما كان سبب هذه التقلبات يوميا حتى من دون اضطرابات الخارجية أو نتيجة لإجراءات أخذ العينات وتجهيز العينات، لا يزال في السؤال. وبناء على ميتاجينومية-DNA HL و16S rDNA تحليل amplicon، تظهر أخذ العينات طولية لمدة 7 أيام أن التذبذب اليومي لمحات الميكروبية دون اضطراب المضادات الحيوية (يوم 1 و 2 و 3) والحد الأدنى (أرقام 3A و 3B). على مقدمةالدرفلة الجديد من المضادات الحيوية عن طريق الفم مباشرة بعد أخذ العينات يوم 3، وأصبحت التغييرات في ملف تعريف المجتمع على ما يبدو في يوم 4. على الرغم من أن سيبروفلوكساسين المضادات الحيوية يستهدف طائفة واسعة من مسببات الأمراض البكتيرية المعروفة مثل P. الزنجارية، المكورات العنقودية الذهبية، والالتهاب الرئوي العقدية، زادت العلاج الوفرة النسبية للP. الزنجارية في حين خفض النيابة العقدية. وP. melaninogenica. قبل يوم 6، والمجتمع تعافى ببطء إلى بنية المجتمع الانطلاق الأولي. وتشير النتائج إلى أن تقلبات لمحات الميكروبية في مريض واحد أكثر عرضة بسبب الاضطرابات المجتمع في الشعب الهوائية.

وبالنظر إلى الاتساق بين ملامح الميكروبية المكتبات 16S rDNA وmetagenomes من DNA HL المشتقة، ونحن استبعد التحيز منشؤها من الاشعال 16S الرنا الريباسي المستخدمة في هذه الدراسة. أحد التفسيرات المحتملة للاختلافات في انحاء 16S rDNA للتصنيفلمحات آل المتولدة من الحمض النووي DNA الكلي وHL المشتقة (الشكل 3B) قد يكون وجود كميات عالية من أنواع الزائفة. DNA خارج الخلية بعد العلاج بالمضادات الحيوية. ويؤيد ذلك النتائج أن هذه الخلافات كانت الأكثر وضوحا في يوم 7، بعد ثلاثة أيام من العلاج بالمضادات الحيوية، والذي يستهدف الزائفة. بالإضافة إلى آخرين. يستخدم سيبروفلوكساسين عادة كعلاج الخط الأول في المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي وP. المزمن العدوى الزنجارية على الرغم من الطيف نشاطها يشمل معظم مسببات الأمراض المرتبطة CF. لقد افترضنا أن العلاج بالمضادات الحيوية تقضي على المجتمعات عرضة بما في ذلك العقدية النيابة. وبالتالي خلق مكانة يشغلها مقاومة P. الزنجارية. الزائفة الزنجارية قد كسب المقاومة من خلال زيادة المجتمعات بيوفيلم ولقد ثبت DNA خارج الخلية ليكون الدعم الهيكلي الرئيسي للعمارة بيوفيلم لها 52. حتى مع رإنه بنية المجتمع استردادها، DNA خارج الخلية قد ظلت في CF البلغم. ولذلك، تشير هذه البيانات إلى أن تحلل منخفض التوتر والخطوات غسل الواردة في هذا العمل أن تستفيد ليس فقط إزالة DNA المستمدة من الإنسان، ولكن DNA خارج الخلية أيضا المستمدة الميكروبية التي قد تحريف لمحات الميكروبية الفعلية.

Metatranscriptomics

A جودة عالية metatranscriptome يجب أن يحتوي على عدد قليل نسبيا من RNA الريباسي (الرنا الريباسي) تسلسل وتمثل أخذ العينات غير متحيزة للمحاضر المجتمع (مرنا). نظرا لنصف عمر قصير وكمية محدودة من مرنا، فمن الأهمية بمكان أن البروتوكول، كما وردت هنا، ويقلل من التعامل مع عينة لتحقيق أقصى قدر من عدد من النصوص استردادها.

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت عدة نهج لاستنزاف الرنا الريباسي وتكييفها في مجموعات المتاحة تجاريا. وتشمل هذه MICROB إثراء، RIBO-صفر، وعينة محددة ح مطروحybridizations 53 التي تستند التهجين قليل النوكليوتيد، و-ONLY مرنا المجموعة التي تقوم على النشاط الأنزيمي نوكلياز خارجية تستهدف RNA يحتوي على "أحادي 5. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة مناهج لالتخصيب مرنا مثل MessageAmp كيت II-البكتيريا التي polyadenylates تفضيلي، ويضاعف RNA الخطي وتتوفر أيضا. وتستخدم بعض هذه الأساليب (مثل مرنا-ONLY، MICROB E إكسبرس وMessageAmp) في وقت واحد لتحقيق الكفاءة المثلى. ومع ذلك، فإن فعالية كل من هذه الطرق محدودة، وخاصة عند العمل مع المتدهورة جزئيا الريباسي، وكثيرا ما لوحظ في الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من عينات CF. تعتمد على تذييل بعديد الأدينيلات RNA التضخيم لا يمكن استخدامها لتوليد metatranscriptomes تتألف من مرنا حقيقية النواة وبدائيات النواة. وبالإضافة إلى ذلك، أضاف بولي (A) الذيل لتسلسل قد يقلل من كمية البيانات تسلسل مفيدة. والمناطق التي تمتد المبلمر المتجانس تميل إلى أن انخفاض درجات الجودة، جausing عددا كبيرا من يقرأ لتتم تصفيته من قبل التسلسل والبرمجيات بعد التسلسل، ومتوسط ​​طول المفيد قراءة بعد التشذيب قبالة بولي سيتم تخفيض (A) ذيول بشكل كبير 54.

التعامل مع المجتمعات الميكروبية CF معقدة وRNA المتدهورة جزئيا (أرقام 4A و 4C)، وأظهرت دراسة سابقة أن لدينا طريقة التهجين التقاط الذهب من قبل عدة RIBO-صفر كان أكثر فعالية في إزالة البشرية والميكروبية الريباسي مقارنة مع الجمع بين العلاج باستخدام مجموعات أخرى 9 (الجدول 3). يسمح البيانات الناتجة التحليل المتزامن لكلا المضيف البشري والنصوص الميكروبية. اعتمادا على المحصول ونوعية RNA، فضلا عن الاختيار النهائي من منصة التسلسل، وكثير من هذه العمليات بما في ذلك خطوة التوليف [كدنا يمكن تبسيط مع الجيل مكتبة التسلسل. على سبيل المثال، RIBO-صفر RNA المعالجة يمكن استخدامها لجعل metatranscriptome التسلسل برةريس باستخدام عدة ScriptSeq RNA تسلسل إعداد المكتبة.

يوفر تحليل ميتاجينومية من المجتمعات المرتبطة الحيوان تمثيل شامل للكيان وظيفي شامل يتضمن المضيفة والمجتمعات المرتبطة بها. سير العمل المعروضة هنا هي قابلة للتكيف مع مجموعة متنوعة من عينات المرتبطة الحيوان المعقدة، وخاصة تلك التي تحتوي على مخاط سميك، على كميات عالية من الحطام الخلية، والحمض النووي خارج الخلية والبروتينات والمجمعات بروتين سكري، وكذلك الخلايا المضيفة بالإضافة إلى المطلوب الميكروبية الفيروسية و الجسيمات. على الرغم من الجسيمات الفيروسية والجرثومية قد تفقد في كل خطوة، والجسيمات العزل وتنقية ضرورية لتقليل كمية من الحمض النووي المضيف. في حين يوفر بيانات metagenomics إمكانات التمثيل الغذائي للمجتمعات فحصها، metatranscriptomics تكمل هذا من خلال الكشف عن التعبير التفاضلية من الوظائف المشفرة 9. وقد أسفر تقييم شامل للعلم الجينوم والنصوص البيانات الإضافية الجديدةights لديناميات التفاعل المجتمعي ويسهل تطوير وتحسين العلاجات 9،10،55.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة (1 R01 GM095384-01) منحت لغابة Rohwer. نشكر EPICENTRE، وهي شركة البورشيد لتوفير الوصول المبكر إلى مجموعات RIBO-صفر علم الأوبئة. نشكر كافة هاتاي لتصميم وإنتاج حامل أنبوب تنبيذ فائق. نشكر أندرياس هاس وبنيامين نولز للقراءات ومناقشات حاسمة للمخطوطة، ولورين بول لمساعدة عملية التصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Suau, A., et al. Direct analysis of genes encoding 16S rRNA from complex communities reveals many novel molecular species within the human gut. Applied and Environmental Microbiology. 65 (11), 4799-4807 (1999).
  2. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  3. Proctor, L. M. The human microbiome project in 2011 and beyond. Cell Hos., & Microbe. 10 (4), 287-291 (2011).
  4. Charlson, E. S., et al. Topographical continuity of bacterial populations in the healthy human respiratory tract. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (8), 957-963 (2011).
  5. Pragman, A. A., Kim, H. B., Reilly, C. S., Wendt, C., Isaacson, R. E. The lung microbiome in moderate and severe chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 7 (10), e47305 (2012).
  6. Kerem, B., et al. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  7. Kleven, D., McCudden, C., Willis, M. Cystic Fibrosis: Newborn screening in America. Medical Laboratory Observer. 40 (7), 16-27 (2008).
  8. Fodor, A. A., et al. The adult cystic fibrosis airway microbiota is stable over time and infection type, and highly resilient to antibiotic treatment of exacerbations. PLoS ONE. 7 (9), e45001 (2012).
  9. Lim, Y. W., et al. Metagenomics and metatranscriptomics: Windows on CF-associated viral and microbial communities. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 12 (2), 154-164 (2012).
  10. Lim, Y. W., et al. Clinical insights from metagenomic analysis of sputum samples from patients with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 52 (2), 425-437 (2014).
  11. Claesson, M. J., et al. Comparison of two next-generation sequencing technologies for resolving highly complex microbiota composition using tandem variable 16S rRNA gene regions. Nucleic Acids Research. 38 (22), e200 (2010).
  12. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  13. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of Cystic Fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87 (23), 9188-9192 (1990).
  14. Lethem, M., James, S., Marriott, C., Burke, J. The origin of DNA associated with mucus glycoproteins in Cystic Fibrosis sputum. European Respiratory Journal. 3 (1), 19-23 (1990).
  15. Childs, W. C., Gibbons, R. J. Use of percoll density gradients for studying the attachment of bacteria to oral epithelial cells. Journal of Dental Research. 67 (5), 826-830 (1988).
  16. Lee, J. -L., Levin, R. E. Use of ethidium bromide monoazide for quantification of viable and dead mixed bacterial flora from fish fillets by polymerase chain reaction. Journal of Microbiological Methods. 67 (3), 456-462 (2006).
  17. Breitenstein, S., Tümmler, B., Römling, U. Pulsed field gel electrophoresis of bacterial DNA isolated directly from patients’ sputa. Nucleic Acids Research. 23 (4), 722-723 (1995).
  18. Mokili, J. L., Rohwer, F., Dutilh, B. E. Metagenomics and future perspectives in virus discovery. Current Opinion in Virology. 2 (1), 63-77 (2012).
  19. Bibby, K. Improved bacteriophage genome data is necessary for integrating viral and bacterial ecology. Microbial Ecology. 67 (2), 242-244 (2014).
  20. Willner, D., et al. Metagenomic analysis of respiratory tract DNA viral communities in Cystic Fibrosis and non-Cystic Fibrosis individuals. PloS One. 4 (10), e7370 (2009).
  21. Willner, D., Furlan, M. Deciphering the role of phage in the cystic fibrosis airway. Virulence. 1 (4), 309-313 (2010).
  22. Willner, D., et al. Case studies of the spatial heterogeneity of DNA viruses in the cystic fibrosis lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (2), 127-131 (2012).
  23. Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012-e00011 (2011).
  24. He, S., et al. Metatranscriptomic array analysis of “Candidatus Accumulibacter phosphatis”-enriched enhanced biological phosphorus removal sludge. Environmental Microbiology. 12 (5), 1205-1217 (2010).
  25. Mokili, J. L., et al. Identification of a novel Human Papillomavirus by metagenomic analysis of samples from patients with febrile respiratory illness. PLOS ONE. 8 (3), e58404 (2013).
  26. Henig, N. R., Tonelli, M. R., Pier, M. V., Burns, J. L., Aitken, M. L. Sputum induction as a research tool for sampling the airways of subjects with Cystic Fibrosis. Thorax. 56 (4), 306-311 (2001).
  27. Rogers, G. B., et al. Use of 16S rRNA gene profiling by terminal restriction fragment length polymorphism analysis to compare bacterial communities in sputum and mouthwash samples from patients with Cystic Fibrosis. J. Clin. Microbiol. 44 (7), 2601-2604 (2006).
  28. Haas, A., et al. Unraveling the unseen players in the ocean - a field guide to water chemistry and marine microbiology. Journal of Visualized Experiments. In press, Forthcoming.
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics. 27 (6), 863-864 (2011).
  30. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PLOS ONE. 6 (3), e17288 (2011).
  31. Segata, N., et al. Metagenomic microbial community profiling using unique clade-specific marker genes. Nature Methods. 9 (8), 811-814 (2012).
  32. Meyer, F., et al. The metagenomics RAST server - a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics. 9 (1), 386 (2008).
  33. Hara, N., et al. Prevention of virus-induced type 1 diabetes with antibiotic therapy. Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). 189 (8), 3805-3814 (2012).
  34. Markle, J. G. M., et al. Sex differences in the gut microbiome drive hormone-dependent regulation of autoimmunity. Science (New York, N.Y.). 339 (6123), 1084-1088 (2013).
  35. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  36. Ewing, B., Hillier, L., Wendl, M. C., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research. 8 (3), 175-185 (1998).
  37. Edgar, R. C., Haas, B. J., Clemente, J. C., Quince, C., Knight, R. UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (16), 2194-2200 (2011).
  38. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  39. Pruesse, E., Peplies, J., Glöckner, F. O. SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (14), 1823-1829 (2012).
  40. Robertson, C. E., et al. Explicet: graphical user interface software for metadata-driven management, analysis and visualization of microbiome data. Bioinformatics (Oxford, England). 29 (23), 3100-3101 (2013).
  41. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nat. Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  42. Henn, M. R., et al. Analysis of high-throughput sequencing and annotation strategies for phage genomes. PLoS ONE. 5 (2), e9083 (2010).
  43. Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
  44. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Meth. 7 (12), 943-944 (2010).
  45. Kim, K. -H., Bae, J. -W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
  46. Hurwitz, B. L., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Evaluation of methods to concentrate and purify ocean virus communities through comparative, replicated metagenomics. Environmental Microbiology. 15 (5), 1428-1440 (2013).
  47. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology. 215, 403-410 (1990).
  48. Angly, F., et al. PHACCS, an online tool for estimating the structure and diversity of uncultured viral communities using metagenomic information. BMC Bioinformatics. 6 (1), 41 (2005).
  49. Angly, F. E., et al. The GAAS Metagenomic Tool and Its Estimations of Viral and Microbial Average Genome Size in Four Major Biomes. PLoS Comput Biol. 5 (12), (2009).
  50. Dutilh, B. E., et al. Reference-independent comparative metagenomics using cross-assembly: crAss. Bioinformatics (Oxford, England). 28 (24), 3225-3231 (2012).
  51. Fancello, L., Raoult, D., Desnues, C. Computational tools for viral metagenomics and their application in clinical research. Virology. 434 (2), 162-174 (2012).
  52. Allesen-Holm, M., et al. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Molecular Microbiology. 59 (4), 1114-1128 (2006).
  53. Stewart, F. J., Ottesen, E. A., DeLong, E. F. Development and quantitative analyses of a universal rRNA-subtraction protocol for microbial metatranscriptomics. ISME J. 4 (7), 896-907 (2010).
  54. Frias-Lopez, J., et al. Microbial community gene expression in ocean surface waters. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (10), 3805-3810 (2008).
  55. Lim, Y. W., et al. Mechanistic model of Rothia mucilaginosa adaptation toward persistence in the CF lung, based on a genome reconstructed from metagenomic data. PLOS ONE. 8 (5), e64285 (2013).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 94، virome، microbiome، metagenomics، metatranscriptomics، والتليف الكيسي، المخاطية السطحية
تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M.,… More

Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. (94), e52117, doi:10.3791/52117 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter