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Biology

複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

例として、嚢胞性線維症の気道を使用すると、原稿は、動物関連のサンプル中の微生物およびウイルスのコミュニティを特徴づけるためにメタゲノムとmetatranscriptomicアプローチの組み合わせを含む総合的なワークフローを提供します。

Abstract

ハイスループットシークエンシングのアクセス可能性は、生物学の多くの分野に革命をもたらしました。良いホスト随伴ウイルスおよび微生物群集を理解するために、DNAおよびRNA抽出のための総合的なワークフローが開発された。ワークフローは同時に次世代配列決定のための単一のサンプルからのウイルスおよび微生物メタゲノム、ならびにmetatranscriptomesを生成する。これらのアプローチのカップリングは、分類学的特性や地域社会符号化された機能の両方の概要を説明します。それは非常に粘性があるとムチンの高い量、無料の好中球のDNA、および他の未知の汚染物質が含まれているため、提示された方法は、嚢胞性線維症（CF）痰、問題のサンプルタイプを使用しています。ここに記載されているプロトコルは、これらの問題を対象とし、正常に最小限の人間のDNAの混入でウイルスおよび微生物のDNAを回収。メタゲノミクス研究を補完するために、metatranscriptomicsプロトコルは、両方の微生物を回収するために最適化された比較的少数のリボソームRNA（rRNAの）配列を含み、宿主のmRNA。データ特性の概要は、メソッドの成功を評価するための基準として機能するために提示されている。追加のCF痰サンプルはまた（i）の単一の患者内で連続7日間を横切るmicrobiomeプロファイルの一貫性を評価し、及び（ii）の16SリボソームRNA遺伝子に基づいた配列決定メタゲノムアプローチの一貫性を比較するに収集した。結果は、抗生物質の摂動のない微生物のプロファイルの日内変動が最小であったと共通のCF-関連した細菌の分類学プロフィールは低張溶解（HL）由来DNAから生成された16S rDNAのライブラリとメタゲノムの間で非常に類似していたことを示した。しかし、総DNAおよびHL-由来のDNAから生成された16S rDNA遺伝子分類学的プロファイル間の差異は、低張溶解し、洗浄工程でのみヒト由来のDNAを除去しないで利益を得ることを示唆しているだけでなく、微生物由来extracellul実際の微生物のプロフィールを偽って、AR DNA。

Introduction

人体に関連付けられたウイルスおよび微生物群集の配列決定技術1,2の適用により、過去10年間で広く研究されている。成果は、ヒトの健康および疾患における重要性微生物の認識につながっている。主要なイニシアチブは、ヒトの皮膚に存在する細菌（および一部の古細菌）について説明し、人間microbiomeプロジェクトから来て、口腔内、気道、尿生殖路、および消化管3。気管支肺胞洗浄（BAL）4,5及び鼻咽頭スワブ4を通して、健康なヒトの気道のさらなるmicrobiome研究は、肺環境サンプリング装置、気道における一過性微生物のコロニー形成の結果としての役割を果たすことができることを示している。しかし、障害者気道表面における微生物の植民地化の影響は、嚢胞性線維症（CF）患者で見られるもののような重篤な慢性肺感染症につながることができます。

tは"> CFは、嚢胞性線維症膜貫通レギュレーター（CFTR）の突然変異遺伝子6によって引き起こされる致死性遺伝病である。これらの変異は、今度は、上皮の頂端面を横切って経上皮イオン輸送に影響を与える欠陥CFTRタンパク質を生じる。疾患に影響複数の器官系が、死亡率と罹患率の大半は、CF肺疾患7に起因するものである。CF肺は微生物のコロニー化のためのユニークな生態系を提供します。イオン輸送に欠陥が好気性からなる微小環境を作成し、CF気道に蓄積する粘液を引き起こし静的な栄養豊富な粘膜表面によって固定、微好気性、嫌気コンパートメント。この環境は、ウイルス、細菌、および真菌を含む微生物のコロニー形成および増殖を促進します。急性および慢性の肺の微生物感染症は、その結果、一定だが効果のない免疫応答を引き起こす大規模な気道リモデリング、肺容量の喪失、そして最終的にパルモNARY失敗。

CF肺に関連した細菌群集はよく16SリボソームRNA（rRNAの）遺伝子配列決定8と散弾銃のメタゲノミクス9,10を使用することを含む、両方の文化に依存すると文化に依存しないアプローチを使用して、記載されている。 16S rRNAのベースのアプローチは、微生物種の広い範囲を特徴付ける、コミュニティの多様性において幅広いシフトを捕捉することができる。しかし、それは（2010年11。クラーソンらにまとめた）コミュニティを定義する際に、その解像度に制限され、代謝ポテンシャルの予測は特定され分類群のために知られているものの一般的な機能に限定されている。従って、16S rRNAの遺伝子配列決定法は、CF肺に存在する多様な微生物群集の必要な分類学的および機能的な分析精度は不十分である。ここで説明するメタゲノムアプローチは、その限界を克服する、16S rRNAのベースのアプローチを補完するものであり、比較的効果的な方法を可能にするCF肺に微生物群集の分類学と遺伝的内容の両方を分析する。

動物関連試料から単離された微生物DNAは、しばしば、宿主DNAを大量に含んでいる。 14 - CF痰または肺組織試料は、通常、免疫応答において好中球によって放出されたヒトDNAの大量の総DNA 12のしばしば99％以上を含む。いくつかの無傷のヒト細胞が存在することができるが、このDNAの大部分が溶液中で遊離または微生物の表面に吸着される。また、非常に粘性の粘液栓、細胞破片、および他の未知の汚染物の存在は、さらに、微生物細胞の単離を複雑にする。いくつかの方法が選択的にヒトDNA 16、及びMolYsisキット、限られた成功すべてを分解するために、微生物細胞15からDNアーゼI、臭化エチジウムアジドでの処理を、ヒトを分離するパーコール勾配を含む、ヒトDNAのこれらの試料を枯渇するために試験した。 CF痰のために最も効果的な微生物のDNA精製を、今日までは、Breitenstein らによって記載された方法の改変。（1995）17となっている。ここに低張溶解（HL）メソッドと呼ばれるこのアプローチは、ムチンのジスルフィド結合、真核細胞の低張溶解、及び可溶性DNA 9のDNアーゼI処理を減らすためにβメルカプトエタノールの組み合わせを使用します。選択肢の欠如にもかかわらず、HL方法が原因群集組成9,10の観察された変動するかどうか、不要な微生物の溶解および（II）の結果は、（i）可能なバイアスのためにいくつかの懸念を表明したサンプル処理に関連したバリエーションの成果物です。散弾銃のメタゲノムの生成に加えて、我々は、総DNAと連続7日間にわたって単一の患者から採取した痰試料の同じセットを使用して、HL法から抽出された微生物のDNAの16S rRNA遺伝子プロファイルを比較することにより、これらの問題に対処する。

ENT ">微生物群集と比較すると、動物に関連したウイルスのコミュニティの特徴付けは18,19限られているCF気道におけるウイルスのコミュニティが最小限しか20特徴づけられている- 。。22に CF気道におけるウイルスのコミュニティのDNAを特徴づける第一メタゲノム研究CF肺に関連したほとんどのウイルスはファージは20であることを示した。CFと非CFの個人におけるファージの代謝可能性が大幅に異なっていた。具体的には、CFの個人におけるファージコミュニティがCF気道の生理機能に細菌宿主適応の反射遺伝子を実施し、およびCF肺組織におけるウイルスの細菌毒性20。その後のメタゲノム研究は、解剖学的領域22の間のウイルスのコミュニティの別個の空間的不均一性を示した。また、CF肺組織は、任意のエコシステム22に現在まで観察最低ウイルスの多様性を保有。同定ほとんどのウイルスは、ファージたCFの病原体に感染する可能性を秘めた。しかし、このようなヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびヒトパピローマウイルス（HPV）などの真核生物ウイルスも検出された。肺組織における嚢胞切開中に観察された一つのイベントでは、ヒトパピローマウイルスゲノムの99％以上が、患者が肺の乳頭又は癌と診断されなかったにもかかわらず、回収された。これは、本ウイルスの多様性は、組織損傷の重症度を反映するだけでなく、露出させ、下にある未同定の疾患を説明することができるだけでなく、ことを示している。ここで説明するプロトコルは、多量の粘液、宿主および微生物細胞遊離DNA、ならびに細胞破片の大量から成る試料からのウイルス様粒子（VLP）を単離するためのシンプルかつ強力な方法を提供する。

メタゲノミクス補完、metatranscriptomicsは微生物群集とホスト9,23間での遺伝子発現のダイナミクスを監視するために使用される。この場合、両方の微生物及びHOSトンmRNAを優先的に選択する必要がある。細菌のmRNAがポリアデニル化されていないため、オリゴdTベースのmRNAプルダウン方法が悪用されることはありません。サンプルは真核生物のmRNAを大量に含有することが知られている場合にはポリアデニル化依存性RNA増幅は、ホストに関連したサンプルでは使用できません。 CF痰を含む多くの動物に関連したサンプルは、RNアーゼを含む細胞破片とヌクレアーゼの高い量に加えて高密度の細胞を含む。したがって、別の困難な課題はmetatranscriptome処理中に広範なRNAの分解を防止するためである。ほとんどの場合、CF喀痰から抽出した全RNAは、派生RNAの下流の適用および有用性を制限する、部分的に分解される。近年では、rRNAを枯渇のためのいくつかのアプローチが開発され、市販のキットに適合される。これらのアプローチの有効性は、しかし、特に部分的に分解されたrRNAを9,24を操作するときに、制限されている。ここで用いられている方法を許可効率的な下流の合計のrRNA除去に適し部分的に分解全RNAの検索のためにED。二つの異なるキットを比較し、部分的に分解された全RNAからのrRNAの除去効率の直接比較は、リムらによって示された。（2012）9。

全体として、この論文の目的は、一例として、誘発痰サンプルを用いて、単一の動物に関連したサンプルから、ウイルス及び微生物ガンメタゲノムを生成するためのプロトコルの完全なセット（ 図1）、及びmetatranscriptomeを提供することにある。分子検査室ワークフローは交差汚染を最小限にするために別個の前後の増幅領域を含むべきである。方法は、そのような組織22、鼻咽頭および口腔咽頭ぬぐい液25、気管支肺胞洗浄（BAL）とサンゴ（未発表データ）のような他のサンプルタイプに簡単に適応可能である。各サンプルを収集するとすぐに処理された場合は特に微生物のメタゲノムと満たされるべきであるatranscriptomics研究が望まれている。試料が凍結した場合、それは潜在的に細胞の完全性を破壊するように凍結微生物メタゲノム無傷の微生物細胞の単離を制限する。しかし、凍結はmetatranscriptomics及びウイルス分離が、凍結融解プロセスによって影響を受ける可能性が回復したウイルス粒子のRNAの品質および量を排除するものではない。それは、その誘発喀痰はBALがあまりにも侵襲され得るように、成人CF患者および他の慢性肺疾患26,27に関連した多くの研究におけるサンプルの主要な供給源を務めているに注意することが重要である。我々の研究では、痰試料を最小限に唾液サンプル内の口腔微生物汚染を保つために、滅菌生理食塩水を用いて口腔のうがい薬及びすすぎ以下、 すなわち 、慎重かつ一貫したサンプリング方法で収集した。

Protocol

注：誘発喀痰サンプルは、サンディエゴ校（UCSD、カリフォルニア大学の研究コーディネータにより、カリフォルニア大学施設内倫理委員会（HRPP 081500）とサンディエゴ州立大学治験審査委員会（SDSU IRBの＃2121）に応じて、収集した）大人のCFクリニック。

1.サンプルの収集と前処理（収集後30分以内に前処理サンプル）

  1. 前にサンプリングするコレクション、ラベル4 15ミリリットルのチューブとしては、（i）は、ウイルスメタゲノム、（II）微生物メタゲノム、（III）metatranscriptome、及び（iv）余分な痰。各サンプルについて、この手順を繰り返します。グアニジンイソチオシアネートベースのRNA溶解バッファー（GITC、溶解緩衝液）を6mlの後に "Metatranscriptome」とラベルチューブへの0.1mmのシリカビーズを2 mlを加える。
  2. サンプル収集中に、口腔の微生物による汚染を最小限にする口内洗浄剤として、無菌生理食塩水（60 ml）を使用。 30分後の期間にわたり唾液サンプルを収集噴霧器を経由して7％高張食塩水の4ミリリットルの吸入。直ちにプロセスサンプル、下記のように。
  3. 8ミリリットルの全体積に試料を希釈する。
    1. 前とサンプル採取後空痰カップを秤量することによって試料容量を推定する。
    2. 試料の体積が8未満mlである場合、少なくとも8 mLの総サンプル体積を生成するために0.02μmの濾過された1×PBSを適量加える。
    3. 目に見える塊が痰内なくなるまですぐに3ミリリットルシリンジでサンプルを均質化する
    4. 同じ注射器を用いて、痰の2ミリリットルを策定し、1.4すぐにステップ進んでください。
  4. 喀痰試料からの全RNAの保存
    1. シリカビーズとGITC-溶解バッファーを含む「metatranscriptome "チューブにステップ1.3.4から2ミリリットル痰サンプルを注入します。
    2. 蓋を閉め、漏れを避けるために、パラフィルムでしっかりとチューブをシール。
    3. 10マイルのために中程度の速度ですぐに痰を均質化するN。利用可能なボルテックスによっては、水平にチューブを配置し、必要に応じてテープで固定します。
    4. 必要に応じて研究室にアイスボックスと輸送、4℃で、またはチューブを保管してください。
  5. 「ウイルスメタゲノム」と「微生物メタゲノム」というラベルのチューブに同じ注射器、痰のアリコート2ミリリットルそれぞれの使い方と「余分な痰」とラベルチューブに痰カップから残りの痰を転送する。
  6. 必要に応じて研究室に4℃またはアイスボックス及び輸送でのすべてのチューブを保管してください。

2.生成ウイルスメタゲノム

  1. 緩衝液および溶液の調製
    1. 4℃で事前に店舗に50 mMのジチオスレイトール（DTT）を準備します。これは2週間安定である。
    2. 生理食塩水マグネシウム（SM）バッファー（250ml）で準備：1 MのNaCl、10mMのMgSO 4を、50mMのトリス-HCl、 pHを7.4に調整します。室温でフィルター滅菌し（0.02μmの孔サイズ）とストア。 私はドルナーゼユニット/ mgの乾燥重量で定義されたアクティビティに応じて凍結乾燥したウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼから（分子グレードの水で）私は100 U /μlに酵素DNアーゼを準備します。
    3. 準備I緩衝液10倍のDNase（50ml）を100のMgCl 2、20mMのCaCl 2を 。 pHを6.5に調整します。室温でフィルター滅菌し（0.02μmの孔サイズ）とストア。
    4. 4％パラホルムアルデヒドを準備します。
    5. 200X TEバッファーを準備します：2 Mトリス塩酸（pHは8.5）、0.2 M EDTA。室温でフィルター滅菌し（0.02μmの孔サイズ）とストア。
    6. 分子グレードの水を使用して10％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の10ミリリットルを準備します。
    7. 50ミリリットルCTAB / NaClを用意する（10％CTABを700 mMのNaCl）を分子グレードの水を使用する。一晩CTABを溶解する。沈殿物が解決しない場合は、65℃で溶液を加熱。溶液を室温で高粘性である。
      NOTE：0.02μmのフィルターを用いて緩衝液の濾過は溶液中のウイルス様粒子の除去を可能にするが、しない無料の核酸汚染。
  2. サンプル前処理
    1. 新鮮な6.5 mMのジチオスレイトール（DTT）の適切な量を準備します。
    2. 6ミリリットルの全体積を生成するために、0.02μmのろ過SM緩衝液を添加することによってホモジネートを希釈する。
    3. 試料に6.5 mMのジチオスレイトール（DTT）の等量（6 ml）を追加し、粘液の溶解を助けるために、渦を激しく混合し、37℃で1時間インキュベートする。
    4. 10℃、15〜20分間3056×gで精力的に処理された試料をボルテックスし、スピン。
    5. 新しい15ミリリットルチューブに上清を収集します。
    6. 次のサンプルについて、ステップ2.2.3と2.2.5を繰り返します。
    7. 転送と新しい15ミリリットルチューブに注射器に取り付けられた0.45μmのフィルターで上清をフィルタリングする。
      注：フィルタの目詰まりは、注射器からのサンプルを取得し、ろ過工程を省略した場合。
    8. （SEを参照してくださいクロロホルムおよびDNase I処理を行い、0.45μmのろ過した試料100μlのサブサンプルを取る2.3.12-2.3.15 ction）とエピ蛍光顕微鏡（ 図2A）のサンプルを修正するために4％パラホルムアルデヒドの等しいボリュームを追加。
    9. 「キャッチオール」のウイルス粒子の濃縮アプローチについて（説明を参照）、塩化セシウム勾配超遠心分離に基づいて、ウイルス粒子の選択を省略することが2.3.12に進みます。しかし、これは、ウイルス溶解物中のクロロホルム耐性細菌汚染および宿主DNAのより高い量をもたらし得る。
  3. ウイルス様粒子（VLP）の濃縮および精製
    1. 所望の密度を非濾過SM緩衝液でのCsClの適切な量を溶解することにより、個々の塩化セシウム（CsClの）溶液を調製する（1.7グラム/ mlのは1.5g / mlで、1.35グラム/ mlで、1.2グラム/ミリリットル）。使用前に0.02μmのフィルターを通した各ソリューションをフィルタリングします。
    2. 図2Bに示すように、CsCl勾配を設定する。
    3. 負荷各チューブに1.7グラム/ mlの1mlを、各チューブには1.5g / mlで負荷1mlの1.35グラムの荷重を1ミリリットル/ mlの各チューブに、各チューブに負荷1.2グラム/ mlの（オプション）、そして最終的にそれぞれのチューブに6〜8ミリリットルサンプルをロードします。マークの個々の層は、各画分の位置を示すために。
    4. 1mgの範囲内に管のそれぞれの対向ペアをバランス。
    5. 慎重にスピンバケツに各チューブをロードします。彼らは空であっても、すべてのバケットをスピン。ローター上にスピンバケットをロードします。
    6. 2時間4℃で82844×gで遠心し。
    7. 遠心分離後、慎重に密度勾配を中断することなく、ホルダーからチューブを外します。
    8. 18 G針で3ミリリットル注射器を使用して、ちょうど1.5グラム/ mlの密度層（ 図2、赤い矢印）の下にチューブを貫通し、シリンジ内に〜1.5ミリリットルを引っ張る。
    9. ゆっくりと針を取り外し、チューブ内の残りの部分は、穿刺を通じて新しい15ミリリットルチューブに滴下できるようにすることで、上部の一部を収集します。 「上分数廃棄物」として、このラベルを付けます。
    10. が1.5g / mlのfractio集めるnは2の新しいマイクロチューブに内容を吐出することにより、注射器から（VLPを含む）。
    11. すべてのサンプルを繰り返しステップ2.3.8-2.3.10。
    12. ウイルスの濃縮液にクロロホルム0.2ボリュームを追加し、激しく振り、室温で10分間インキュベート、5分間最大速度でスピンし、水相を収集します。
    13. クロロホルム処理したウイルスの濃縮液に10倍のDNaseバッファーおよびDNase I（最終濃度= 2.5 U /μl）を追加し、1.5〜2時間、37℃でインキュベートする。
    14. 15分間65℃でのDNase活性を不活性化する。
    15. 新しいチューブにクロロホルム - およびDNアーゼIで処理したウイルス画分の15μlのを削除し、エピ蛍光顕微鏡検査用のサンプルを修正するために15μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。
  4. DNA抽出
    1. プールウイルスを洗浄し、50mlのオークリッジ高速遠心管をオートクレーブ処理し、各試料から濃縮する。
    2. 以下を追加します。0.1ボリューム200X TEバッファー、Sの1mlあたり10μlの0.5 M EDTAをホルムアミドの十分な、1ボリューム、および10μlのグリコーゲン。よく混ぜ、30分間室温でインキュベート。
    3. 新しいボリュームを使用して、室温100％エタノールの2ボリュームを追加。よく混合し、少なくとも30分間、4℃でインキュベートする。
    4. SS-34ローターを用いて4℃で20分間17226×gでチューブをスピンすることによってペレットDNA。
    5. 血清学的ピペットを使用して慎重に上清を捨てる。氷冷70％エタノールでペレットを2回洗浄する。
    6. できるだけ多くの液体を除去し、15分間室温で空気乾燥にペレットを許す。
    7. 1×TE緩衝液（pH 8.0）を567μlの中にDNAペレットを再懸濁する。
      注：室温での完全な再懸濁のために少なくとも15分を許可します。さらに処理するまで4℃で一晩再懸濁したDNAを保管してください。
    8. 新しい1.5mlマイクロチューブに再懸濁DNA溶液の全体567μLを転送します。 20 _（予め温め、10％SDSおよびプロテイナーゼKの3μlの30μlのを追加します。6; G / ml）を、完全に混合し、56℃で1時間インキュベートする。 65℃でのCTAB / NaClの事前暖かい。
    9. 5 M NaClを100μl添加し、十分に混合します。 、予め温めCTAB / NaCl溶液80μlを加え、ボルテックスし、65℃で10分間インキュベートする。
    10. 、等量のクロロホルムを添加し、混合するためにボルテックスし、5分間、16,100×gでスピン。
    11. 新しい1.5mlマイクロチューブに上清を移し。 、等量のフェノール/クロロホルムを添加し、混合するためにボルテックスし、5分間、16,100×gでスピン。
    12. 新しい1.5mlマイクロチューブに上清を移し。 、等量のクロロホルムを添加し、混合するためにボルテックスし、5分間、16,100×gでスピン。
    13. 新しい1.5mlマイクロチューブに上清を移し。上清画分に等量のイソプロパノールを添加し、混合し、少なくとも30分間、-20℃でインキュベートする。
    14. DNA、4℃で15分間16,100×gでスピンをペレット化。注意深く上清をピペットで氷冷70％エタノールで2回ペレットを洗浄する。 短いスピンを行い、チューブから残りのエタノールを除去。空気は、15分間、ペレットを乾燥させる。
    15. 溶出緩衝液50μl（5 mMトリス、pHが8.5）を用いてDNAペレットを再懸濁する。ペレットは、室温で少なくとも5分間再水和することを許可する。
    16. 高感度の蛍光に基づくアッセイを用いてDNAを定量する。
  5. ファージPhi29ポリメラーゼを用いて増幅（オプション）
    1. 80 mMトリス-塩酸（pH8.0）、20のMgCl 2：2倍アニーリング緩衝液を準備します。
    2. 5 U /μlにファージPhi29 DNAポリメラーゼを希釈する。
    3. 50μlのランダムヘキサマープライマー（100μM）、125μlの2×アニーリング緩衝液、および25μlの水からなるプレミックスサンプルバッファー、。 -20℃で小分けし、保存。
    4. プレミックスの反応100μlのファージPhi29 10倍バッファで構成バッファー、40μlの10のdNTP、および560μlの水。 -20℃で小分けし、保存。
    5. 4μlのサンプル·バッファに1μlのテンプレートDNAを追加します。
    6. 目をインキュベート電子を3分間95℃で混合し、氷上で冷却する。
    7. 、2.4.4から混合物に反応バッファーの14μl加えピペッティングにより混合します。
    8. 、ファージPhi29 DNAポリメラーゼの1μlを添加して、上下にピペッティングして混合し、10分間65℃、続いて18時間30℃でインキュベートする。
    9. ゲノムDNAの列またはフェノール/クロロホルムとエタノール沈殿を使用して反応をクリーンアップします。
  6. エピ蛍光顕微鏡（ハースらを参照してください。2014年28ろ過システムのセットアップのために）
    注：単離および精製の ​​後、核酸色素と落射蛍光顕微鏡の試料中のウイルス粒子の存在および純度（ 図2Aおよび2C）を確認するために使用することができる。試料中の遊離DNAの高いバックグラウンド蛍光を生じさせることができる。したがって、サンプルはDNアーゼ顕微鏡写真のための固定および染色の前に、私は、扱われるべきである。
    1. マウント溶液を調製（0.1％のアスコルビン酸、50％グリセロール）。 1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の4.9ミリリットルに10％のアスコルビン酸の100μl加え、完全に混合。 、混合物に100％のグリセロールの5ミリリットルを追加し完全に混合し、「マウント」としてチューブにラベルを付ける。
    2. フィルタは、-20℃で0.02μmのアルミナマトリックス使い捨てシリンジフィルター、マイクロチューブにアリコートし、ストアを使用してマウントします。
    3. 新しいマイクロチューブに小分けしたサンプルを100μlとVLPを修正するために4％パラホルムアルデヒドの等しいボリュームを追加。少なくとも10分間室温で混合物をインキュベートする。
    4. 0.02μmのろ過水800μlのを追加することによって、1ミリリットルのボリュームを構成する。チューブにSYBRゴールドステインの1μLを加え、10分間室温でインキュベートする。
    5. -9および-10 PSI（-62.1及び-68.9キロパスカル）の間に真空ポンプをオンにしてろ過システムをセットアップします。
    6. 水で台座を洗浄し、フィルター台座に環状のポリプロピレン支持リングと0.02μmのアルミナマトリックスフィルタを配置。
    7. フィルターとフィルター台座の上にフィルタタワーを配置し、クランプで固定します。
    8. フィルター塔に1.5mlマイクロチューブからコンテンツをピペット、およびを通じてフィルタリングするためのサンプルのために数分を許可する。
    9. ラベルとピペット、顕微鏡スライドにマウント試薬10μlの。
    10. フィルター塔とクランプを除去しながら上の真空のままにしておきます。
    11. 慎重にフィルター台座からフィルターを削除し、キムワイプでフィルターの底にブロット、その後、顕微鏡スライド上にマウントの上に直接フィルタを置く。
    12. フィルター上にマウント試薬の別の10μlのピペットフィルター上カバースリップを置く。

3.生成微生物メタゲノム

  1. 緩衝液および溶液の調製
    1. 1XのDNase緩衝液50mlを準備します50 mMののNaAc、10のMgCl 2、2のCaCl 2; pHを6.5に調整します。フィルター滅菌し（0.22μmの）と店舗室温で。
    2. 私はドルナーゼユニット/ mgの乾燥重量で定義されたアクティビティに応じて凍結乾燥したウシ膵臓デオキシリボヌクレアーゼから（分子グレードの水で）私は1000年U /μlに酵素DNアーゼを準備します。
    3. SEバッファーの100ミリリットルの準備：75のNaCl、25mMのEDTAを。 pHを7.5に調整します。室温でフィルター滅菌し（0.22μmの）と店舗。
  2. DNA抽出の前に、サンプルの前処理
    1. 0.22μmのフィルター1×PBSの5ボリュームを追加することによりホモジネートを希釈する。例えば、試料の2ミリリットルに1×PBSの10ミリリットルを追加します。
    2. 2％（v / v）の最終濃度になるようにβメルカプトエタノールを加える。 2時間室温で（化学フード内）混合物を揺する。
    3. 10°Cと15分間3056×gでサンプルをスピンし、上清を捨てる。
    4. 分子グレードの水10ml（または0.22μmの濾過水）中でペレットを再懸濁し、15分間室温でインキュベートする。
    5. 繰り返しますが、一度3.2.3と3.2.4を繰り返します。
    6. SPI10℃でN、15分間3056×gで、上清を捨てる。
    7. 5ミリリットル1XのDNaseバッファーにペレットを再懸濁し、試料1ml当たり15μlのDNアーゼI（1,000 U /μl）を追加します。
    8. 繰り返し2時間混合しながら37℃でインキュベートする。
    9. 15分間65℃でのDNase活性を不活性化する。
    10. 10°Cと15分間3056×gでスピンし、上清を捨てる。 10ミリリットルSEバッファにペレットを再懸濁。
    11. 手順を繰り返し3.2.10。
    12. 10°Cと15分間3056×gでスピンし、上清を捨てる。
    13. 2ミリリットルSEバッファにペレットを再懸濁し、そして2マイクロチューブに移す。
    14. マイクロチューブに細胞をペレット。 15分間室温で16,100×gでチューブをスピン。
    15. 上清を除去し、ゲノムDNA抽出キットを用いてペレット化した細胞からDNAを抽出し、グラム陽性変動プロトコル。

4.生成Metatranscriptome

  1. サンプル前- 処​​理
    1. すぐにサンプル収集及び均質化した後にGITC-溶解緩衝液中のビーズビーティングによる細胞の機械的な溶解を実行します。ステップ1.4を参照してください。
    2. シリカビーズをペレット化し、4℃で混合し、5分間600×gでスピン。
    3. 新しいチューブに上清を移し。
    4. 、使用GITC-溶解バッファーのすべての750μlのクロロホルム200μlを追加し15秒間手で激しく振る、10分間室温でインキュベートし、4℃でスピンし、15分間3056×gで。この15分間のスピンの間に、ステップ4.2の準備。
    5. 15分スピン（水相-中間相 - 有機相形の明確な分離）した後、新しいRNaseフリーチューブ（S）に変換（相間を中断せずに）水相を抽出。
      注：水相は、RNAが含まれています。次のステップまで氷上にチューブを保管してください。
  2. 市販のカラムベースのRNA精製キットまたはの都合のを使用して全RNA抽出および精製を行ってntionalイソプロパノールベースの​​RNA沈殿。
    1. シリカカラムベースのRNA精製
      1. 得られた水性画分の総体積を測定する。
      2. サンプリングし、よく混合するために、RNA結合バッファーの適切なボリュームを追加します。
      3. 製造業者のプロトコルに従って、結合条件を適切な混合物を調整します。よく混ぜ、ショートスピンを行う。
      4. RNA-カラムに混合物をロードします。大容量のサンプルについては、複数のロードを使用し、4倍までの各列をロードします。そうでない場合は、各サンプルについて、複数のカラムを使用することを検討。
      5. 製造業者のプロトコルに従って適切にカラムを洗浄。
      6. RNaseフリー水の少なくとも30μlのRNAを溶出。ダブル溶出はわずかRNAの収量を増加させる。しかし、これは、RNAの濃度を希釈するであろう。
      7. RNA濃度を測定し、DNアーゼI処理に直接進む。 RNAの品質をチェックするバイオアナライザを使用します（推奨）。
      8. RNA降水
        1. 等量のイソプロパノールを追加します（ 例えば 、水性画分を500μlに500μlのイソプロパノール）と試料には10μg/μlのRNaseフリーグリコーゲン2μlの。
        2. 10分間室温で混合物をインキュベートする。
        3. 15分間12000×gで4℃でスピン。
        4. 慎重に、上清を除去し、RNaseフリーの75％エタノールの1ミリリットルを追加します。ペレットが完全であることを確認するために5分間7500×gで4℃で混合物をスピン。
        5. 慎重にエタノールを除去。
        6. 繰り返しますが、一度4.2.2.4と4.2.2.5を繰り返します。
        7. 空気は、10分間、ペレットを乾燥させる。
        8. 5分間55℃でインキュベートし、DNase処理に直接進む、RNaseフリー水50μlにペレットを再水和。 RNAの品質をチェックするバイオアナライザを使用します（推奨）。
        9. -20℃、または長期保存のために-80℃でアリコートに保管してRNA。

Representative Results

ウイルスメタゲノム

CF痰は非常に粘性であり、ムチンと遊離DNA（ 図2A）を多量に含んでいます。密度勾配超遠心分離は、宿主由来のDNA（ 図2B）の除去を容易にする。提示されたワークフローから発生する8 viromesを示す9以前の研究からの結果は、ここでは（ 表1）に要約されている。 7サンプル（CF1-D、CF1-E、CF1-F、CF4-B、CF4-C、CF5-A、およびCF5-B; 表1）は 2生成viromesが少し含ま節で説明したように（0.02処理した。唯一の例外（70％）と％-3.7％）は、ヒト由来の配列。 CF4-Aは、密度勾配超遠心分離工程（CF4-A）、この特定のサンプルに含まれる> 97％のヒト由来の配列（ 表1）から生成viromeから省略した。 図2は、典型的なの落射蛍光顕微鏡画像の一例を示しているCF sputum個のサンプル（ 図2A）前と（ 図2C）密度勾配超遠心分離後。明確なウイルス様粒子（VLP）は、密度勾配分離後に大きな粒子なし顕微鏡で観察された。 VLPは、DNA抽出の後、細菌汚染は、多くの場合、前のVLP DNAの配列決定に16S rDNAの増幅を用いて試験する。

微生物メタゲノム

ここに提示七痰試料は、7日間連続にわたって単一CF患者から採取した。痰を採取した後、患者は3日目に経口抗生物質（シプロフロキサシンおよびドキシサイクリン）で開始。この患者から採取した各痰試料の体積は、7日間にわたって15ミリリットルであった。そのため、PBSをサンプルに追加されませんでした。このサンプリングイベントの目的は、微生物群集構造の日内変動を評価する（i）で、このワークフローで提示プロトコールを評価すること、および（ii）比較メタゲノミクスおよび16S rDNAの塩基配列決定の間に微生物群集構造と解像度。したがって、総DNAおよびHL-DNAを各試料から抽出した。

DNA抽出後の各痰試料のHL-DNAの濃度を表2に示す。HL-DNAの全収率は、210 ngのから> 5μgの範囲であった。イルミナシーケンスライブラリーは、各サンプルについての1ng（ 図3）の合計の出発物質を用いて生成した。メタゲノミクスデータの特性を表2。全てに示されているが、1つのライブラリーは、100万人以上の配列と85％以上の高品質の配列はPRINSEQ 29ソフトウェアを用いてデータ前処理の際に保持された得られた。すべてのデータセットは、最初にさらなるスクリーニングとDeconSeq 30を用いて、ヒト由来の配列を除去した低品質の複製及び配列（25の最低品質スコア）を除去するために前処理された。人間·ド量rivedシーケンス汚染は、サンプルの性質に大きく依存する。ここでは、ヒト由来の配列の総量は14-46％（ 表2）の範囲であった。前処理された配列は、次いでMetaphlan 31パイプラインだけでなく、MG-RAST 32サーバーを使用して注釈を付けた。

メタゲノムに加えて、16S rDNAの増幅産物ライブラリーは、16S rRNA遺伝子33,34にV1-V2可変領域の約300塩基対を標的とするプライマーを介して総DNAおよびHL-DNAの両方から生成された。個々のサンプルからのPCR産物を標準化し、MiSeqプラットフォーム上で実行さイルミナ500サイクルペアエンドシーケンシングを使用して配列決定のためにプールした。ペアエンド16SのrDNAアンプリコン配列は、Pythonスクリプトを使用してバーコードを介して試料により選別し、対になったがにphrap 35,36を用いて組み立てた読み込みます。組み立てられたシーケンスを終了するには、平均品質スコアが≥205 NTウィンドウを使用していたまでトリミングした。潜在的なキメラはなかったN SILVA 38参照配列のキメラフリーサブセットに対してUchime 37を用いて除去。 Taxanomyは、高品質のSILVA 38データベースから418497細菌配列を使用してSINA 39（バージョン1.2.11）で読み込むに割り当てられていた。同一の分類学が割り当てられた配列は、操作的分類単位（OTUs）を生成するためにクラスタ化された。このプロセスは、16サンプル（;：72603;最大：127113分103455シーケンス/サンプル平均サイズ）のために1655278のシーケンスを生成した。メジアン製品カバレッジスコア、シークエンシングの完全性の測度は、≥99.9％であった。ソフトウェアパッケージExplicet 40（v2.9.4、www.explicet.org）を分析し、図の生成のために使用した。アルファ - ダイバーシティ（イントラサンプル）およびベータ - ダイバーシティ（サンプル間）は、100のブートストラップ再サンプリングと72603の配列の希薄点でExplicet計算した。

本研究の対象となる最初の質問は低張溶解preferentiかどうかであった同盟国は、微生物の（ すなわち 、優先的に保持または溶菌）特定のグループのために選択されます。最初の低張溶解後、再懸濁ペレット化した細胞は、第二の低張溶解（CF1-1and CF1-2）の後に同じサンプルと比較するために最初の二つのサンプル（CF1-1A *とCF1-2A *）からサブサンプリングされた。すべての試料をDNA抽出の前および配列パイプラインに続くDNA抽出にDNアーゼIで処理して、 すなわち 、均等に処理した。 図4に示すように、サブサンプルの微生物のプロファイルは、2つの低張溶解処理後の試料に非常に類似している。また、第2の低張溶解は、メタゲノム（ 表2）内の6から17パーセントによって非ヒト配列の割合を増加させる。

metagenomic-および16S rDNAのベースのプロファイリングの間に微生物組成の違いのために、そして以前に私たちのスタッドの間に見られる相違点を説明するかもしれない低張溶解前後の変化をテストするには新設等は、細菌の16S rDNAの塩基配列決定ライブラリーは、総DNAおよびHL-由来のDNA（ 図4B）の両方から生成された。属レベルでは、そのようなシュードモナス 、 ステノトロ 、 プレボテラ 、 ベイヨネラ 、および連鎖球菌などの一般的なCF-関連した細菌の分類プロファイルは、HL-由来のDNAから生成された16S rDNAのライブラリとメタゲノムの間で非常に類似していた。しかし、16S rDNAのライブラリ内のRothia検出はメタゲノムライブラリと同じくらい豊富ではありませんでした。総DNAおよびHL-由来のDNAから生成された16S rDNA遺伝子分類学的プロファイルを比較するとき、 シュードモナス差次 3日目から開始してHL-由来のDNAと比較して総DNAで表現した。

Metatranscriptomes

一般的には、CF痰から抽出した全RNAは、部分的に分解され、大きさは25-4,000 BPS（ 図5Aの範囲であり、 ら。2012 9に掲載されました。非枯渇metatranscriptomes内のrRNAの割合は27から83パーセントの範囲であり、rRNAの相対存在量は、試料にわたって変化（ 表3;リムら 9から抽出されたデータ）。しかし、リボゼロキットとの枯渇はサンプルCF1-Fを除いて百分の1から5までのrRNAのrRNAの相対存在量を減少させた。 rRNAの除去の有効性の変化は、抽出されたRNAの品質、または微生物群集存在の違い、したがって、プローブハイブリダイゼーションの9のためのrRNAのアクセシビリティを反映することができます。リボゼロのrRNA除去キットを使用して成功した（ 図5B）のエレクトロフェロおよび失敗した（ 図5D）のrRNA除去手順は、rRNAのピークが失敗した除去に見えるもので、異なる。

のcDNAライブラリ葛のサイズ範囲neratedは、多くの場合、出発RNAサンプルのサイズ範囲を反映している。ここで紹介するcDNAライブラリーをRoche-454シークエンシングライブラリの準備9に続くのrRNA枯渇時の全トランスクリプトーム増幅キット（WTA2）で生成された。 cDNAは50-4,000 BPS（ 図5E及び5F）に至るまでの断片を含んで生成され、サンプル間で非常に一貫している（リムら 2012）9。他のプラットフォーム固有のRNA-のSeqライブラリ調製キットの利用可能性は、現在、1が最適な条件でcDNA合成およびシーケンシングライブラリの準備を結合するための複数の代替選択肢を提供する。日付に1推奨オプションは、上記の推奨のrRNA除去試薬およびRNA-配列ライブラリ調製キットを組み合わせるScriptSeqコンプリートゴールドキットです。

図1
図1：準備のためのワークフローvirome、microbiome、およびmetatranscriptome配列決定のためのそのような喀痰試料などのホスト関連のサンプル、のaration。

図2
図2：塩化セシウム密度勾配超遠心分離は、細胞外DNA及び大きな粒子（A）の除去を容易にし、CF喀痰からのウイルス様粒子の最適な分離を可能にする。各勾配1ミリリットルの前処理された試料（B）をロードする前に、互いの上に積層される。粒子の単離および精製に続いて​​、そのようなSYBRゴールド、核酸色素と落射蛍光顕微鏡は、試料中のウイルス粒子の存在および純度を確認するために使用される。明確なウイルス様粒子（C;白矢印）CF痰サンプルの密度勾配分離後に観察された。


図3：任意の逸脱することなく、製造業者のプロトコールに記載されているようにCF痰microbiomesもたらしHL-DNA 1ngのから生成されたエラ·XTライブラリーのサイズ分布の例をプールライブラリーの正規化、およびロード量を行った。

図4
図4：1のCF患者から縦方向に収集された9サンプル中の微生物群集の分類学的解析低張溶解法に基づくDNAから生成されたメタゲノムライブラリに基づいて、（A）微生物のプロファイル。。種の割り当ては低品質とヒト配列相同性を有する重複した配列を除去Metaphlanパイプ次データ前処理に基づいていた。その2-STを示すために、低張溶解を優先しなかった最初の低張溶解を含めた後、微生物、サブサンプル（*）の特定のグループに対して選択epsは、（B）微生物プロファイル総DNA（T）及び低張溶解法からの16S rRNA遺伝子配列決定のV1V2領域に基づくベースのDNA（HL）。これらのデータは、以前に発表されていない。

図5
図5：RNA（AD）およびcDNA（EF）のアジレント2100バイオアナライザの電気泳動図の例は、それぞれのRNAピコと高感度のdsDNAチップを使用して、metatranscriptomicライブラリを生成しました。 （A）及び（C）は、rRNAの除去手順の前に電気泳動図の例を示す。総rRNAの除去キットを使用して成功した（B）のエレクトロフェロと失敗（D）のrRNA除去手順は、若干異なるrRNAのピークが失敗した除去に見えるトン。のcDNA（EF）のサイズ範囲は、全トランスクリプトーム増幅キット（Sigma-Aldrich社）が始まるのrRNA枯渇したRNAのサイズ範囲と同様に、2つの異なるサンプル間で非常に一貫して使用して生成された。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
の総数読み取り 224859 87891 106189 93301 140020 1,558 272552 217438
前処理された読み取り 109389 73624 67070 82011 68617 1,137 215808 158432
49％ 84パーセント 63パーセント 88パーセント 49％ 73パーセント 79パーセント 73パーセント
塩基数 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
読み取り長さの平均 432 453 431 337 428 215 441 439
ホストの系列B 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0.21％ 0.71パーセント 0.04％ 97.27パーセント 0.02％ 70.10パーセント 0.27％ 3.70パーセント
ウイルスのヒットC 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6.59パーセント 31.99パーセント 6.07パーセント 0.90パーセント 6.77パーセント 1.93パーセント 3.00パーセント 3.78パーセント
未割り当ては、Dを読み取り 103888 60490 32780 1935 68440 311 105612 119551
94.97パーセント 82.16パーセント 48.87パーセント 2.36パーセント 99.74パーセント 27.35パーセント 48.94パーセント 75.46パーセント
データ事前proce後に読み込みますPRINSEQ 29でssing。
B人間の読み込みプラス門脊索動物門に最良のBLASTNヒット（NCBIヌクレオチドデータベース）で読み込むDeconSeq 30で識別。
CのtBLASTxは、社内ウイルスゲノムデータベースに対して当たる。パーセンテージは、読み取る前処理の合計数を用いて計算した。
dは 、NCBIヌクレオチドデータベースに対して何のBLASTNヒットで読み込みます。パーセンテージは、読み取る前処理の合計数を用いて計算した。いくつかのNCBIヌクレオチドデータベースに衝突なしでBLASTnの読み込みがのtBLASTx分析におけるタンパク質レベルでのウイルスとして同定された。

表1：提示されたワークフローを使用した喀痰サンプルから生成された8 viromesの図書館特性は、このテーブルは、<リムから抽出されるem>のら（2012）9。 3.7 - 7サンプル（CF1-D、CF1-E、CF1-F、CF4-B、CF4-C、CF5-A、およびCF5-B）を少し含ま項2に記載の生成viromes（0.02％として処理した。一つの例外（70％）の％）は、ヒト由来の配列。 CF4-Aは、密度勾配超遠心分離工程（CF4-A）から省略し、> 97％のヒト由来の配列を含むviromeを生成した。

サンプル 濃度 全収率 総いいえ読み込み 合計号読み込み （処理B） 非ヒト配列
（ng /μLで） （NG） （生a）の （％）
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74パーセント
CF1-1 13 1300 2212756 1958910 1574520
80パーセント
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69パーセント
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86パーセント
CF1-3 28.8 2,880 1048304 896756 560852
63パーセント
CF1-4 24.1 2410 1154922 984702 621098
63パーセント
CF1-5 33.6 3,360 1029622 888630 481548
54％
CF1-6 43.2 4320 1434016 1256504 725858
58パーセント
CF1-7 57.8 5,780 1000174 872036 565376
65％
*試料1mlをCF1からサ ​​ブサンプリングされた第二の低張溶解手順の前に最初の低張溶解工程（ステップ3.1.5）は、次の-1とCF1-2。細胞は、3.1.7で説明したようにスピンダウンし、そのまま残っているプロトコルを進行された。
未処理のイルミナは、2×300 bpのMiSeqシーケンシング実行から読み込む。
Bは 、評価されトリミング、およびディスカッションで説明したように、品質と長さに基づいて、除去された読み取ります。

表2：示されたワークフローを使用して、唾液サンプルから生成microbiomes特性 100μlの溶出緩衝液（5mMのトリス/塩酸、pH8.5）中の各サンプルのDNA濃度及び配列データの特性が示されている。 1 ngの合計は、エラ·XTライブラリ調製キットを使用して、個々のライブラリーを作製するために使用した。

0 "FO：キープtogether.withinページ="常に "> サンプル CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C 治療なしリボ - ゼロなしリボ - ゼロなしリボ - ゼロなしリボ - ゼロ前処理された読み取り 2088 1991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 読み取り長さの平均 275 245 262 270 233 259 240 267 総rRNAを読み取り 1737 91 29499 17267 5285 291 16371 1761 83.20パーセント 4.60パーセント 72.20パーセント 68.40パーセント 26.80パーセント 0.90パーセント 51.50パーセント 4.90パーセント微生物のrRNA 1414 32 19978 12035 23 227 6916 1076 67.70パーセント 1.60パーセント 48.90パーセント 47.70パーセント 0.10％ 0.70％ 21.80パーセント 3.00パーセント真核生物のrRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15.50パーセント 3.00パーセント 23.30パーセント 20.70パーセント 26.70パーセント 0.20％ 29.70パーセント 1.90パーセント ％rRNAを削除* 0％ 95パーセント 0％ 5％ 0％ 97パーセント 0％ 91パーセント非rRNAを読み込む 351（16.8％） 1900（95.4％） 11377（27.8％） 7971（31.6％） 14443（73.2％） 32446（99.1％） 15420（48.5％） 34411（95.1％） 総NRヒット 102（4.9％） 691（34.7％） 3327（8.1％） 2857（11.3％） 4938（25.0％） 10751（32.8％） 5905（18.6％） 15766（43.6％） 真核生物 74 407 2,790 2524 4614 10227 4553 8274 細菌の 26 283 520 312 287 471 1326 7442 未割り当ての読み取り 249（11.9％） 1209（60.7％） 8050（19.7％） 5114（20.3％） 9505（48.2％） 21695（66.3％） 9515（29.9％） 18645（51.5％） * rRNAの量は、非枯渇アリコート中に存在する量のパーセンテージとして表さ除去。

表3：rRNAの枯渇とないmetatranscriptomesの図書館特性データはリムらから抽出される（2012）9、追加の他のrRNA除去キットの比較前のシーケンシングライブラリの準備に対するcDNA噴霧する効果がある。。。

Discussion

ウイルスメタゲノム

ウイルス粒子は、ポリエチレングリコール（PEG）沈殿または少量濃縮器を用いて濃縮される。いくつかのケースでは、濃度は必要とされないかもしれないが、予備濾過または低速遠心分離工程は、真核細胞および微生物細胞を除去するために使用される。ウイルス溶解物をさらに濃縮され、密度勾配超遠心分離9,41または小型フィルタ（ 例えば 、0.45μm）は、真核細胞および大菌体25を除去した。使用して精製され密度勾配超遠心分離は、典型的には、スクロースまたはウイルス粒子41を分離し、濃縮する塩化セシウムのような密集が、不活性の溶液を用いて行われる。物理的な分離は、サイズおよびウイルス粒子の浮遊密度に基づいている。したがって、フィルタの孔サイズの適切な選択及び勾配の厳密な製剤は、物理的な回復の成功と、特定のウイルスのコミュニティを単離することが不可欠であるVLPは、41（抽出密度内のフィルタや秋を通過しないすなわち 、ウイルス粒子メタゲノム中に検出されません）を分離し、コミュニティを決定します。ウイルスの単離および濃縮後、両方の自由な核酸、および微生物および真核細胞の形態で試料中に存在する非ウイルスゲノム物質が混入してもよい。したがって、試料中のウイルス粒子（ 図1Aおよび図1B）の純度を確認することが重要である。クロロホルム処理は、一般的に前に核酸抽出に自由に核酸を分解するためにヌクレアーゼ処理に続いて、残りの細胞を溶解するために使用される。

提示されたワークフローの警告は、CsCl勾配を入力するには余りにも浮力かもしれエンベロープウイルス粒子を除外することができるようにウイルス粒子を単離するための密度勾配分離を使用することであった。代わりの「キャッチオール」の方法は、密度勾配SEPARを省略することである0.45μmのからコミュニティDNAをATIONと隔離 - このアプローチはまた、綿棒または血漿からのものとして少量の試料を収容するのに適切であるクロロホルムおよびDNアーゼIで処理したろ液を。しかし、これはクロロホルム耐性細菌汚染およびDNase I耐性細胞外DNAのより高い量をもたらし得る。

高いDNA収量がシーケンシングオプションのより広い選択肢を提供することにより、現在のシークエンシングプロトコルは1 ngのシーケンシングライブラリの準備のための核酸のμgの1する必要があります。生成viromesのDNA濃度は、多くの場合、より多くは200ng /μlに検出限界以下の範囲である。回収されたウイルス核酸の量は、直接配列決定ライブラリーを調製するため不十分である。このような場合には、核酸増幅が不可欠である。リンカ増幅ショットガンライブラリ（LASLs）複数置換増幅（MDA）に基づき、2,42,43及び全ゲノム増幅は2である方法は、最も一般的に配列決定のための十分なDNAを生成するために使用される。このようなファージPhi29 DNAポリメラーゼに基づくもののようなMDA法は、増幅偏り苦しむことが知られており、優先的に非定量的分類学および機能的特徴44,45、結果として一本鎖DNAと環状DNAを増幅することができる。 LASLsアプローチの最適化バージョンは、最小限のバイアスを導入することが示された（出発物質の少量のための）より高い感受性を促進し、容易に異なる配列決定プラットフォーム43のために適合されている。しかし、このアプローチは、多くのステップを有するDNAの損失を最小限にするために特殊な装置を必要とし、二本鎖DNAテンプレートに制限されている。私たちの研究室では、このアプローチは成功し、気管支lavage-、coral-と海水由来のVLP（未発表とフルビッツら 46）から抽出したDNAの検出可能と検出できない量を増幅するようになってきた。

データ解析パイプラインの開発は、CLAを持ってssicallyウイルスのコミュニティの非常に多様かつ大部分は未知の性質に起因ウイルスのメタゲノム解析の最も困難な側面の一つとなって。日付現在のウイルスデータベースへの生物圏における推定10 8ウイルスの遺伝子型が、ありますが、このおおよその合計ウイルスの多様性の約1 / 100,000です〜4000ウイルスのゲノムを、含まれています。そのため、ウイルスのメタゲノムで分類学と機能の割り当てのために（例えばBLAST 47など）の類似性ベースの検索は、固有の課題を有している。多くの配列がデータベース中のゲノムへの著しい類似性を有することができないので、未知のものとして分類される。相同性ベースの検索は、データをシーケンスする分類関数を割り当てるための最も重要なアプリケーションであっても、データベースに依存しない分析に基づく代替的なアプローチは、48 50を開発されてきた。 Fancello ら 51はビラで使用された計算ツールとアルゴリズムの完全なレビューを提供Lのメタゲノミクス。

微生物メタゲノム

一般的に、低張溶解処理した微生物群集（HL-DNA）から抽出したDNAの総量は、20 ngのから5μgの範囲。収率は、患者の健康状態およびこの研究（ 表2）で抽出したHL-DNAの全収率で見られる変動を説明収集痰試料の量に大きく依存している。配列データは、シーケンシングライブラリーの品質に依存して、良好な品質を生成するための重要なステップは、生成された。 図2の酵素ベースのDNA断片化手順を使用して、CF痰由来の微生物のDNAから生成されたシークエンシングライブラリーの典型的なサイズ範囲を示す。最適なライブラリーサイズは、配列決定プラットフォームおよびアプリケーションの選択に依存し、必要に応じて、したがって、断片化の手順は、超音波処理し、噴霧などの代替的なアプローチを介して、最適化することができる。に加えて提示代表的な結果は、複数の時点にわたる複数の患者から採取したCF痰に提示される方法の成功はまた、（2012）9。Limらの文献に示されており、リムら。（2014）10。

これまでの研究9,10は、すべての患者は変動が原因で、抗生物質処理のような摂動する可能性がありながら、それによってコミュニティ内の主要なプレーヤーの持続性を反映して、時間をかけてシフトする微生物群集のユニークなセットを保有することを示唆している。これらの変動はあっても、外部摂動またはサンプリング手順とサンプル処理に起因することなく、日々発生するかどうか、疑問のままです。 HL-DNAのメタゲノムおよび16S rDNAのアンプリコンの分析に基づいて、7日間の長手方向のサンプリングは、抗生物質摂動なしこと微生物プロファイルの日内変動を示している（1日目、2、および3）（ 図3Aおよび3B）最小であった。イントロの際経口抗生物質の生産抗生物質シプロフロキサシンは、Pとして既知の細菌性病原体の広いスペクトルをターゲットにしている間すぐに3日目サンプリング後、コミュニティプロファイルの変化は4日目に明らかになった緑膿菌 、 黄色ブドウ球菌 、及び連鎖球菌性肺炎 、治療はPの相対的存在量を増加させ緑膿菌は、ストレプトコッカス種を減少させながら。とP. melaninogenicaの 。 6日目までに、コミュニティはゆっくりと最初の出発コミュニティ構造に回復した。結果は、単一の患者内の微生物のプロファイルの変動による気道におけるコミュニティ摂動に可能性が高いことを示唆している。

HL-由来のDNAからの16S rDNAのライブラリとメタゲノムの微生物のプロファイル間の一貫性を考えると、我々は本研究で用いた16S rRNAのプライマーから生じるバイアスを否定した。 16S rDNAの分類学上の全体に見られる差異の一つの可能​​な説明総DNAおよびHL由来DNA（ 図3B）から生成されたアルプロファイルは、 シュードモナス属の高い量の存在下であってもよい。抗生物質治療後に外DNA。これは、3日間のシュードモナス属を対象とし、抗生物質処理、後に、これらの差は7日目で最も明らかであったという知見によってサポートされています。他人に加えて。シプロフロキサシンは、一般的にCFおよび慢性P.を有する患者における第一選択薬として使用され緑膿菌感染活動のそのスペクトルは、ほとんどのCF-関連した病原体が含まれていても。私たちは、抗生物質治療がストレプトコッカス種などの影響を受けやすい地域社会を根絶するという仮説を立てた。従って、耐性のPで満たされたニッチを作成する緑膿菌 。 緑膿菌はバイオフィルムのコミュニティを増加を通して抵抗を得てもよいし、細胞外DNAは、バイオフィルムのアーキテクチャ52の主要な構造的支持であることが示されている。でもTとして彼はコミュニティ構造は、細胞外DNAは、CF痰に残っている可能性があり、回復した。したがって、これらのデータは、低張溶解し、潜在的にのみヒト由来のDNAを除去しないで利益をこのワークフローに提示洗浄工程だけでなく、微生物由来の細胞外DNAが実際の微生物のプロファイルを偽ることができることを示唆している。

Metatranscriptomics

高品質metatranscriptomeは、比較的少数のリボソームRNA（rRNAの）配列を含有し、地域社会の転写産物（mRNA）の公平なサンプリングを表している必要があります。によるmRNAの半減期が短いと、限られた量に、そのプロトコルは、ここに提示され、回収された転写物の数を最大にするために、サンプルの取り扱いを最小限に抑えることが重要である。

近年では、rRNAを枯渇のためのいくつかのアプローチが開発され、市販のキットに適合される。これらには、がMicroB エンリッチ 、リボゼロ、およびサンプル固有のサブトHが含まれるybridizations 53オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および5 '一リン酸を含むRNAを標的とするエキソヌクレアーゼ酵素活性に基づいていたmRNA-ONLYキットに基づいている。また、このような優先的に線形RNAをpolyadenylatesと増幅のMessageAmp II-細菌キットとしてのmRNAの濃縮度のためのいくつかのアプローチも利用できます。これらの方法（ 例えば、mRNA-ONLY、がMicroB のE XPRESSとのMessageAmp）の中には、最適な効率のために同時に使用されている。しかしながら、これらのアプローチのすべての有効性は、部分的に分解のrRNAの作業としてしばしばCF試料から抽出した全RNAで観察された場合は特に、制限される。ポリアデニル化依存性RNA増幅は、真核生物および原核生物の両方のmRNAからなるmetatranscriptomesを生成するために使用することができない。加えて、ポリ（A）テールは、有用な配列データの量が減少するかもしれない配列に付加。ホモポリマーストレッチを有する領域は、より低い品質スコアを有することがcとなる傾向があるかなりの数のausingするシングおよびポストシーケンスソフトウェアによってフィルタリングされる読み出し、ポリ（A）尾部を切断、トリミング後の平均有用読み取り長を大幅に54減少する。

複雑なCFの微生物のコミュニティや、部分的に分解したRNA（ 図4Aおよび4C）への対応、これまでの研究では、リボゼロゴールドキットによるハイブリダイゼーション捕獲法を使用して組み合わせる治療法と比較して、ヒトと微生物rRNAの両方を除去するのに効果的であったことを示した他のキ ​​ット9（ 表3）。結果として得られるデータは、ヒト宿主と微生物の転写産物の両方の同時分析を可能にする。収量と品質のRNA、ならびに配列決定プラットフォームの究極の選択に応じて、cDNA合成工程を含む、これらのプロセスの多くは、シーケンシングライブラリーの生成を合理化することができる。例えば、リボゼロ処理したRNAはmetatranscriptomeシング天秤座を作製するために使用することができるScriptSeq RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してリース。

動物関連コミュニティのメタゲノム解析は、ホストとその関連コミュニティを含んで全体の機能エンティティの総合的な表現を提供。ここに提示されたワークフローは、特に、所望のウイルスおよび微生物に加えて多量の粘液、細胞残屑、細胞外DNA、タンパク質および糖タンパク質複合体の高い量、ならびに宿主細胞を含有するもの、複雑な動物に関連する様々な試料に適応可能である粒子。ウイルスおよび微生物粒子はすべての段階で失われる可能性があるにもかかわらず、単離および精製は、宿主DNAの量を最小にすることが不可欠である粒子。メタゲノミクスデータを調べコミュニティの代謝電位を提供するが、符号化された機能9の発現差異を明らかにすることによって、これを補完するmetatranscriptomics。ゲノミクスおよび転写産物データの総合的な評価は、新しいインをもたらしたコミュニティの相互作用のダイナミクスにightsと改善治療法9,10,55の開発を容易にします。

Acknowledgments

この作品は、フォレスト·ロワーに授与国立衛生研究所（1 R01 GM095384-01）によってサポートされていました。私たちは、リボゼロ疫学キットへの早期アクセスを提供するためのエピセンター、イルミナ社に感謝します。我々は、超遠心分離管ホルダーの設計と生産のためのマークハタイに感謝。私たちは、撮影·プロセスを支援するための重要な測定値と原稿の議論のためにアンドレアス·ハースとベンジャミンノウルズに感謝し、そしてローレンポール。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

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分子生物学、問題94、virome、microbiome、メタゲノミクス、metatranscriptomics、嚢胞性線維症、粘膜表面
複雑な動物に関連したサンプルからのシーケンシングメタゲノムとMetatranscriptomes：不純を精製する
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