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Biology

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

Published: December 22, 2014 doi: 10.3791/52117
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Biology, San Diego State University, 2DOE Joint Genome Institute, 3Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 4Department of Pediatrics, School of Medicine, University of Colorado

Summary

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Abstract

La accesibilidad de secuenciación de alto rendimiento ha revolucionado muchos campos de la biología. A fin de comprender mejor a las comunidades microbianas y virales de acogida asociada, se desarrolló un flujo de trabajo integral para la extracción de ADN y ARN. El flujo de trabajo genera simultáneamente metagenomes virales y microbianos, así como metatranscriptomes, desde una sola muestra para la secuenciación de próxima generación. El acoplamiento de estos enfoques ofrece una visión general de las características tanto taxonómicas y las funciones de la comunidad codificado. Los métodos presentados utilizan fibrosis quística (CF) de esputo, un tipo de muestra problemático, porque es excepcionalmente viscosa y contiene alta cantidad de mucinas, el ADN de neutrófilos libre, y otros contaminantes desconocidos. Los protocolos descritos aquí se dirigen a estos problemas y con éxito recuperar ADN viral y microbiano con la contaminación de ADN humana mínima. Para complementar los estudios de metagenómica, un protocolo metatranscriptomics se optimizó para recuperar tanto microbianay ARNm host que contiene relativamente pocas secuencias de ARN ribosomal (ARNr). Una visión general de las características de los datos se presenta a servir de referencia para evaluar el éxito de los métodos. Adicional muestras de esputo CF también se recogieron a (i) evaluar la consistencia de los perfiles microbioma en siete días consecutivos dentro de un mismo paciente, y (ii) comparar la coherencia del enfoque metagenómica a una basada en la secuencia del gen 16S ARN ribosomal. Los resultados mostraron que la fluctuación diaria de perfiles microbianos sin perturbación antibiótico fue mínima y los perfiles de taxonomía de las bacterias asociadas-CF comunes eran muy similares entre las bibliotecas de 16S rDNA y metagenomes generados a partir del ADN -derivado lisis hipotónica (HL). Sin embargo, las diferencias entre los perfiles taxonómicos 16S rDNA generan a partir de ADN total y el ADN derivado de HL sugieren que la lisis hipotónica y los pasos de lavado se benefician en no sólo la eliminación de la ADN humano derivado, sino también extracellul derivados de microbiosADN ar que pueden falsear los perfiles microbianos reales.

Introduction

Comunidades virales y microbianos asociados con el cuerpo humano se han investigado ampliamente en la última década a través de la aplicación de tecnologías de secuenciación de 1,2. Los resultados han llevado al reconocimiento de los microbios importancia en la salud humana y la enfermedad. La principal iniciativa provino del proyecto humano microbioma que describe las bacterias (y algunas arqueas) que reside en la piel humana, y dentro de las cavidades orales, vías respiratorias, tracto urogenital y el tracto gastrointestinal 3. Otros estudios microbioma de las vías respiratorias sanas humanos a través de lavado broncoalveolar (BAL) 4,5 y frotis nasofaríngeos 4 han demostrado que el pulmón puede servir como un dispositivo de muestreo ambiental, resulta en la colonización microbiana transitoria en las vías respiratorias. Sin embargo, el impacto de la colonización microbiana en las superficies de las vías respiratorias con discapacidad puede conducir a infecciones pulmonares graves y crónicas, como las que se observan en la fibrosis quística (FQ) de los pacientes.

t "> CF es una enfermedad genética mortal causada por la mutación en la fibrosis quística transmembrana regulador (CFTR) gen 6. Estas mutaciones dan lugar a proteínas CFTR defectuosos que a su vez afectan al transporte transepitelial de iones a través de la superficie apical del epitelio. La enfermedad afecta múltiples sistemas de órganos, pero la mayoría de la mortalidad y la morbilidad es atribuible a la enfermedad pulmonar de la FQ 7. El CF pulmón proporciona un ecosistema único para la colonización microbiana. El defecto en el transporte de iones hace que el moco se acumula en las vías respiratorias CF, creando microambientes que constan de aeróbica , microaerófilas, y los compartimentos anaeróbicos anclado por una superficie mucosa rica en nutrientes estática. Este entorno facilita la colonización y proliferación de microbios, incluyendo virales, bacterias y hongos. agudas y las infecciones microbianas pulmonares crónicas conducen a respuestas inmunes constantes pero ineficaz, dando como resultado amplia remodelación de las vías respiratorias, pérdida de la capacidad pulmonar, y en última instancia pulmofracaso nario.

Las comunidades bacterianas asociadas con el pulmón con FQ han sido bien descritos usando ambos enfoques cultura-dependientes e independientes del cultivo, que incluyen el uso de 16S ARN ribosomal (ARNr) de secuenciación de genes 8 y metagenómica escopeta 9,10. El enfoque basado en el rRNA 16S es capaz de caracterizar una amplia gama de especies microbianas y capturar grandes cambios en la diversidad de la comunidad. Sin embargo, está limitado en su resolución en la definición de las comunidades (resumidos en Claesson et al. 2010 11) y las predicciones de los potenciales metabólicos se limitan a aquellas funciones generales conocidos para la taxones identificados. Por lo tanto, los métodos de secuenciación del gen 16S rRNA son insuficientes para la taxonómica y funcional precisión analítica necesaria de las diversas comunidades microbianas presentes en los pulmones con FQ. El enfoque descrito aquí metagenomic complementa el enfoque basado en el rRNA 16S, supera sus limitaciones, y permite una manera relativamente eficazpara analizar tanto la taxonomía comunidad microbiana y contenidos genéticos en los pulmones con FQ.

ADN microbiano aislado de muestras asociadas con animales a menudo contiene una gran cantidad de ADN del huésped. Muestras de esputo o tejido pulmonar CF generalmente contienen una gran cantidad de ADN humano liberado por los neutrófilos en la respuesta inmune, a menudo mayor que 99% del ADN total de 12 - 14. Aunque algunas células humanas intactas pueden estar presentes, la mayoría de este ADN es libre en solución o adsorbido a la superficie de los microbios. Además, la presencia de tapones de moco excepcionalmente viscosos, restos celulares y otros contaminantes desconocidos complicar aún más el aislamiento de las células microbianas. Varios métodos se ensayaron para determinar ozono estas muestras de ADN humano, incluyendo gradientes de Percoll a humano separado a partir de células microbianas 15, el tratamiento con DNasa I, monoazida de bromuro de etidio para degradar selectivamente el ADN humano 16, y el kit de MolYsis, todos con éxito limitado. Hasta la fecha, el procedimiento de purificación de ADN microbiano más eficaz para esputo CF ha sido una modificación del procedimiento descrito por Breitenstein et al. (1995) 17. Este enfoque, en este documento conocido como método de lisis hipotónica (HL), utiliza una combinación de β-mercaptoetanol para reducir los enlaces disulfuro de mucina, lisis hipotónica de las células eucariotas, y tratamiento con DNasa I de ADN soluble 9. A pesar de la falta de alternativas al método HL planteó algunas preocupaciones debido a (i) los posibles sesgos resultantes de la lisis no deseado de los microbios y (ii) si las fluctuaciones observadas en la composición de la comunidad 9,10 son un artefacto de variaciones asociadas con el procesamiento de la muestra. Además de la generación de metagenomes de escopeta, que abordar estas cuestiones mediante la comparación de los perfiles de genes 16S rRNA del ADN total y el ADN microbiano extraído de la HL método utilizando el mismo conjunto de muestras de esputo recogidas de un solo paciente a través de siete días consecutivos.

ent "> En comparación con las comunidades microbianas, la caracterización de las comunidades virales asociados con los animales es limitada 18,19 Las comunidades virales en las vías respiratorias CF sólo se han caracterizado mínimamente 20 -.. 22 El primer estudio metagenomic caracterizar el ADN de las comunidades virales en CF vías respiratorias mostraron que la mayoría de los virus asociados con los pulmones con FQ son fagos 20. El potencial metabólico del fago en CF y CF individuos no fue significativamente diferente. Específicamente, las comunidades de fagos en individuos CF llevan genes reflectante de adaptaciones huésped bacterianas a la fisiología de las vías respiratorias CF, y la virulencia. 20 estudios de metagenómica posteriores bacterianas de los virus en el tejido pulmonar de la FQ demostraron heterogeneidad espacial distinta de las comunidades virales entre las regiones anatómicas 22. Además, el tejido pulmonar de la FQ albergaba la diversidad viral más bajo observado hasta la fecha en cualquier ecosistema 22. La mayoría de los virus identificados eran fagoscon el potencial de infectar a los patógenos de FQ. Sin embargo, también se detectaron virus eucariotas tales como herpesvirus, adenovirus, y virus del papiloma humano (VPH). En un caso, cuando se observaron quistes en el tejido pulmonar durante la disección, se recuperó más de 99% de un genoma de virus del papiloma humano, a pesar de que el paciente nunca fue diagnosticado con un papiloma o carcinoma pulmonar. Esto indica que la diversidad viral presente no sólo refleja la gravedad del daño tisular, pero también puede exponer y explicar una enfermedad subyacente no caracterizado. Los protocolos descritos aquí proporcionan una manera simple, pero potente para aislar partículas virales (VLP) a partir de muestras que consisten en grandes cantidades de moco espeso, el huésped y células microbianas, ADN libre, así como los restos celulares.

Como complemento de la metagenómica, metatranscriptomics se utiliza para controlar la dinámica en la expresión génica a través de la comunidad microbiana y el anfitrión 9,23. En este caso, tanto microbiana y host mRNA necesita ser seleccionado preferentemente. Desde mRNAs bacterianas no se polyadenylated, un método desplegable mRNA a base de oligo-dT no puede ser explotada. La amplificación del ARN dependiente de poliadenilación no se puede utilizar en muestras de acogida asociada si se conocen las muestras para contener grandes cantidades de ARNm eucariota. Muchas muestras asociadas a animales, incluyendo el esputo CF, contienen una alta densidad de células, además de altas cantidades de desechos celulares y nucleasas que incluyen RNasas. Por lo tanto, otro reto es evitar una degradación del ARN durante metatranscriptome procesamiento. En la mayoría de los casos, el ARN total extraído de esputo de FQ es parcialmente degradada, lo que limita las aplicaciones posteriores y utilidad de los ARN derivado. En los últimos años, varios enfoques para el agotamiento de rRNA se han desarrollado y adaptado en kits disponibles comercialmente. La eficacia de estos enfoques se limita, sin embargo, especialmente cuando se trabaja con parcialmente degradado rRNA 9,24. Los métodos empleados aquí permitened para la recuperación de ARN total parcialmente degradado apropiado para la eliminación total de rRNA aguas abajo eficiente. La comparación directa de la eficiencia en la eliminación de rRNA partir de ARN total parcialmente degradado comparar dos kits diferentes fue ilustrado por Lim et al. (2012) 9.

En general, el objetivo de este manuscrito es proporcionar un conjunto completo de protocolos (Figura 1) para generar metagenomes escopeta virales y microbianas, y un metatranscriptome, a partir de una sola muestra asociada al animal, utilizando muestras de esputo inducido como un ejemplo. Molecular flujo de trabajo de laboratorio debe incluir áreas de pre y post-amplificación separadas para minimizar la contaminación cruzada. Los métodos son fácilmente adaptables a otros tipos de muestras tales como el tejido 22, nasofaríngeo y orofaríngeas 25, lavado broncoalveolar (BAL) y coral (datos no publicados). Cada muestra debe procesarse inmediatamente después de la recolección, especialmente cuando la metagenómica microbianos y se reunióse desean estudios atranscriptomics. Si se congelaron las muestras, limita el aislamiento de células microbianas intactas para metagenomes microbianas como la congelación potencialmente alterar la integridad celular. Sin embargo, la congelación no excluye metatranscriptomics y aislamiento viral, pero la calidad del ARN y la cantidad de partículas virales recuperados pueden verse afectados por el proceso de congelación y descongelación. Es importante señalar que el esputo inducido ha servido como la fuente primaria de muestras en muchos estudios asociados con los pacientes adultos con FQ y otras enfermedades pulmonares crónicas como 26,27 BAL puede ser demasiado invasiva. En nuestros estudios, las muestras de esputo fueron recogidos con un método de muestreo cuidadoso y consistente, es decir, tras el enjuague bucal y el enjuague de la cavidad bucal usando solución salina estéril para mantener los microbios orales contaminación dentro de las muestras de esputo a un mínimo.

Protocol

NOTA: las muestras de esputo inducido se recogieron de acuerdo con la Universidad de California Junta de Revisión Institucional (HRPP 081.500) y la Junta de San Diego State University de Revisión Institucional (IRB SDSU # 2121), por el coordinador de investigación de la Universidad de California, San Diego (UCSD ) clínica de adultos CF.

1. Recolección y Tratamiento previo (Pre-tratamiento de muestras dentro de 30 minutos después de la colección)

  1. Antes de la toma de muestra, etiqueta cuatro tubos de 15 ml como: (i) metagenoma viral, (ii) metagenoma microbiano, (iii) metatranscriptome, y (iv) el esputo extra. Repita el procedimiento para cada muestra. Añadir 2 ml de 0,1 mm perlas de sílice en el tubo con la etiqueta "Metatranscriptome", seguido por 6 ml de tampón de lisis de ARN basado isotiocianato-guanidina (tampón GITC-lisis).
  2. Durante la recogida de muestras, usar solución salina estéril (60 ml) como enjuague bucal para minimizar la contaminación por microbios orales. Recoger muestras de esputo durante un período de tiempo de 30 min después de lala inhalación de 4 ml de solución salina hipertónica 7% a través de un nebulizador. Procesar muestras inmediatamente, como se describe a continuación.
  3. Diluir la muestra a un volumen total de 8 ml.
    1. Estimar el volumen de muestra pesando taza de esputo vacía antes y después de la recogida de muestras.
    2. Si el volumen de muestra es menor que 8 ml, añadir la cantidad apropiada de 0,02 micras filtrada-PBS 1x para generar un volumen de muestra total de al menos 8 ml.
    3. Inmediatamente homogeneizar la muestra con una jeringa de 3 ml hasta sin grumos visibles permanecen dentro del esputo
    4. Usando la misma jeringa, elaborar 2 ml de esputo y proceder de inmediato al paso 1.4.
  4. Preservar ARN total de la muestra de esputo
    1. Inyectar 2 ml de muestra de esputo de paso 1.3.4 en el tubo "metatranscriptome" que contiene perlas de sílice y el tampón GITC-lisis.
    2. Cierre la tapa y sellar el tubo de forma segura con Parafilm para evitar fugas.
    3. Homogeneizar el esputo de inmediato a velocidad media durante 10 millasn. Dependiendo del vórtice disponible, coloque el tubo horizontal y asegurar con cinta si es necesario.
    4. Mantenga el tubo a 4 ° C o en una caja de hielo y el transporte al laboratorio si es necesario.
  5. Usando la misma jeringa, alícuota de 2 ml de esputo cada uno en los tubos etiquetados "metagenoma viral" y "metagenoma microbiano" y transferir el esputo restante de la taza de esputo en el tubo con la etiqueta "esputo extra".
  6. Guarde todos los tubos a 4 ° C o caja de hielo y su transporte al laboratorio si es necesario.

2. Generación Viral Metagenoma

  1. Preparación de tampones y soluciones
    1. Preparar ditiotreitol 50 mM (DTT) con antelación y se almacena a 4 ° C. Este es estable durante 2 semanas.
    2. Preparar solución salina de magnesio (SM) tampón (250 ml): 1 M NaCl, 10 mM MgSO 4, mM Tris-HCl 50; ajustar el pH a 7,4. Se esteriliza con filtro (0.02 m de tamaño de poro) y se almacena a temperatura ambiente. Preparar DNasa I enzima para 100 U / l (en agua de calidad molecular) de liofilizado DNasa páncreas bovino I de acuerdo con la actividad definida por la unidad de Dornasa / mg de peso seco.
    3. Preparar 10x DNasa I buffer (50 ml): 100 mM MgCl2, 20 mM CaCl 2; ajustar el pH a 6,5. Se esteriliza con filtro (0.02 m de tamaño de poro) y se almacena a temperatura ambiente.
    4. Preparar paraformaldehído al 4%.
    5. Preparar 200x TE Buffer: 2 M Tris-HCl (pH 8,5), 0,2 M EDTA. Se esteriliza con filtro (0.02 m de tamaño de poro) y se almacena a temperatura ambiente.
    6. Preparar 10 ml de 10% dodecil sulfato de sodio (SDS) utilizando agua de grado molecular.
    7. Preparar 50 ml de CTAB / NaCl (10% CTAB. NaCl 700 mM) utilizando agua de grado molecular. Disolver CTAB durante la noche. Si precipitados persisten, calentar la solución a 65 ° C. La solución es altamente viscoso en la temperatura ambiente.
      NOTA: la filtración de tampones utilizando 0,02 micras filtro permite la eliminación de partículas similares a virus dentro de la solución, pero nocontaminación de ácido nucleico libre.
  2. Pre-Tratamiento de la muestra
    1. Preparar una cantidad adecuada de ditiotreitol fresco mM 6,5 (TDT).
    2. Diluir el homogeneizado mediante la adición de tampón SM 0,02 micras filtrada para generar un volumen total de 6 ml.
    3. Para ayudar a la disolución de moco, añadir un volumen igual (6 ml) de ditiotreitol 6,5 mM (DTT) a la muestra y agitar vigorosamente para mezclar e incubar durante 1 hora a 37 ° C.
    4. Vortex la muestra tratada vigorosamente y giro a 10 ° C, 3.056 g durante 15-20 min.
    5. Recoger el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 ml.
    6. Repita el paso 2.2.3 y 2.2.5 para la siguiente muestra.
    7. Transferencia y filtrar el sobrenadante con un filtro de 0,45 micras montado en una jeringa en un nuevo tubo de 15 ml.
      NOTA: Si los zuecos de filtro, recuperar las muestras de la jeringa y omiten la etapa de filtración.
    8. Tome una submuestra de 100 l de la muestra de 0,45 micras filtrada, realice el cloroformo y el tratamiento con DNasa I (ver sícción 2.3.12-2.3.15) y añadir un volumen igual de paraformaldehído al 4% para fijar la muestra para microscopía de epifluorescencia (Figura 2A).
    9. Para un partículas virales enfoque enriquecimiento "catch-all" (ver Discusión), vaya al paso 2.3.12 omitir selección partículas virales basados ​​en cesio ultracentrifugación en gradiente de cloruro. Sin embargo, esto puede resultar en la contaminación bacteriana cloroformo-resistente y una mayor cantidad de ADN huésped en el lisado viral.
  3. Las partículas similares a virus (VLPs) de enriquecimiento y purificación
    1. Preparar soluciones de cloruro de cesio individual (CsCl) disolviendo la cantidad apropiada de CsCl con tampón SM no filtrada a la densidad deseada (1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1.35 g / ml, y 1,2 g / ml). Filtrar cada solución a través de un filtro de 0,02 micras antes de su uso.
    2. Configure gradiente de CsCl como se muestra en la Figura 2B.
    3. Cargar 1 ml de 1,7 g / ml en cada tubo, la carga 1 ml de 1,5 g / ml en cada tubo, la carga 1 ml de 1,35 g/ ml en cada tubo, carga de 1,2 g / ml en cada tubo (opcional), y finalmente cargar 6-8 ml de muestra en el tubo respectivo. Marcar capas individuales para indicar la ubicación de cada fracción.
    4. Equilibrar cada par opuesto de tubos de precisión de 1 mg.
    5. Coloque con cuidado cada tubo en el cubo de centrifugado. Haga girar todas cubos incluso si están vacíos. Cargar el cubo de giro en el rotor.
    6. Centrifugar a 82.844 xg a 4 ° C durante 2 horas.
    7. Después de la centrifugación, retire con cuidado los tubos de soporte sin interrumpir los gradientes de densidad.
    8. Usando una jeringa de 3 ml con una aguja de 18 G, perforar el tubo justo debajo de la g / ml capa de densidad de 1,5 (Figura 2, flecha roja) y tire de ~ 1,5 ml en la jeringa.
    9. Recoger la fracción superior mediante la eliminación de la aguja lentamente y permitiendo que la fracción restante en el tubo gotee en un nuevo tubo de 15 ml a través de la punción. Etiquetar esto como "residuos fracción superior".
    10. Recoger el 1,5 g / ml fraction (que contiene VLPs) de la jeringa por la expulsión de los contenidos en dos nuevos tubos de microcentrífuga.
    11. Repita el paso 2.3.8-2.3.10 para todas las muestras.
    12. Añadir 0,2 volumen de cloroformo en el concentrado viral, agitar vigorosamente, se incuba a TA durante 10 min, vuelta a la velocidad máxima durante 5 min, y recoger la fase acuosa.
    13. Añadir tampón 10x DNasa y DNasa I (concentración final = 2,5 U / l) en el concentrado viral cloroformo-tratada, y se incuba a 37 ° C durante 1,5-2 h.
    14. Inactivar la actividad DNasa a 65 ° C durante 15 min.
    15. Retire 15 l de cloroformo y la fracción viral tratado con DNasa I en un nuevo tubo, y añadir 15 l 4% de paraformaldehído para fijar la muestra para microscopía de epifluorescencia.
  4. Extracción de ADN
    1. Piscina concentrados virales de cada muestra en un ml Oak Ridge tubo de centrífuga de 50 de alta velocidad limpiado y tratado en autoclave.
    2. Agregue el siguiente: 200x tampón TE 0,1 volúmenes, 10 l de EDTA 0,5 M por ml de samplio, 1 volumen de formamida, y 10 l de glucógeno. Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
    3. El uso de los nuevos volúmenes, añadir 2 volúmenes de la temperatura ambiente 100% de etanol. Mezclar bien e incubar a 4 ° C durante al menos 30 min.
    4. ADN Pellet haciendo girar el tubo a 17.226 xg durante 20 min, a 4 ° C usando un rotor SS-34.
    5. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente utilizando una pipeta serológica. Lavar la pella dos veces con etanol al 70% enfriado con hielo.
    6. Retire la mayor cantidad de líquido posible y permitir que el precipitado se seque al aire a temperatura ambiente durante 15 min.
    7. Resuspender el sedimento de ADN en 567 l de tampón 1x TE (pH 8,0).
      NOTA: Deje por lo menos 15 minutos para la resuspensión completa a temperatura ambiente. Almacenar el ADN se resuspendió durante la noche a 4 ° C hasta su posterior procesamiento.
    8. Transferir la totalidad de los 567 l de solución de ADN resuspendido en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 30 l de SDS al 10% precalentado y 3 l de proteinasa K (20 _6; g / ml), mezclar bien e incubar durante 1 hora a 56 ° C. Pre-caliente CTAB / NaCl a 65 ° C.
    9. Añadir 100 l de NaCl 5 M y mezclar bien. Añadir 80 l de solución pre-calentado CTAB / NaCl, vórtice, y se incuba durante 10 minutos a 65 ° C.
    10. Añadir un volumen igual de cloroformo, vortex para mezclar, y centrifugado a 16.100 xg durante 5 min.
    11. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir un volumen igual de fenol / cloroformo, vortex para mezclar, y centrifugado a 16.100 xg durante 5 min.
    12. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir un volumen igual de cloroformo, vortex para mezclar, y centrifugado a 16.100 xg durante 5 min.
    13. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir un volumen igual de isopropanol a la fracción sobrenadante, mezclar e incubar a -20 ° C durante al menos 30 min.
    14. Se precipitan el ADN, giran a 16.100 xg durante 15 min a 4 ° C. Pipetear el sobrenadante cuidadosamente y lavar el pellet dos veces con etanol al 70% enfriado con hielo. Realizar un breve centrifugado y eliminar el etanol restante del tubo. Deje secar al aire el sedimento durante 15 min.
    15. Resuspender el sedimento de ADN con 50 l de tampón de elución (Tris 5 mM, pH 8,5). Dejar que el precipitado a rehidratar durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.
    16. Cuantificar el ADN usando un ensayo basado en fluorescencia de alta sensibilidad.
  5. La amplificación usando polimerasa Phi29 (Opcional)
    1. Preparar 2x tampón de reasociación: 80 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM de MgCl 2.
    2. Diluir ADN polimerasa Phi29 a 5 U / l.
    3. Tampón de muestra de pre-mezcla, compuesta por 50 imprimación l azar hexamer (100 M), 125 recocido buffer l 2x, y 25 l de agua. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
    4. Buffer de pre-mezcla de reacción, compuesto de 100 l de tampón Phi29 10x, mM dNTPs 40 l 10 y 560 l de agua. Alícuota y almacenar a -20 ° C.
    5. Añadir ADN molde 1 l en tampón de muestra de 4 l.
    6. Incubar ªmezcla de correo a 95 ° C durante 3 minutos y dejar enfriar sobre hielo.
    7. Añadir 14 l de tampón de reacción en la mezcla de 2.4.4, mezclar pipeteando arriba y abajo.
    8. Añadir 1 l de ADN polimerasa de Phi29, mezclar pipeteando arriba y abajo, y se incuba a 30 ° C durante 18 h seguido por 65 ° C durante 10 min.
    9. Limpie las reacciones utilizando columnas de ADN genómico o fenol / cloroformo y precipitaciones con etanol.
  6. Microscopía de epifluorescencia (Consulte Haas et al. 2014 28 para la configuración del sistema de filtración)
    NOTA: Tras el aislamiento y la purificación, la microscopía de epifluorescencia con colorantes ácidos nucleicos se puede utilizar para verificar la presencia y la pureza de las partículas virales en muestras (Figuras 2A y 2C). Libre de ADN en la muestra puede dar lugar a una alta fluorescencia de fondo. Por lo tanto, la muestra debe ser DNasa I-tratadas antes de la fijación y la tinción para micrografías.
    1. Prepare la solución de montaje (ácido ascórbico 0,1%, 50% de glicerol). Añadir 100 l de ácido ascórbico 10% a 4,9 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS), mezclar bien. Añadir 5 ml de 100% de glicerol a la mezcla, mezclar bien y etiquetar el tubo como "montar".
    2. Filtro de montaje utilizando un 0,02 micras matriz de alúmina filtro de jeringa desechable, alícuota en tubos de microcentrífuga, y se almacena a -20 ° C.
    3. Alícuota de 100 l de muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga y añadir un volumen igual de paraformaldehído al 4% para fijar las VLPs. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante al menos 10 min.
    4. Completar el volumen a 1 ml mediante la adición de 800 l de 0,02 micras agua filtrada. Añadir 1 l de SYBR Gold mancha en el tubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Establecer el sistema de filtración mediante la activación de la bomba de vacío entre -9 y -10 psi (-62,1 y -68,9 kPa).
    6. Lave el pedestal con agua y colocar un filtro de matriz de alúmina de 0,02 m con anillo de soporte de polipropileno anular en el pedestal filtro.
    7. Coloque una torre de filtro en la parte superior del pedestal de filtro con el filtro y seguro con una abrazadera.
    8. Pipetear los contenidos del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en la torre de filtro, y espere unos minutos para que la muestra se filtre a través.
    9. Etiquetas y pipeta 10 l de reactivo de montaje en un portaobjetos de microscopio.
    10. Deja el vacío mientras se quita la torre de filtro y la abrazadera.
    11. Retire con cuidado el filtro del pedestal filtro y seque la parte inferior del filtro con un Kimwipe, a continuación, coloque el filtro directamente en la parte superior de la montura en el portaobjetos de microscopio.
    12. Pipetear otros 10 l de reactivo de montaje en el filtro y colocar un cubreobjetos sobre el filtro.

3. Generación Microbiana Metagenoma

  1. Preparación de tampones y soluciones
    1. Preparar 50 ml de tampón 1x DNasa: NaAc 50 mM, 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl 2; ajustar el pH a 6,5. Se esteriliza con filtro (0.22 m) y tiendaa temperatura ambiente.
    2. Preparar DNasa I enzima para 1.000 U / l (en agua de calidad molecular) de liofilizado DNasa páncreas bovino I de acuerdo con la actividad definida por la unidad de Dornasa / mg de peso seco.
    3. Preparar 100 ml de tampón de SE: NaCl 75 mM, EDTA 25 mM; ajustar el pH a 7,5. Se esteriliza con filtro (0.22 m) y se almacena a temperatura ambiente.
  2. Pre-tratamiento de la muestra Antes de DNA Extraction
    1. Diluir el homogeneizado añadiendo 5 volúmenes de 0,22 micras filtrada-PBS 1x. Por ejemplo, añadir 10 ml de PBS 1x en 2 ml de muestra.
    2. Añadir β-mercaptoetanol al 2% (v / v) de concentración final. Roca la mezcla (en la campana química) a temperatura ambiente durante 2 hr.
    3. Haz girar la muestra a 10 ° C y 3056 xg durante 15 min, y desechar el sobrenadante.
    4. Resuspender el precipitado en 10 ml de agua de grado molecular (o 0,22 micras agua filtrada), y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
    5. Repita los pasos 3.2.3 y 3.2.4 una vez.
    6. Spin a 10 ° C y 3056 xg durante 15 min, y desechar el sobrenadante.
    7. Resuspender el precipitado en 5 ml de tampón 1x DNasa y añadir 15 l de DNasa I (1.000 U / l) por ml de muestra.
    8. Incubar a 37 ° C con repetida mezcla durante 2 horas.
    9. Inactivar la actividad DNasa a 65 ° C durante 15 min.
    10. Haz girar a 10 ° C y 3056 xg durante 15 min, y desechar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 10 ml de tampón SE.
    11. Repita el paso 3.2.10.
    12. Haz girar a 10 ° C y 3056 xg durante 15 min, y desechar el sobrenadante.
    13. Resuspender el precipitado en tampón 2 ml SE, y transferir a dos tubos de microcentrífuga.
    14. Sedimentar las células en los tubos de microcentrífuga. Girar los tubos a 16.100 xg a temperatura ambiente durante 15 min.
    15. Eliminar el sobrenadante y extraer el ADN de las células sedimentadas utilizando un kit de extracción de ADN genómico, el protocolo de variación Gram-positivo.

4. Generación de Metatranscriptome

  1. Muestra Pre-tratamiento
    1. Realice la lisis mecánica de las células por paliza de perlas en tampón GITC-lisis inmediatamente después de la recogida de muestras y la homogeneización. Vea el paso 1.4.
    2. Haga girar la mezcla a 4 ° C y 600 xg durante 5 minutos para sedimentar las perlas de sílice.
    3. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
    4. Añadir 200 l de cloroformo por cada 750 l de tampón GITC-lisis utilizados, agitar vigorosamente a mano durante 15 segundos, se incuba a temperatura ambiente durante 10 min, y centrifugado a 4 ° C y 3.056 xg durante 15 min. Durante este 15 min de centrifugado, prepararse para el paso 4.2.
    5. Después de la vuelta 15 min (una clara separación de las formas de fase-fase interfase-orgánicos acuosos), se extrae la fase acuosa (sin interrumpir la interfase) en tubo nuevo (s) libre de RNasa.
      NOTA: La fase acuosa contiene el RNA. Mantener los tubos en hielo hasta el siguiente paso.
  2. Realizar la extracción de ARN total y la purificación usando kits de purificación de ARN comercialmente disponibles basados ​​en columnas o conventional ARN precipitación basada en isopropanol.
    1. Basado Columna-Silica ARN Purificación
      1. Medir el volumen total de la fracción acuosa obtenida.
      2. Añadir volumen apropiado de tampón de unión al ARN de probar y mezclar bien.
      3. Ajuste mezcla de apropiarse condición vinculante de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mezclar bien y hacer un breve centrifugado.
      4. Cargar la mezcla en la columna de la ARN. Para una muestra de gran volumen, utilice la carga múltiple y cargar cada columna hasta 4x. De lo contrario, considere el uso de varias columnas para cada muestra.
      5. Lavar la columna apropiada de acuerdo con el protocolo del fabricante.
      6. Eluir el ARN con al menos 30 l de agua libre de RNasa. Doble elución aumentará ligeramente el rendimiento de ARN. Sin embargo, esto va a diluir la concentración de ARN.
      7. Medir la concentración de ARN y proceder directamente a tratamiento DNasa I. Utilice el Bioanalyzer para comprobar la calidad del ARN (recomendado).
      8. ARN Precipitación
        1. Añadir un volumen igual de isopropanol (por ejemplo, 500 l de isopropanol en 500 l de fracción acuosa) y 2 l de 10 mg / l de glucógeno libre de ARNasa a la muestra.
        2. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 min.
        3. Centrifugado a 12.000 xg y 4 ° C durante 15 min.
        4. Retire con cuidado el sobrenadante, añadir 1 ml de RNasa libre de 75% de etanol. Haga girar la mezcla a 7500 xg y 4 ° C durante 5 minutos para asegurarse de que la pastilla está intacto.
        5. Retire con cuidado el etanol.
        6. Repita los pasos 4.2.2.4 y 4.2.2.5 una vez.
        7. Deje secar al aire el sedimento durante 10 min.
        8. Rehidratar el precipitado en 50 l de agua libre de RNasa, se incuba a 55 ° C durante 5 minutos y proceder directamente a tratamiento DNasa. Utilice el Bioanalyzer para comprobar la calidad del ARN (Recomendado).
        9. ARN tienda en alícuotas a -20 ° C, o -80 ° C para almacenamiento a largo plazo.

Representative Results

Metagenomes virales

Esputo de FQ es excepcionalmente viscosa y contiene una alta cantidad de mucina y el ADN libre (Figura 2A); la ultracentrifugación en gradiente de densidad facilita la eliminación de ADN derivada del huésped (Figura 2B). Los resultados de un estudio anterior 9 mostrando ocho viromes generados a partir del flujo de trabajo presentado se resumen a continuación (Tabla 1). Se procesaron tal como se describe en la Sección 2. Los viromes generados contenían poco (0,02; siete muestras (Tabla 1 CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, y CF5-B) % -3,7%) secuencias derivadas de seres humanos con una sola excepción (70%). CF4-A fue omitido de la etapa de ultracentrifugación en gradiente de densidad (CF4-A) y el virome generados a partir de esta muestra específicas contenidas> 97% secuencias derivadas de seres humanos (Tabla 1). La Figura 2 muestra un ejemplo de la imagen de microscopía de epifluorescencia de una típica CF sputum muestra antes (Figura 2A) y después (Figura 2C) ultracentrifugación en gradiente de densidad. Se observaron partículas virales como Clear (VLP) en las micrografías sin grandes partículas después de la separación por gradiente de densidad. Después de la extracción de ADN VLPs, la contaminación bacteriana a menudo se prueba utilizando la amplificación de 16S rDNA antes de la secuenciación de ADN VLPs.

Microbianos metagenomes

Siete muestras de esputo que aquí se presentan fueron recogidos de un solo paciente con fibrosis quística a través de siete días consecutivos. El paciente comenzó el antibiótico oral (ciprofloxacina y doxiciclina) en el Día 3 después se recogió el esputo. El volumen de cada muestra de esputo obtenida de este paciente era 15 ml a lo largo de los 7 días; por lo tanto, no se añadió PBS a la muestra. El objetivo de este evento de muestreo fue evaluar los protocolos presentados en este flujo de trabajo (i) que evaluaron la fluctuación diaria de estructura de la comunidad microbiana, y (ii) compararla estructura de la comunidad microbiana y resolución entre la metagenómica y la secuenciación del 16S rDNA. Por lo tanto, el ADN total y HL-DNA se extrajeron de cada muestra.

La concentración de ADN HL de cada muestra de esputo después de la extracción de ADN se presenta en la Tabla 2. El rendimiento total de HL-DNA varió de 210 ng a> 5 mg. Bibliotecas de secuenciación de Illumina se generaron con un material de partida total de 1 ng de cada muestra (Figura 3). Las características de los datos de metagenómica se presentan en la Tabla 2. Todas menos una biblioteca produjeron más de 1 millón de secuencias y más del 85% de secuencias de alta calidad fueron retenidos en el preprocesamiento de datos utilizando el software PRINSEQ 29. Todos los datos fueron preprocesados ​​primero para eliminar duplicados y secuencias de baja calidad (nivel de calidad mínimo de 25), seguidos de nuevos controles y la eliminación de las secuencias derivadas de humanos utilizando DeconSeq 30. La cantidad de humano-decontaminación secuencia RIVED es altamente dependiente de las propiedades de la muestra. En este caso, la cantidad total de secuencias derivadas de humanos varió desde 14 hasta 46% (Tabla 2). Las secuencias previamente procesados ​​fueron anotados utilizando el gasoducto Metaphlan 31 y MG-RAST 32 servidor.

Además de metagenomes, bibliotecas de amplicón 16S rDNA se generaron a partir tanto el ADN total y HL-ADN a través de cebadores dirigidos a aproximadamente 300 pb de la región variable V1-V2 en el gen 16S rRNA 33,34. Los productos PCR de muestras individuales se normalizaron y se agruparon para la secuenciación usando el 500-ciclo de secuenciación de extremo emparejado Illumina realizado en la plataforma MiSeq. De gama emparejado 16S rDNA secuencias de amplicón fueron ordenados por la muestra a través de los códigos de barras utilizando un script en Python y el emparejado dice estaban reunidos utilizando phrap 35,36. Extremos de secuencias ensambladas se recortaron hasta la puntuación media de calidad fue ≥20 utilizando una ventana de 5 nt. Quimeras potenciales eran lan eliminado usando Uchime 37 contra un subconjunto-quimera libre de las SILVA 38 secuencias de referencia. Taxanomy fue asignado a la alta calidad lee con SINA 39 (versión 1.2.11) utilizando las 418.497 secuencias bacterianas de la base de datos SILVA 38. Secuencias con asignaciones taxonómicas idénticos se agruparon para producir unidades taxonómicas operacionales (Otus). Este proceso generó 1.655.278 secuencias de 16 muestras (tamaño medio: 103.455 secuencias / de muestra; min: 72.603; máximo: 127.113). La puntuación cobertura Productos mediana, una medida de la integridad de la secuencia, era ≥ 99,9%. El paquete de software Explicet 40 (v2.9.4, www.explicet.org) se utilizó para el análisis y la generación de figura. Alpha-diversidad (intra-muestra) y beta-diversidad (inter-muestra) se calcularon en Explicet en el punto de 72.603 secuencias con 100 bootstrap re-muestreos rarefacción.

La primera pregunta que el blanco de este estudio era si preferenti lisis hipotónicaaliado selecciona para (es decir, preferentemente retiene o lisis) determinados grupos de microbios. Después de la primera lisis hipotónica, células sedimentadas re-suspendidas se submuestras de las dos primeras muestras (CF1-1A * y CF1-2A *) para comparar con las mismas muestras después de la segunda lisis hipotónica (CF1-1and CF1-2). Todas las muestras fueron tratadas por igual, es decir, se trató con ADNasa I antes de la extracción de ADN, seguido de extracción de ADN y la tubería de secuenciación. Como se muestra en la Figura 4, los perfiles microbianos de las submuestras son muy similares a las muestras después de dos tratamientos lisis hipotónica. Además, el segundo lisis hipotónica aumenta la fracción de secuencias no humanas por 6-17% dentro de los metagenomes (Tabla 2).

Para probar las diferencias en la composición microbiana entre metagenomic- y de base de perfiles de ADNr 16S, y para los cambios antes y después de la lisis hipotónica que podrían explicar las diferencias observadas anteriormente entre nuestra yeguadaIES y otros, bibliotecas de secuenciación de 16S rDNA de bacterias fueron generados a partir tanto el ADN total y el ADN derivado de HL (Figura 4B). A nivel de género, los perfiles de la taxonomía de la bacteria CF-asociado comunes tales como Pseudomonas, Stenotrophomonas, Prevotella, Veillonella y Streptococcus fueron muy similares entre las bibliotecas 16S rDNA y metagenomes generados a partir del ADN HL-derivada. Sin embargo, la detección Rothia en las bibliotecas 16S rDNA no era tan abundante como con las bibliotecas de metagenómica. Al comparar los perfiles taxonómicos 16S rDNA generados a partir de ADN total y el ADN derivado de HL, Pseudomonas fue representado diferencialmente en el ADN total en comparación con el ADN de partida HL-derivado de Día 3.

Metatranscriptomes

Típicamente, el ARN total extraído de esputo de FQ es parcialmente degradado y el tamaño varía de 25-4,000 bps (Figuras 5A y et al. 2012 9. La fracción de rRNA dentro de los metatranscriptomes no empobrecido oscila desde 27 hasta 83%, y la abundancia relativa de rRNA variarse a través de muestras (Tabla 3; datos extraídos de Lim et al 9.). Sin embargo, el agotamiento con el kit de Ribo-Zero disminuyó la rRNAs abundancia relativa de rRNA de 1-5% con la excepción de la muestra CF1-F. La variación en la eficacia de la eliminación rRNA podría reflejar la calidad del ARN extraído, o las diferencias en la comunidad microbiana presente y por lo tanto la accesibilidad de rRNAs para sondas de hibridación 9. Los electroferogramas de un éxito (Figura 5B) y sin éxito procedimiento de extracción (Figura 5D) rRNA utilizando el kit de eliminación Ribo-Zero rRNA son diferentes, por lo que los picos de ARNr son visibles en la retirada infructuosa.

El rango de tamaño de las bibliotecas de ADNc generated a menudo refleja el rango de tamaño de la muestra de partida de ARN. Las bibliotecas de cDNA que aquí se presentan se han generado con un kit de amplificación transcriptoma conjunto (WTA2) en el agotamiento del rRNA seguido de Roche-454 preparación biblioteca secuenciación 9. El ADNc generado contener fragmentos que van desde 50-4,000 bps (Figuras 5E y 5F) y es altamente consistente a través de muestras (Lim et al. 2012) 9. La disponibilidad de otros RNA-Seq kits de preparación de biblioteca específicas de la plataforma actualmente proporciona más opciones alternativas para uno de combinar la síntesis de ADNc y la preparación de la biblioteca de secuenciación en condiciones óptimas. Una opción recomendada hasta la fecha es el kit completo Oro ScriptSeq combinar reactivos de eliminación rRNA recomendadas anteriormente y kit de preparación de biblioteca RNA-Seq.

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo para la preparaciónparación de muestras de acogida asociada, como muestra de esputo, para virome, microbioma, y ​​secuenciación metatranscriptome.

Figura 2
Figura 2: cloruro de cesio gradientes de densidad de ultracentrifugación facilitar la eliminación de ADN extracelular y partículas grandes (A), y permitir que para el aislamiento óptimo de partículas similares a virus de CF esputo. Un mililitro de cada gradiente es en capas en la parte superior de uno al otro antes de cargar la muestra pre-tratado (B). Partículas Tras el aislamiento y la purificación, la microscopía de epifluorescencia con colorantes ácidos nucleicos tales como SYBR Gold se utilizan para verificar la presencia y la pureza de las partículas virales en muestras. Se observaron después de la separación por gradiente de densidad de muestra de esputo CF; partículas virales como Clear (flecha blanca C).


Figura 3:. Ejemplo de la distribución del tamaño de las bibliotecas Nextera XT generados a partir de 1 ng de HL-ADN que resultó en microbiomas esputo CF normalización Biblioteca, la puesta en común, y la carga de cantidad se realizó como se describe en el protocolo del fabricante sin ninguna desviación.

Figura 4
Figura 4: El análisis taxonómico de las comunidades microbianas en nueve muestras recogidas longitudinalmente desde un paciente CF (A) perfiles microbianos basados ​​en las bibliotecas de metagenómica generados a partir de ADN a base del método de lisis hipotónica.. La asignación de las especies se basó en el preprocesamiento de datos de tuberías siguiente Metaphlan que eliminar duplicados y secuencias con baja calidad y homología de secuencia humana. Con el fin de mostrar que dos-steps lisis hipotónica no hizo preferentemente selecciona a determinados grupos de microbios, submuestras (*) después se incluyeron la primera lisis hipotónica. (B) perfiles microbianos con base en la región V1V2 de 16S rRNA secuenciación de genes de ADN total (T) y el método de lisis hipotónica ADN basado (HL). Estos datos no han sido publicados anteriormente.

Figura 5
Figura 5: Ejemplos de Agilent 2100 Bioanalyzer electroferogramas de ARN (AD) y cDNA (EF) generado para las bibliotecas metatranscriptomic, utilizando ARN pico y patatas fritas dsDNA de alta sensibilidad, respectivamente. (A) y (C) muestran los ejemplos de electroferogramas antes de procedimientos de eliminación de rRNA. Los electroferogramas de un éxito (B) y sin éxito procedimiento de extracción (D) rRNA utilizando el kit de eliminación total de rRNA difieren ligeramente, unt rRNA picos que son visibles en la eliminación sin éxito. El rango de tamaño de cDNA (EF) generado mediante el kit de amplificación de todo el transcriptoma (Sigma-Aldrich) es similar a la gama de tamaños de la puesta en ARN rRNA-agotado, y altamente consistente a través de las dos muestras diferentes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

CF1-D CF1-E CF1-F CF4-A CF4-B CF4-C CF5-A CF5-B
Número total de lecturas 224859 87891 106189 93301 140020 1558 272552 217438
Preprocesado lee un 109389 73624 67070 82011 68617 1137 215808 158432
49% 84% 63% 88% 49% 73% 79% 73%
Número de bases 47239573 33351525 28922479 27667695 29386841 243986 95205805 69581811
La media de duración de lectura 432 453 431 337 428 215 441 439
Secuencias Host B 240 526 28 79774 13 797 585 5859
0,21% 0,71% 0,04% 97.27% 0,02% 70,10% 0,27% 3.70%
Éxitos virales c 7214 23550 4070 737 4642 22 6466 5981
6,59% 31.99% 6,07% 0,90% 6,77% 1.93% 3,00% 3,78%
No asignado Lee d 103888 60490 32780 1935 68440 311 105612 119551
94.97% 82.16% 48.87% 2.36% 99,74% 27,35% 48.94% 75.46%
A lee después de datos pre-processing por PRINSEQ 29.
b Humanos dice identificada por DeconSeq 30 más lee con un mejor éxito BLASTn (base de datos de nucleótidos NCBI) al phylum Chordata.
c tBLASTx golpea contra la base de datos del genoma viral en el local. El porcentaje se calculó utilizando el número total de lecturas preprocesado.
d Lee sin BLASTn golpear contra la base de datos NCBI de nucleótidos. El porcentaje se calculó utilizando el número total de lecturas preprocesado. Algunas lecturas sin BLASTn golpear contra la base de datos NCBI de nucleótidos fueron identificados como viral a nivel de proteínas en el análisis tBLASTx.

Tabla 1:. Características Biblioteca de ocho viromes generados a partir de muestras de esputo utilizando trabajar que se presenta en esta tabla se extrae de Lim <em> et al. (2012) 9. Se procesaron Siete muestras (CF1-D, CF1-E, CF1-F, CF4-B, CF4-C, CF5-A, y CF5-B) como se describe en la Sección 2 y viromes que contenían poco (0,02% generado - 3.7 %) secuencias humana derivada de con una excepción (70%). CF4-A fue omitido de la etapa de ultracentrifugación en gradiente de densidad (CF4-A) y virome generado que contenía> 97% de secuencias derivadas de seres humanos.

Muestra Concentración Rendimiento total No. Total de Lecturas No. Total de Lecturas (Procesado b) Las secuencias no humanos
(Ng / l) (Ng) (Raw a) (%)
CF1-1A * 2.3 1098454 937688 691541
74%
CF1-1 13 1300 2212756 1958910 1574520
80%
CF1-2A * 2.1 210 672878 588106 407530
69%
CF1-2 5.2 520 1944012 1697010 1455174
86%
CF1-3 28.8 2880 1048304 896756 560852
63%
CF1-4 24.1 2410 1154922 984702 621098
63%
CF1-5 33.6 3360 1029622 888630 481548
54%
CF1-6 43.2 4320 1434016 1256504 725858
58%
CF1-7 57.8 5780 1000174 872036 565376
65%
* 1 ml de muestra se prepararon las submuestras de CF1 -1 Y CF1-2 después de la primera etapa de lisis hipotónica (Paso 3.1.5) antes de que el segundo procedimiento de lisis hipotónica. Las células se centrifugaron como se describe en 3.1.7 y proceder a través del protocolo restante sin ninguna modificación.
un bruto Illumina lee en un 2 x 300 pb secuenciación MiSeq plazo.
B dice fueron evaluados, recortado y eliminado basa en la calidad y duración, como se describe en la discusión.

Tabla 2:. Características de microbiomas generados a partir de muestras de esputo utilizando flujo de trabajo presentado La concentración de ADN de cada muestra en 100 l de tampón de elución (Tris / HCl 5, pH 8,5) y las características de datos de la secuencia se presentan. Se utilizó un total de 1 ng de generar biblioteca individual usando el kit de preparación de biblioteca Nextera XT.

0 "fo: keep-together.within-page =" always "> Muestra CF1-D CF1-F CF4-B CF4-C Tratamiento Ninguno Ribo-Zero Ninguno Ribo-Zero Ninguno Ribo-Zero Ninguno Ribo-Zero Preprocesado lee 2088 1991 40876 25238 19728 32737 31791 36172 La media de duración de lectura 275 245 262 270 233 259 240 267 RRNA total lee 1737 91 29499 17267 5285 291 16371 1761 83.20% 4,60% 72.20% 68.40% 26,80% 0,90% 51.50% 4.90% Microbiana rRNA 1414 32 19978 12035 23 227 6916 1076 67.70% 1.60% 48.90% 47.70% 0,10% 0,70% 21,80% 3,00% Eucariontes rRNA 323 59 9520 5232 5262 64 9455 683 15,50% 3,00% 23,30% 20,70% 26.70% 0.20% 29.70% 1,90% % RRNA eliminado * 0% 95% 0% 5% 0% 97% 0% 91% No rRNA lee 351 (16,8%) 1.900 (95,4%) 11.377 (27,8%) 7971 (31,6%) 14.443 (73,2%) 32.446 (99,1%) 15.420 (48,5%) 34.411 (95,1%) Total de accesos NR 102 (4,9%) 691 (34,7%) 3327 (8,1%) 2857 (11,3%) 4.938 (25,0%) 10.751 (32,8%) 5.905 (18,6%) 15.766 (43,6%) Eukaryotic 74 407 2790 2524 4614 10227 4553 8274 Bacteriano 26 283 520 312 287 471 1326 7442 Lee sin asignar 249 (11,9%) 1209 (60,7%) 8.050 (19,7%) 5.114 (20,3%) 9505 (48,2%) 21.695 (66,3%) 9.515 (29,9%) 18.645 (51,5%) * La cantidad de rRNA eliminado expresa como un porcentaje de la cantidad presente en la alícuota no empobrecido.

Tabla 3:. Características Biblioteca de la metatranscriptomes con y sin el agotamiento de rRNA Los datos se extrae de Lim et al (2012) 9, que tiene la comparación adicional de otros kits de eliminación de rRNA y el efecto de la nebulización de ADNc antes de la preparación de la biblioteca de secuenciación..

Discussion

La metagenómica viral

Las partículas virales se concentraron usando polietilenglicol (PEG) precipitación o pequeños concentradores de volumen. En algunos casos, puede no ser necesario concentración, pero antes de la filtración o centrifugación a baja velocidad pasos se utilizan para eliminar las células eucariotas y microbianos. Lisados ​​virales se enriquecerán aún más y se purificaron usando la densidad de ultracentrifugación en gradiente de 9,41 o filtros de pequeño tamaño (por ejemplo, 0,45 m) para eliminar las células microbianas eucariotas y grandes 25. Ultracentrifugación en gradiente de densidad se lleva a cabo típicamente con soluciones densas pero inertes, tales como sacarosa o cloruro de cesio para aislar y concentrar partículas virales 41. La separación física se basa en el tamaño y la densidad de flotación de las partículas virales. Por lo tanto, la elección apropiada del tamaño de poro del filtro y la preparación rigurosa de los gradientes son esenciales para aislar a las comunidades específicas virales, como el éxito de la recuperación física deVLP determina la comunidad aislado 41 (es decir, partículas virales que no pasan a través del filtro o caen dentro de la densidad de la extracción no serán detectados en el metagenoma). Después del aislamiento viral y la concentración, puede haber contaminación de material genómico no viral presente en la muestra tanto en la forma de ácidos nucleicos libres y microbiana y las células eucariotas. Por lo tanto, es crítico para verificar la pureza de las partículas virales en muestras (Figuras 1A y 1B). Un tratamiento de cloroformo se utiliza comúnmente para lisar las células restantes, seguido por tratamiento con nucleasa para degradar ácidos nucleicos libres antes de la extracción de ácido nucleico.

Una advertencia al flujo de trabajo presentado fue el uso de la separación en gradiente de densidad para aislar partículas virales ya que puede excluir partículas virales con envuelta que pueden ser demasiado boyante para entrar en el gradiente de CsCl. Una alternativa "-catch-all" método es omitir la SEPAR gradiente de densidadación y aislar el ADN de la comunidad a partir de los 0,45 m - filtrados tratados con cloroformo y DNasa I. Este método también es adecuado para dar cabida a pequeños volúmenes de muestra, como los de hisopos o plasma sanguíneo. Sin embargo, esto puede resultar en la contaminación bacteriana cloroformo-resistente y una mayor cantidad de ADN extracelular DNasa I-resistente.

Protocolos de secuenciación actuales requieren de 1 ng a 1 mg de ácidos nucleicos para la preparación de la biblioteca de secuenciación de ADN mediante el cual los rendimientos más altos proporcionan una mayor variedad de opciones de secuenciación. La concentración de ADN de viromes generados a menudo va desde debajo del límite de detección a más de 200 ng / l. La cantidad de ácidos nucleicos virales recuperadas puede ser insuficiente para la preparación de biblioteca de secuenciación directa. En tales casos, la amplificación de ácido nucleico es esencial. Linker amplificación escopeta bibliotecas (LASLs) 2,42,43 y amplificación del genoma basado en múltiples desplazamientos de amplificación (MDA) son los doslos métodos más comúnmente utilizados para generar suficiente ADN para la secuenciación. MDA métodos tales como los basados ​​en ADN polimerasa Phi29 se sabe que sufren de sesgos de amplificación, y pueden amplificar preferentemente ssDNA y DNA circular, lo que resulta en taxonómica no cuantitativo y caracterización funcional 44,45. Una versión optimizada del enfoque LASLs se ha demostrado que sólo introducir sesgos mínimos, promueve una mayor sensibilidad (para pequeñas cantidades de material de partida), y se adapta fácilmente para diferentes plataformas de secuenciación 43. Sin embargo, el enfoque tiene muchos pasos, requiere un equipo especializado para minimizar la pérdida de ADN, y se limita a plantillas de ADN de doble cadena. En nuestro laboratorio, este enfoque se ha adaptado con éxito para amplificar cantidad detectable e indetectable de ADN extraído de lavage- broncoalveolar, VLP derivadas de agua coral- y marinos (no publicados y Hurwitz et al. 46).

El desarrollo de las tuberías de análisis de datos tiene classically sido uno de los aspectos más desafiantes de análisis de metagenómica viral debido a la naturaleza muy diversa y en gran parte desconocida de las comunidades virales. Si bien se estima que hay 10 8 genotipos virales en la biosfera, bases de datos actualizadas virales actuales contener ~ 4.000 genomas virales, que es aproximadamente 1 / número 100.000 de esta diversidad viral totales aproximados. Por lo tanto, búsquedas basadas en similitud (tales como BLAST 47) para la asignación taxonómica y funcional en metagenomes virales poseen desafíos inherentes. Muchas secuencias de dejar de tener importantes similitudes con genomas en la base de datos y, por tanto, se clasifican como desconocido. A pesar de que las búsquedas basadas en homología son las aplicaciones más importantes para la asignación de la taxonomía y la función de secuencia de datos, enfoques alternativos basados ​​en el análisis de bases de datos independientes se han desarrollado 48- 50. Fancello et al. 51 proporcionan una revisión completa de herramientas computacionales y algoritmos utilizados en Viral metagenómica.

Microbiana metagenómica

Típicamente, la cantidad total de ADN extraído de las comunidades hipotónicas lisis tratados microbianos (ADN-HL) van de 20 ng a 5 mg. El rendimiento depende en gran medida del estado de salud del paciente y la cantidad de muestra de esputo recogidos, que explica las variaciones observadas en el rendimiento total de HL-ADN extraído en este estudio (Tabla 2). Los pasos críticos para generar datos de la secuencia de buena calidad dependen de la calidad de las bibliotecas de secuenciación generados. La Figura 2 muestra un intervalo de tamaño típico para las bibliotecas de secuenciación generados a partir de ADN microbiano derivado de esputo CF utilizando un procedimiento de fragmentación de ADN basado en enzimática. El tamaño óptimo de la biblioteca depende de la elección de la plataforma de secuenciación y la aplicación, y por lo tanto, el procedimiento de fragmentación puede ser optimizado, si es necesario, a través de enfoques alternativos, tales como sonicación y la nebulización. Además delos resultados representativos presentados, el éxito del método presentado en el esputo CF recogida en múltiples pacientes a través de múltiples puntos de tiempo también se ilustra en Lim et al. (2012) 9 y Lim et al. (2014) 10.

Estudios previos 9,10 sugieren que cada paciente alberga un conjunto único de la comunidad microbiana que cambia con el tiempo, lo cual refleja la persistencia de los principales actores de la comunidad, mientras que las fluctuaciones son probablemente debido a perturbaciones tales como los tratamientos con antibióticos. Ya sea que estas fluctuaciones se producen a diario, incluso sin perturbaciones externas o por procedimiento de muestreo y procesamiento de la muestra, se encuentra todavía en cuestión. Basado en el metagenomic-DNA HL y análisis amplicón 16S rDNA, la toma de muestras longitudinal 7-días muestra que la fluctuación diaria de perfiles microbianos sin perturbación antibiótico (Día 1, 2, y 3) fue mínima (Figuras 3A y 3B). Tras la introla producción de antibióticos orales inmediatamente después de la toma de muestras Día 3, los cambios en el perfil de la comunidad se hicieron evidentes en el Día 4. Mientras que el antibiótico ciprofloxacino se dirige a un amplio espectro de patógenos bacterianos conocidos tales como P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus y la neumonía, el tratamiento aumentó la abundancia relativa de P. aeruginosa, mientras que la disminución de la Streptococcus spp. y P. melaninogenica. Para el día 6, la comunidad se recuperó lentamente a la estructura inicial de la comunidad de partida. Los resultados sugieren que las fluctuaciones de los perfiles microbianos dentro de un solo paciente es más probable debido a las perturbaciones de la comunidad en las vías respiratorias.

Dada la coherencia entre los perfiles microbianos de las bibliotecas y metagenomes 16S ADNr de ADN derivado de HL, descartamos los sesgos procedentes de los cebadores de 16S rRNA utilizadas en este estudio. Una posible explicación para las diferencias observadas a través de 16S rDNA taxonómicoAL perfiles generados a partir de ADN total y el ADN derivado de HL (Figura 3B) puede ser la presencia de altas cantidades de Pseudomonas spp. ADN extracelular después del tratamiento antibiótico. Esto es apoyado por los hallazgos de que estas diferencias fueron más evidentes en el día 7, tres días después del tratamiento de antibióticos, que se enfoca en Pseudomonas spp. además de otros. El ciprofloxacino se utiliza comúnmente como el tratamiento de primera línea en pacientes con FQ y P. crónica infección aeruginosa aunque su espectro de actividad incluye la mayoría de los patógenos CF-asociado. La hipótesis de que el tratamiento antibiótico erradica comunidades susceptibles incluyendo Streptococcus spp. y por lo tanto la creación de un nicho de llenado por resistentes P. aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa puede ganar resistencia a través del aumento de sus comunidades de biopelícula y el ADN extracelular se ha demostrado para ser el principal soporte estructural de su arquitectura biofilm 52. A pesar de que tque la estructura comunitaria se recuperó, el ADN extracelular puede haber permanecido en el esputo CF. Por lo tanto, estos datos sugieren que la lisis hipotónica y los pasos de lavado que se presentan en este flujo de trabajo potencialmente beneficiarse en no sólo la eliminación de la ADN humano derivado, pero el ADN extracelular derivado también microbiana-que pueden falsear los perfiles microbianos reales.

Metatranscriptomics

Una alta calidad metatranscriptome debe contener relativamente pocas secuencias de ARN ribosomal (rRNA) y representan un muestreo imparcial de las transcripciones de la comunidad (ARNm). Debido a la corta vida media y la cantidad limitada de mRNA, es crítico que el protocolo, tal como se presenta aquí, minimiza la manipulación de la muestra para maximizar el número de transcripciones recuperados.

En los últimos años, varios enfoques para el agotamiento de rRNA se han desarrollado y adaptado en kits disponibles comercialmente. Estos incluyen Microb Enrich, Ribo-Zero, y muestra específica h sustractivoybridizations 53 que se basan en la hibridación de oligonucleótidos, y el ARNm-ONLY kit que se basa en ARN centrarse en la actividad enzimática que contiene una exonucleasa 'monofosfato 5. Además, varios enfoques para enriquecimientos de ARNm tales como el Kit II-bacterias MessageAmp que preferentemente polyadenylates y amplifica ARN lineal están también disponibles. Algunos de estos métodos (por ejemplo, ARNm-ONLY, Microb E xpress y la MessageAmp) se utilizan simultáneamente para una eficiencia óptima. Sin embargo, la eficacia de todos estos enfoques es limitado, especialmente cuando se trabaja con rRNA parcialmente degradada, como a menudo observado en el ARN total extraído de muestras de CF. La amplificación del ARN dependiente de poliadenilación no se puede utilizar para generar metatranscriptomes que consisten tanto en ARNm eucariota y procariota. Además, el poli (A) de cola añaden a las secuencias pueden reduce la cantidad de datos de secuencias útiles. Las regiones con tramos de homopolímero tenderán a tener puntuaciones más bajas de calidad, causing un importante número de lecturas que ser filtrados por secuenciación y software de post-secuenciación, y la duración media de lectura útil tras el recorte de colas de poli (A) se reducirán significativamente 54.

Tratar con las comunidades microbianas CF complejas y ARN parcialmente degradado (Figuras 4A y 4C), nuestro estudio anterior mostró que el método de hibridación de captura por el kit de oro Ribo-Zero fue más eficaz en la eliminación de ambos rRNA humana y microbiana en comparación con los tratamientos combinan utilizando otros kits 9 (Tabla 3). Los datos resultantes permite el análisis simultáneo de ambos huésped humano y transcripciones microbianas. Dependiendo del rendimiento y calidad de RNA, así como la elección final de la plataforma de secuenciación, muchos de estos procesos, incluyendo la etapa de síntesis de ADNc, pueden simplificarse con la generación de bibliotecas de secuenciación. Por ejemplo, el ARN tratado Ribo-Zero puede ser utilizado para hacer libra secuenciación metatranscriptomeRies usando el kit de ScriptSeq RNA-Seq Biblioteca Preparación.

Análisis de metagenómica de comunidades asociadas a animales proporciona una representación completa de la entidad funcional global que incluye la acogida y sus comunidades asociadas. El flujo de trabajo que aquí se presenta es adaptable a una variedad de muestras asociadas con animales complejos, especialmente aquellos que contienen moco espeso, altas cantidades de restos de células, el ADN extracelular, proteínas y complejos de glicoproteína, así como células huésped, además de la microbiana y viral deseado partículas. A pesar de que las partículas virales y microbianas se pueden perder en cada paso, las partículas de aislamiento y purificación son esenciales para minimizar la cantidad de ADN del huésped. Si bien los datos metagenómica ofrece potenciales metabólicas de las comunidades examinados, metatranscriptomics complementar este revelando la expresión diferencial de funciones codificadas 9. Una evaluación integral de los datos de genómica y transcripciones ha producido nuevas insERECHOS a la dinámica de las interacciones de la comunidad y facilita el desarrollo de la mejora de las terapias 9,10,55.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (1 R01 GM095384-01) otorgado a Bosque Rohwer. Agradecemos Epicentro, una compañía de Illumina para proporcionar un acceso temprano a kits Ribo-Zero Epidemiología. Damos las gracias a Marcos Hatay para el diseño y producción de el soporte del tubo de ultracentrifugación. Damos las gracias a Andreas Haas y Benjamin Knowles para lecturas críticas y discusiones del manuscrito, y Lauren Paul para ayudar al proceso de filmación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer Life Technologies 10296-028 TRIzol LS Reagent was used in this study
Silica beads; 0.1 to 0.15 mm Cole-Parmer YO-36270-62 Zirconia-silicate beads were used in this study
Dithiothreitol, molecular grade (dry powder) Promega V3155 Can be purchased from any other company
Sterile syringe filter; 0.45 µm pore size hydrophilic PVDF membrane Millipore SLHV033RS
DNase I enzyme  Calbiochem 260913
Sterile syringe filter; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-13 Diameter: 25 mm
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman 344059 9/16 x 3 ½ in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation
SW41 Ti Rotor Beckman 333790
SS-34 fixed angle rotor Thermo Scientific 28020
Phi29 DNA polymerase Monserate Biotech 4001 10 U/µl
Phi29 Random Hexamer Thermo Scientific S0181 Previously bought from Fidelity Systems
Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 µm pore size FisherScientific 09-926-34 Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm
SYBR Gold nucleic acid gel stain Life Technologies S-11494
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-100ML
RNase-free DNase I  NEB M0303S Can be purchased from any other company
Glycogen, RNA grade FisherScientific FERR0551 Can be purchased from any other company
Oak Ridge high-speed centrifuge tubes FisherScientific 05-562-16B For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor
Total rRNA removal kit Epicentre MRZE724 ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation
Cesium chloride  FisherScientific BP1595-500
Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H5882-100G

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