Protocol
1. H.幽门螺旋杆菌生长的铁可用性和共培养的人胃癌上皮细胞的各种条件
- 选择H.幽门螺杆菌菌株PMSS1对于这些研究，因为它有一个完整的cag致病岛，并表示一个功能IV型分泌系统。还利用同基因的突变体保持架 （PMSSIΔ 笼 ）作为阴性对照。上生长，在5％CO 2的存在下补充有5％绵羊血（血琼脂平板上）放置24小时，在37℃TSA平板的细菌。
注：准备试剂和作为材料和设备表所列组装材料。最终浓度为各试剂列在括号中。 - 刮用无菌棉签从板菌，接种到由以下成分制备改性的布鲁氏肉汤（见材料和设备表），并补充有胆固醇。隔夜孵育培养37°下在室温空气中补充了5％CO 2的振荡下每分钟（rpm）200旋转。
注：胆固醇代替胎牛血清由于这一事实，即血清是复杂的;含有大量养分铁源如血红素引起变性的结果。 - 对细菌培养的天，种子AGS人胃上皮细胞（ATCC CRL-1739）上在12孔板（每孔约1×10 5个细胞）聚-D-赖氨酸处理过的盖玻片。
- 第二天，稀释细菌培养物，以0.3的OD 600在单独或补充有100μM的氯化铁，200μM联吡啶（一种合成的铁螯合剂）或200μM的联吡啶加250微米的FeCl 3改性布鲁氏肉汤中。室内空气中补充有5％的CO 2与200rpm振荡孵育这些培养4小时，在37℃下。
- 细菌离心机在1000×g离心收集细胞，重悬我之前取出上清液为n的新鲜改性布鲁氏肉汤等体积的补充有胆固醇。该培养物（OD 600 = 1.0 = 5.5×10 8个细胞/ ml）的测量OD 600和添加细菌的上皮细胞在感染20的复数（MOI）的多重性：1。进行连续稀释和平板的菌体到血琼脂平板上，以评估细菌细胞生存力。
- 孵育H.幽门螺杆菌和AGS人胃上皮细胞共培养4小时，在37℃下在5％CO 2的静态条件下进行扫描电子显微镜（SEM）样品制备之前的存在。
2.扫描电镜样品制备可视化H.幽门螺杆菌 CAG-T4SS霹雳
- 删除H.幽门螺杆菌和AGS共培养物从培养箱和倾析培养物上清液（保存为IL-8的ELISA法）。用0.05M二甲胂酸钠缓冲液（pH7.4）轻轻洗涤三次。固定的样品在室温下2-4小时，在2.0％多聚甲醛的溶液，2.5％戊二醛，和0.05M的二甲胂酸钠缓冲液中。主固定后，冲洗样本三次用0.05M二甲胂酸钠缓冲液中。
- 在两个连续的10分钟的固定步骤，可以执行用0.1％四氧化锇的辅助固定在0.05M二甲胂酸钠缓冲液中。次级固定后，冲洗样本三次用0.05M二甲胂酸钠缓冲液中。
- 初级和次级固定后，脱水通过顺序洗涤样品以增加乙醇的浓度按表1。
- 乙醇脱水后，进行液体二氧化碳的三个相继洗涤。在一个关键点上使用了一个临界点干燥机在31.1℃的高温1073 PSI和压力，然后干燥样品。
- 山盖玻片上铝的SEM样品存根并用细线胶体银在样品边缘漆，以达到适当的接地和避免在扫描电镜成像充电。
- 涂层样品为5nm金 - 钯，用溅射涂层机，以增加样品的二次电子信号和边缘效应。
高分辨率扫描电镜分析3.成像参数
- 鉴于样品与场致发射枪扫描电子显微镜（FEG-SEM）。
- 图像中在5-10毫米的工作距离的高真空状态。
- 加速电压设定为5kV。
- 设定光斑大小为2-2.5。
- 倾斜15〜25度之间的样品来实现宿主 - 病原体界面的更好的视野。
- 优先考虑成像的细菌粘附于上皮细胞的高倍率视野的边缘，作为宿主 - 病原体相互作用的这些区域富含菌毛形成的细菌。
4.统计分析，以评估霹雳量化值
- 分析H.使用ImageJ软件幽门恰-T4SS菌毛量化菌毛/细胞的细胞数目以及百分比表现出菌毛苯丙氨酸按下面的说明NoType在。
- 在ImageJ的软件打开的显微照片文件。识别菌毛作为细菌细胞和宿主细胞，以均匀的宽度（10-13纳米）和长度（60-150纳米）之间形成的结构。
注：菌毛结构上同基因的菌株，如Δ 笼突变株，其中海港基因的失活编码主要ATP酶的权力IV型分泌菌毛装配存在于野生菌株，但缺席。 - 通过绘制与直线工具行，然后单击“分析”选项卡上的校准测量工具。从下拉菜单中选择“设置缩放”，然后输入放大倍率栏数值成箱标有“已知的距离”和长度的单位设置为相应的设置（纳米）。点击“确定”。
- 使用直线工具绘制过菌毛的长度或宽度测量CAG-T4SS菌毛，然后按“Ctrl-M”来衡量每个菌毛。观察一个对话框，与测得的值。记录这些值或复制并粘贴到电子表格程序。
- 使用的长度和宽度参数预先确定，不适合恰-T4SS的轮廓24，无视特征。然后量化的基础上是10-13纳米的宽度和60-150纳米的长度截断部位内的值菌毛的数目。
- 通过使用GraphPad Prism软件的双尾学生t检验进行统计分析菌毛的量化。
5.可选：评估IL-8分泌的关联与菌毛生产
- 利用上清液从步骤2.1，按照制造商的试剂盒说明书（见材料和设备表）执行IL-8 ELISA。
- 分析IL-8的由宿主细胞分泌的，并计算百分比的IL-8的诱导相对于WT PMSS1单独在培养基中生长。通过执行使用GraphPad Prism让双尾t检验进行统计分析ftware。
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Representative Results
在这份报告中，我们已经证明，不同的铁可用性的条件下具有调节H.能力幽门螺杆菌 CAG-T4SS菌毛的生物合成在主机病原体接口。当在中单独培养，H。幽门螺旋杆菌形成平均3菌毛/细胞。当H.幽门螺旋杆菌是生长在铁耗尽条件（用合成的螯合剂联吡啶基），这些亚抑制细菌生长（ 图1）中，细菌产生无数恰-T4SS菌毛（〜7菌毛/细胞）共培养人胃癌细胞（ 图2）。相反，当养分铁外源性来源是目前，恰-T4SS菌毛的形成被抑制（小于1菌毛/细胞中的FE样本，小于1菌毛/细胞中的FE + DIP样品）（ 图2）。该菌毛在宿主-病原体接口的定量表明，在铁限制，H条件幽门螺杆菌显示出2倍的增加在恰-T4SS菌毛（对<0.000 1）和百分之菌毛细胞增加了11％（P <0.05）相比，在单独的培养基中生长的细胞（ 图3）。有趣的是，恰-T4SS的活性，如通过主机的IL-8分泌的测量，提高107％的铁限制条件下与过量的铁的情况相比，单独的培养基（p值= 0.03，且p的条件下压制49％<支持的SEM数据0.001）的结果。然而，菌毛尺寸保持铁的可用性所有条件都是一致的（ 图4）。此外，铁的可用性不改变菌毛的生物合成笼突变体的表面上，也不会改变本等基因衍生物的诱导从宿主细胞中的IL-8的响应能力，支持这一假设演示的结构，实际上CAG-T4SS而不是其他不相关的表面特征。
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图1：在铁可用性的各种条件来确定细菌的存活率H.幽门螺旋杆菌是孤独的改良布氏肉汤培养（中单独），或辅以100微米氯化铁（FE），200微米吡啶（DIP），或200微米吡啶加250微米的氯化铁（FE + DIP）。细菌事先进行系列稀释和平板接种在细菌培养基中温育2天，在37℃下在5％CO 2的存在。菌落计数和集落形成单位/算出毫升（CFU / ml）中。条表示平均值的3次独立实验+/- SEM。治疗DIP，FE或FE + DIP没有显著改变细菌的生存能力。
图2：高RH的esolution扫描电子显微镜分析幽门螺杆菌 CAG-T4SS菌毛。细菌单独生长在A）的介质中，B）的培养基中补充有100微米的FeCl 3，C）的培养基中添加200μM的吡啶基，或D）的培养基中添加200μM的联吡啶加250微米的FeCl 3之前的共培养与AGS人胃细胞。箭头表示形成于宿主 - 病原体接口CAG-T4SS菌毛。样品通过高分辨率扫描电子显微镜进行分析，以评估恰-T4SS生物合成。低铁的使用状况增加CAG-T4SS菌毛形成的发生率，而过多的速效养分铁条件抑制CAG-T4SS菌毛形成。
图3：菌毛/细胞和百分比的定量菌毛细胞的各种培养铁可用性的条件。细菌的生长改良布氏肉汤单独（单独的培养基），或培养基中添加100μM 氯化铁（FE），200微米吡啶（DIP），或200微米吡啶加250微米的氯化铁（FE + DIP），统筹前培养人胃癌上皮细胞。样品通过高分辨率扫描电子显微镜和菌毛被使用ImageJ软件列举了分析。 A）的散点图每个细胞（* P <0.000相对于单独介质菌毛）和菌毛细胞（* P <0.05相对于单独的培养基）从60-112细胞衍生的每培养条件是来自于3个独立的B）的条形图，描绘百分生物实验。
图4：由细胞中的铁的可用性的各种条件下培养测定菌毛尺寸。 BACTERIA生长在改良布氏肉汤单独（单独的培养基），或培养基中添加100μM 氯化铁（FE），200微米吡啶（DIP），或200微米吡啶加250微米的氯化铁（FE + DIP），统筹前培养人胃癌上皮细胞。样品通过高分辨率扫描电子显微镜分析和菌毛尺寸分别使用ImageJ软件测定。 A）菌毛的宽度是所有条件中，平均13.1±2.4纳米。 B）菌毛的长度是所有条件中，平均75.8 +/- 16.0纳米。在菌毛尺寸没有显著差异是出现在铁可用性的各种条件。
参考图1：H的高分辨率扫描电子显微镜分析幽门螺旋杆菌突变笼中铁可用性的各种条件。细菌生长在一）补充了100微米的氯化铁中，B）培养基中添加200微米的联吡啶（DIP）或C）的培养基中添加200μM的联吡啶（DIP）加250微米的FeCl 3之前，共培养与AGS胃癌细胞。样品通过高分辨率扫描电子显微镜进行分析，以评估恰-T4SS生物合成。低或高铁的条件不调节任何恰无关菌毛的生物合成，支持这一假设可视化在图2中的结构是恰-T4SS菌毛。
补充图2：主机的IL-8分泌的响应于在不同的铁可用性条件下生长的细菌的ELISA分析。野生型（白色柱）或笼突变体（灰色柱）的细菌培养在改性布鲁氏肉汤单独（中等独居），或培养基中添加100μM的氯化铁（FE），200μM联吡啶（DIP），或者200μM的联吡啶加250林M的FeCl 3（FE + DIP）之前，共培养与人胃上皮细胞。铁限制导致增加的IL-8，主机响应是依赖于恰-T4SS活性。横道平均值+/- SEM，由3个独立的生物实验而得。 （* P <0.05相比PMSS1单独在培养基中生长）。
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Discussion
铁是大多数生命形式，包括细菌病原体必需的微量营养素。在努力限制入侵微生物的生存能力，脊椎动物宿主螯合营养铁在被称为“营养免疫”18的处理。响应于此，细菌病原体已经进化为使用铁作为全局信号传导分子以感测周围的环境并调节阐述毒力的功能，如铁采集系统，毒素和毒素分泌机械19,20。
幽门螺杆菌需要微量营养素如铁，锌和镁来生长22，并且可以使用替代铁源，如血红素，血红蛋白，转铁蛋白，乳铁蛋白和23。H.幽门螺旋杆菌 ，像最成功的病原体，已经演变致病因素广泛的曲目，以帮助它清除营养素铁从主机21。一种毒力因子，相关蛋白，效应molecu在恰-T4SS的文件，被牵连在重路由转从极化细胞的基底侧的顶端面在那里它可以容易地使用的细菌细胞作为营养铁源和促进复制15。因此，它似乎是一个直观的进化策略，以促进相关蛋白的分泌的低铁可用性的条件。
在H.幽门恰-T4SS是一个重要的细菌细胞器，由于促炎性宿主细胞应答它引出。在恰-T4SS的效果已经得到很好的研究在两种共培养和感染的动物模型。然而，这种毒素分泌系统的大分子结构和组合物的研究已经受到阻碍，缺乏高分辨率成像协议。我们之前发表的研究报告中CAG-T4SS报道高分辨电子显微镜平均细菌细胞4 CAG-T4SS菌毛分析24。我们的改进方法提供一个健壮的成像技术通过使用促进生产的细菌细胞的表面上的该特性的培养技术来可视化恰-T4SS。的培养技术在高分辨率场致发射枪扫描电子显微镜一起利用是该成像协议的关键。在CAG-T4SS表面特征的双重富集是一个显著的增加对于有意进行免疫组化调查分析，如免疫荧光或免疫沉淀技术进一步表征CAG-T4SS的亚细胞定位或组成。一旦恰-T4SS的高分辨电子显微成像已经掌握了，但是也可以开发其它的应用，如免疫标记，相对于恰-T4SS菌毛25，以确定细菌蛋白质的位置。
我们的技术的一个限制是，研究者仍限于USI纳克的共培养系统中的恰-T4SS的可视化。在单个字段中，只有一个H的子集幽门螺杆菌在正常培养条件下形成这些结构（约50％-70％，参见图3图B）。如此众多的细胞在一个字段将是非菌毛。它是未知的原因，在相同的位置中存在这些亚群，但这些细胞都总是占菌毛/细胞和细胞的百分比均与菌毛的表面上的量化值之内。因为恰-T4SS仅在宿主细菌的界面观察到，在扫描电镜样品制备中的初级和次级固定步骤是为蛋白质结构和真核和原核细胞的细胞膜的保护的关键。然而，如果定影步骤进行长于所概述的，或者如果该解决方案并不新鲜制备的过定影可能发生。如果发生过固定，样品SEM下观察和CAG-T4SS将这个被屏蔽的时候都会有一个石质的外观。要trouble拍摄，使用较低浓度的固定剂和/或更少的时间下培养在固定剂的存在下重复上述的SEM样品制备。
共培养系统也因大量宿主蛋白的污染使得生化特征（如质谱分析）繁琐。然而，理解该规范生产这种细菌分泌系统的分子机制可能最终导致新的技术，这将触发在不存在宿主细胞恰-T4SS菌毛形成。这将极大地提高了分离和纯化技术，用于生化分析。
总之，我们报告说，限制铁的可用性导致H.增加生产条件幽门恰-T4SS可以由高分辨率的扫描电子显微镜技术来可视化。我们还在宿主 - 病原体接口通信报告该表面特征的铁依赖抑制CE。该测定中可以被优化，并用于形成铁调节毒素分泌物和广泛地适用于各种宿主 - 微生物相互作用许多细菌病原体。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified brucella broth | |||
| Peptone from casein (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptic digest of animal tissue (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Yeast extract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Sodium chloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 or 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Modified RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Fetal bovine serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Electron Microscopy Preparation | |||
| Paraformaldehyde (2.0% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2.5% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Sodium cacodylate (0.05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0.1% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absolute) | Sigma | E7023 | |
| Colloidal silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM sample stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 Secretion Evaluation | |||
| Quantikine IL-8 ELISA kit | R&D Systems | D8000C |
References
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