Protocol
1. H. Crescimento pylori em diferentes condições de Ferro Disponibilidade e Co-cultura com gástrico humano células epiteliais
- Selecione H. pylori PMSS1 tensão para estes estudos porque tem uma ilha cag patogenicidade intacta e expressa um sistema de secreção do tipo IV em funcionamento. Também utilizam uma gaiola mutante isogênico (PMSSI Δ Cage) como controle negativo. Cresça as bactérias em placas de TSA suplementadas com 5% de sangue de carneiro (placas de agar de sangue) durante 24 horas a 37 ° C na presença de 5% de CO 2.
NOTA: Preparar reagentes e montar materiais, conforme descrito na Tabela de Materiais e Equipamentos. Concentrações finais para cada reagente é listado entre parênteses. - Raspar as bactérias da placa, utilizando um aplicador com ponta de algodão esterilizado e inocular em caldo Brucella modificado preparado a partir de componentes (ver Materiais e Equipamento Tabela) e suplementado com colesterol. Incubar durante a noite a 37 culturas° C em ar ambiente enriquecido com 5% de CO 2 com agitação a 200 rotações por minuto (rpm).
NOTA: O colesterol é utilizado em vez de soro fetal de bovino devido ao fato de que o soro é complexo; contendo numerosas fontes de nutrientes tais como ferro heme que faz com que a variabilidade nos resultados. - No dia da cultura bacteriana, semear as células epiteliais gástricas humanas AGS (ATCC CRL-1739) para poli-D-lisina lamelas tratadas, em placas de 12 poços (cerca de 1 x 10 5 células por poço).
- No dia seguinte, dilui-se culturas bacterianas para um OD600 de 0,3 em caldo Brucella modificado sozinho ou suplementado com 100 | iM de FeCl3, 200 uM dipiridilo (um quelante de ferro sintético), ou 200 uM dipiridilo mais 250? M FeCl3. Incubar estas culturas durante 4 horas a 37 ° C em ar ambiente enriquecido com 5% de CO 2 com agitação a 200 rpm.
- Bactérias centrifugar a 1000 xg para coletar células e remover o sobrenadante antes de ressuspender in um volume igual de caldo de Brucella modificado fresco suplementado com colesterol. Medida OD600 da cultura (DO600 = 1.0 = 5.5 x 10 8 células / ml) e adicionar bactérias às células epiteliais de uma multiplicidade de infecção (MOI) de 20: 1. Efectuar diluições em série e as células bacterianas placa em placas de agar de sangue para avaliar a viabilidade celular bacteriana.
- Incubar H. células epiteliais gástricas humanas pylori e AGS co-culturas durante 4 horas a 37 ° C na presença de 5% de CO 2 em condições estáticas, antes de realizar a microscopia electrónica de varrimento (MEV), a preparação da amostra.
2. SEM Preparação de Amostras para Visualize H. pylori Cag-T4SS Pili
- Remover H. pylori e AGS co-culturas a partir do sobrenadante incubadora e decantar cultura (com exceção de IL-8 ELISA). Lavar cuidadosamente três vezes com tampão de 0,05 M de cacodilato de sódio (pH 7,4). Fix amostras para 2-4 horas à temperatura ambiente numa solução de 2,0% de paraformaldeído, 2,5% De glutaraldeido, e tampão de cacodilato de sódio 0,05 M. Após a fixação primária, lavar as amostras três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,05 M.
- Realizar fixação secundária usando 0,1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,05 M em dois passos sequenciais de 10 min de fixação. Após a fixação secundária, lavar as amostras três vezes com tampão de cacodilato de sódio 0,05 M.
- Após a fixação primária e secundária, desidratar amostras por lavagem sequencial com concentrações crescentes de etanol conforme a Tabela 1.
- Após a desidratação de etanol, realizar três lavagens seqüenciais de dióxido de carbono líquido. Em seguida, as amostras secas em um ponto crítico, utilizando uma máquina de secar ponto crítico a uma temperatura de 31,1 ºC e pressão de 1073 psi.
- Monte lamelas em topos de amostra de alumínio SEM e pintar com uma linha fina de prata coloidal na borda da amostra para alcançar o aterramento adequado e evitar a cobrança durante SEM imagem.
- Amostras de revestimento com 5 nm deouro-paládio usando uma máquina de revestimento por pulverização catódica para aumentar sinal de elétrons secundários da amostra e efeito de borda.
3. Parâmetros de imagem para análises alta resolução MEV
- Ver amostras com um campo-Emission Gun Microscópio Eletrônico de Varredura (FEG-SEM).
- Imagem num modo alto vácuo a uma distância de trabalho de 5-10 mm.
- Defina a tensão de aceleração de 5 kV.
- Defina o tamanho do ponto de 2-2,5.
- Incline a amostra entre 15-25 graus para alcançar uma melhor visão da interface do patógeno-hospedeiro.
- Priorize imagiologia bactérias aderentes às bordas das células epiteliais para visualização de alta ampliação, uma vez que estas áreas de interacção hospedeiro-patogénio são enriquecidas para as bactérias formadoras de pili.
4. As análises estatísticas para avaliar as Pili quantificações
- Analisar H. pylori pili-Cag T4SS utilizando o software ImageJ para quantificar o número de pili / célula, bem como a percentagem de células que manifestam o piliated phenotype acordo com as instruções abaixo.
- Arquivos micrografia abertas em software ImageJ. Identificar pili como estruturas formadas entre a célula e célula hospedeira bacteriana, com largura uniforme (10-13 nm) e comprimento (60-150 nm).
NOTA: A estrutura pilus está presente em cepas bacterianas WT, mas ausente em linhagens isogênicas como Δ gaiola cepas mutantes, que abrigam uma inativação no gene que codifica o principal ATPase que a montagem tipo poderes secreção IV pilus. - Calibrar a ferramenta de medição por desenhar uma linha com a ferramenta de linha reta e em seguida, clicando na guia "Analisar". Selecione "Set Scale" no menu suspenso e digite o valor bar ampliação na caixa chamada "Distância Known" e defina a unidade de comprimento para a definição apropriada (nm). Clique em "OK".
- Meça Cag-T4SS pili usando a ferramenta de linha reta para desenhar sobre o comprimento ou a largura do pilus e pressione "Ctrl-M" para medir cada pilus. Observar uma caixa de diálogo com os valores medidos. Anote esses valores ou copiar e colar em um programa de planilha.
- Use o comprimento ea largura de parâmetros previamente estabelecidos 24, características da negligência que não se encaixam no perfil de CAG-T4SS. Em seguida, quantificar o número de pili com base em valores que estão dentro dos pontos de corte 10-13 nm de largura e comprimento de 60-150 nm.
- Analisar a quantificação dos pili estatisticamente pelo teste t bicaudal de Student utilizando o software GraphPad Prism.
5. Opcional: Avaliação da secreção de IL-8 para correlacionar com Pilus Produção
- Usando sobrenadantes do Passo 2.1, realizar um ELISA de IL-8 de acordo com as instruções do fabricante, com o kit (Ver Materiais e Equipamento Tabela).
- Analisar a IL-8 segregada pelas células hospedeiras e calcular a percentagem de IL-8 com respeito à indução WT PMSS1 cultivadas em meio sozinho. Realizar a análise estatística usando bicaudal teste t de Student utilizando GraphPad Prism assimftware.
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Representative Results
Neste relatório, nós demonstramos que as condições de disponibilidade diferenciada de ferro tem a capacidade de modular H. pylori Cag-T4SS biogénese pilus na interface patógeno hospedeiro. Quando cultivados em meio sozinho, H. pylori constitui uma média de 3 pili / célula. Quando H. pylori é cultivada em condições de ferro esgotar (utilizando o quelante de dipiridilo sintética) que são sub-inibitório para o crescimento bacteriano (Figura 1), as bactérias produzem numerosos Cag-T4SS pili (~ 7 pili / célula) quando co-cultivadas com células gástricas humanas (Figura 2). Por outro lado, quando uma fonte exógena de ferro nutriente está presente, a formação de Cag-T4SS pili é reprimido (menos de 1 pilus / célula a amostra FE, menos de 1 pilus / célula a amostra DIP FE +) (Figura 2). Quantificação do pili na interface patógeno-hospedeiro revela que, em condições de restrição de ferro, H. pylori exibe um aumento de 2 vezes na Cag-T4SS pili (p <0,000 1) e as células aumenta piliated por cento por 11% (p <0,05) em comparação com células cultivadas em meio sozinho (Figura 3). Curiosamente, a actividade da Cag-T4SS, tal como medido pelo hospedeiro a secreção de IL-8, é aumentada de 107% sob condições de restrição de ferro e reprimido 49% sob condições de excesso de disponibilidade de ferro em comparação com meio sozinho (p = 0,03 e p < 0,001, respectivamente), um resultado que suporta os dados SEM. No entanto, as dimensões pili permanecem consistente entre todas as condições de disponibilidade de ferro (Figura 4). Além disso, a disponibilidade de ferro não altera a biogénese de pili na superfície de um mutante gaiola, nem altera a capacidade deste derivado isogénico para induzir uma IL-8 de resposta a partir de células hospedeiras, suportando a hipótese de que as estruturas demonstrados são, de facto, cag-T4SS e não uma característica de superfície independente suplementar.
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Figura 1:. Viabilidade bacteriana determinada em várias condições de disponibilidade de ferro H. pylori foi cultivado em caldo de Brucella modificado sozinho (só meio), ou suplementado com 100 | iM de FeCl3 (FE), 200 uM de dipiridilo (DIP), ou 200 uM dipiridilo mais 250? M FeCl3 (FE + DIP). As bactérias foram diluídas em série e plaqueadas em meio de cultura bacteriológica antes da incubação durante 2 dias a 37 ° C na presença de 5% de CO 2. As colónias foram contadas e unidades formadoras de colónias / ml (UFC / ml) foram calculadas. Barras indicam a média de três experimentos independentes +/- SEM. O tratamento com o DIP, FE, ou FE + DIP não altera significativamente a viabilidade bacteriana.
Figura 2: High ranalisa microscopia eletrônica de varredura eSolution de H. pylori Cag-T4SS pili. As bactérias foram cultivadas em A) meio apenas, B) meio suplementado com 100 | iM de FeCl3, C) meio suplementado com 200 uM de dipiridilo, ou D) meio suplementado com 200 uM dipiridilo além de 250 fiM FeCl3 antes da co-cultura com humano AGS as células gástricas. As setas indicam Cag-T4SS pili formado na interface patógeno-hospedeiro. As amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura de alta resolução para avaliar Cag-T4SS biogênese. Condições de baixa disponibilidade de ferro aumentam a prevalência de formação de pilus Cag-T4SS, enquanto condições de excesso de nutrientes disponíveis ferro reprimir a formação de pilus Cag-T4SS.
Figura 3: Quantificação de pili / celular e cento piliated células cultivadas em várioscondições de disponibilidade de ferro. As bactérias foram cultivadas em caldo de brucela modificado isoladamente (meio sozinho) ou meio suplementado com 100 | iM de FeCl3 (FE), 200 uM de dipiridilo (DIP), ou 200 uM dipiridilo mais 250? M FeCl3 (FE + DIP) antes da co- cultura com células epiteliais gástricas humanas. As amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura de alta resolução e pili foram enumerados usando o software ImageJ. A) Dispersão de pili por célula (* p <0,0001 em comparação com meio sozinho) e B) Gráfico de barras que descreve a percentagem de células piliated (* p <0,05 em comparação com meio sozinho) derivados 60-112 células por cultura condição derivado de 3 separada experiências biológicas.
Figura 4: Dimensões Pilus medidos a partir de células cultivadas em diferentes condições de disponibilidade de ferro. Bacteria foram cultivadas em caldo de brucela modificado isoladamente (meio sozinho) ou meio suplementado com 100 | iM de FeCl3 (FE), 200 uM de dipiridilo (DIP), ou 200 uM dipiridilo mais 250? M FeCl3 (FE + DIP) antes da co- cultura com células epiteliais gástricas humanas. As amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura de alta resolução e dimensões Pili foram medidos utilizando o software ImageJ. A) largura Pilus é uma média de 13,1 +/- 2,4 nm entre todas as condições. B) comprimento Pilus é uma média de 75,8 +/- 16,0 nm entre todas as condições. Não houve diferença significativa nas dimensões de pelos são vistos nas diversas condições de disponibilidade de ferro.
Figura Suplementar 1: análises de microscopia eletrônica de varredura de alta resolução de H. pylori gaiola mutante em diferentes condições de disponibilidade de ferro. As bactérias foram cultivadas em A) meio suplementado com 100 | iM de FeCl3, B) meio suplementado com 200 uM dipiridilo (DIP) ou C) meio suplementado com 200 uM dipiridilo (DIP) mais 250? M FeCl3 antes da co-cultura com células gástricas humanas AGS. As amostras foram analisadas por microscopia eletrônica de varredura de alta resolução para avaliar Cag-T4SS biogênese. Condições de baixo ou alto teor de ferro não modular qualquer biogênese pilus Cag-independente, apoiando a hipótese de que as estruturas visualizadas na Figura 2 são Cag-T4SS pili.
Suplementar Figura 2: análise de ELISA de acolhimento secreção de IL-8 em resposta a bactérias cultivadas em condições de disponibilidade de ferro variando. De tipo selvagem (barras brancas) ou mutante gaiola (barras cinzentas) as bactérias foram cultivadas em caldo de brucela modificado isoladamente (meio sozinho) ou meio suplementado com 100 | iM de FeCl3 (FE), 200 uM de dipiridilo (DIP), ou 200 uM dipiridilo além de 250 uM FeCl3 (FE + DIP) antes de co-cultura com células epiteliais gástricas humanos. Ferro resultados de restrição na produção aumentada de IL-8, A resposta do hospedeiro que é dependente de atividade Cag-T4SS. As barras indicam média +/- SEM, derivada a partir de 3 experiências biológicas distintas. (* P <0,05 em comparação com PMSS1 cultivadas apenas em meio).
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Discussion
O ferro é um micronutriente essencial para a maioria das formas de vida, incluindo patógenos bacterianos. Num esforço para restringir a viabilidade dos microorganismos invasores, hospedeiros vertebrados sequestrar ferro nutriente num processo conhecido como "imunidade nutricional" 18. Em resposta a isso, patógenos bacterianos evoluíram para usar o ferro como uma molécula de sinalização global para sentir seu entorno e regular a elaboração de características de virulência, tais como sistemas de aquisição de ferro, toxinas e toxina secreção máquinas 19,20.
H. pylori requer micronutrientes, tais como ferro, zinco e magnésio para crescer 22 e pode utilizar fontes de ferro alternativos, tais como heme, hemoglobina, transferrina, lactoferrina e 23. H. pylori, como a maioria dos patógenos de sucesso, evoluiu um vasto repertório de fatores de virulência para ajudar a limpar o ferro de nutrientes do hospedeiro 21. Um fator de virulência, merda, o molecu efetorasle do Cag-T4SS, está implicada na reencaminhamento de transferrina a partir do lado basolateral de células polarizadas para a superfície apical, onde ele pode ser facilmente utilizada pelas células bacterianas como uma fonte nutriente de ferro e promover a replicação 15. Assim, parece uma estratégia evolutiva intuitiva para promover a secreção de merda em condições de baixa disponibilidade de ferro.
O H. pylori Cag-T4SS é um organelo importante bacteriana, devido às respostas pró-inflamatórias da célula hospedeira que suscitados. Os efeitos da Cag-T4SS têm sido bem estudada em ambos os co-culturas e em modelos animais de infecção. No entanto, estudos da estrutura macromolecular e composição deste sistema de secreção da toxina ter sido dificultada pela falta de protocolos de imagem de alta resolução. Nossos relatórios publicados anteriormente estudando o CAG-T4SS relataram uma média de quatro pili Cag-T4SS por célula bacteriana por microscopia eletrônica de alta resolução 24 análises. O nosso método melhorado forneceuma técnica de imagiologia robusta para visualizar o Cag-T4SS usando uma técnica de cultura que promove a produção desta característica na superfície da célula bacteriana. Utilização de técnicas de cultura em conjunto com alta resolução de emissão de campo arma microscópio eletrônico de varredura é fundamental para este protocolo de imagem. Duas vezes o enriquecimento da característica da superfície Cag-T4SS é um aumento significativo para investigadores interessados em realizar análises de imuno-histoquímica, tais como técnicas de imunofluorescência ou de imunoprecipitação para caracterizar ainda mais a localização subcelular ou composição do Cag-T4SS. Uma vez que a alta-resolução de imagem de microscopia electrónica do Cag-T4SS tenha sido dominada, também é possível desenvolver outras aplicações, tais como imuno-marcação, para determinar a localização de proteínas bacterianas no que diz respeito ao pilus Cag T4SS-25.
Uma limitação da nossa técnica é o facto de que o investigador ainda está restrita a using de um sistema de co-cultura para a visualização da Cag-T4SS. Em um único campo, apenas um subconjunto de H. pylori em condições normais de cultura formam essas estruturas (cerca de 50-70 por cento, veja a Figura 3 painel B). Assim, numerosas células em um campo será não-piliated. Não se sabe porque estas subpopulações existir no mesmo local, mas estas células são sempre contabilizadas dentro ambas as quantificações de pili / célula e a percentagem de células com pili na superfície. Porque o Cag-T4SS é observado apenas na interface bacteriana-hospedeiro, os passos de fixação primárias e secundárias no interior da preparação da amostra SEM são críticos para a preservação de ambas as estruturas proteicas e as membranas das células eucarióticas e procarióticas. No entanto, o excesso de fixação pode ocorrer se os passos de fixação são transportados para fora mais do que o descrito, ou se as soluções não são preparados. Se ocorre o excesso de fixação, as amostras terá uma aparência de pedra quando visto sob o SEM e Cag-T4SS irá ser mascarado por este. Para Troubleshoot, repetir a preparação de amostras de SEM utilizando fixadores menos concentrados e / ou em menos tempo incubadas na presença do fixador.
O sistema de co-cultura também torna caracterização bioquímica (tais como análises de espectrometria de massa) incómodo devido à contaminação de grandes quantidades de proteínas do hospedeiro. No entanto, a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam a produção deste sistema de secreção bacteriana poderia levar a novas técnicas que irão desencadear a formação de pilus Cag-T4SS na ausência de células hospedeiras. Isso iria melhorar muito as técnicas de isolamento e purificação para ensaios bioquímicos.
Em conclusão, nós relatamos que as condições de ferro restrita disponibilidade resultado em aumento da produção de H. pylori Cag-T4SS que podem ser visualizadas através de alta resolução técnicas de microscopia eletrônica de varredura. Nós também denunciar a repressão dependente de ferro deste recurso superfície na interfa patógeno-hospedeiroce. Este ensaio pode ser optimizado e utilizados para inúmeras bactérias patogénicas que formam toxinas secreções-reguladas pelo ferro e é amplamente aplicável a uma variedade de interacções hospedeiro-microbianas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified brucella broth | |||
| Peptone from casein (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptic digest of animal tissue (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Yeast extract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Sodium chloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 or 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Modified RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Fetal bovine serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Electron Microscopy Preparation | |||
| Paraformaldehyde (2.0% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2.5% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Sodium cacodylate (0.05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0.1% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absolute) | Sigma | E7023 | |
| Colloidal silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM sample stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 Secretion Evaluation | |||
| Quantikine IL-8 ELISA kit | R&D Systems | D8000C |
References
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