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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

の高分解能電子顕微鏡 Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52122
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1, 1, 1,2
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Protocol

1. H.ヒトの胃上皮細胞と鉄可用性と共培養の様々な条件でピロリ菌の成長

  1. H.を選択これらの研究のためのピロリ菌株のPMSS1それが無傷のCAG病原性島を有しており、機能しているIV型分泌系を表現しているため。また、ネガティブコントロールとして同質遺伝子ケージ変異体（PMSSIΔCAGE）を利用する。 5％CO 2存在下、37℃で24時間、5％ヒツジ血液（血液寒天プレート）を補充したTSAプレート上で細菌を成長させる。
    注：試薬を準備し、材料および装置の表で概説したような材料を組み立てる。各試薬の最終的な濃度は、括弧内に記載されています。
  2. 滅菌綿棒を用いてプレートからの細菌をこすりや部品から製造された改質ブルセラブロス中に接種し（材料および機器の表を参照）およびコレステロールを補った。 37で一晩培養液をインキュベート毎分（rpm）200回転で振とうしながら、5％CO 2を補充した室内空気中のC°。
    NOTE：コレステロール起因血清が複雑であるという事実のために、ウシ胎児血清の代わりに使用されている。結果のばらつきの原因となるようなヘムなどの栄養素の鉄の多数の供給源を含む。
  3. 細菌培養の日に、12ウェルプレート（ウェル当たり約1×10 5細胞）でポリ-D-リシン処理したカバースリップ上にAGSヒト胃上皮細胞（ATCC CRL-1739）をシードする。
  4. 次の日、100μMのFeCl 3を 、200μMのジピリジルの（合成鉄キレート剤）、または200μMのジピリジルプラス250μMのFeCl 3を補充しただけでは修正されたブルセラブロス中0.3のOD600以降に細菌培養を希釈。 200rpmで振盪しながら、5％CO 2を補充した室内空気中、37℃で4時間、これらの培養物をインキュベートする。
  5. 千×gで遠心した細菌は、細胞を収集し、私を再懸濁する前に、上清を削除するにはnは新鮮修正ブルセラブロス等量のは、コレステロールを補った。文化の尺度OD600（×10 OD600 = 1.0 = 5.5 8細胞/ ml）及び20の感染多重度（MOI）の上皮細胞への細菌を追加：1。細菌細胞の生存率を評価するために、血液寒天プレート上に連続希釈し、プレート細菌細胞を実行する。
  6. Hをインキュベート走査電子顕微鏡（SEM）試料調製を行う前に、静的条件下で、5％CO 2の存在下、37℃で4時間ピロリおよびAGSヒト胃上皮細胞の共培養。

2. SEM Hを可視化するためにサンプル調製ピロリ CAG-T4SS線毛

  1. Hを削除するピロリ菌とインキュベーターとデカント培養上清からのAGS共培養（IL-8 ELISAのために保存）。 0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で穏やかに3回洗浄する。 2.0％パラホルムアルデヒド溶液中で、室温で2.5〜4時間のサンプルを修正％グルタルアルデヒド、および0.05Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液。一次固定した後、試料を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄する。
  2. つの連続10分間の固定ステップで0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の0.1％四酸化オスミウムを用いた二次固定を行う。二次固定した後、試料を0.05 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄する。
  3. 一次および二次固定した後、 表1の通りのエタノール濃度を増加させて、順次洗浄することにより試料を脱水する。
  4. エタノール脱水後、液体二酸化炭素の3つの連続回の洗浄を行う。 1073 PSIの31.1ºCの温度及び圧力で臨界点乾燥機を用いて、臨界点でのドライサンプル。
  5. マウントは、アルミニウムのSEM試料スタブ上にカバースリップとの適切な接地を実現し、SEM画像中に充電を回避するために、サンプルエッジでコロイド銀の細い線を描く。
  6. コー​​トサンプルを5nmと試料の二次電子信号とエッジ効果を高めるためにスパッタコート機を用いて金 - パラジウム。

高解像度のSEM分析3.イメージングパラメータ

  1. 電界放射銃走査電子顕微鏡（FEG-SEM）を持つビュー·サンプル。
  2. 5〜10ミリメートルの作動距離で高真空モードでの画像。
  3. 5 kVの加速電圧に設定してください。
  4. 2-2.5にスポットサイズを設定します。
  5. 宿主 - 病原体インターフェースのより良いビューを達成するために、15〜25度の間の試料を傾けて。
  6. 宿主 - 病原体相互作用のこれらの領域は線毛形成細菌のために濃縮されているように、高倍率の視聴のための上皮細胞のエッジに付着細菌を画像化する優先順位をつける。

Piliの数量化を評価するために4.統計分析

  1. H.を分析線毛/セルならびにpiliated脱pheを示す細胞のパーセント数を定量化するためにImageJソフトウェアを使用してピロリ CAG-T4SS線毛下記の指示に従ってNOTYPE。
  2. ImageJソフトウェアで開く顕微鏡写真ファイル。均一な幅（10-13 nm）を、長さ（60〜150 nm）を用いて、細菌細胞と宿主細胞との間に形成された構造として線毛を識別する。
    注：線毛構造が主要なATPアーゼ大国IV型分泌線毛アセンブリをコードする遺伝子における不活性化を抱くようなΔ ケージ変異株として同質遺伝子株は、上のWTの細菌株上に存在するが、存在しない。
  3. 直線ツールで線を引くと、次に「分析」タブをクリックすることにより、測定ツールを校正。ドロップダウンメニューから「セットスケール」を選択し、「既知の距離」というラベルの付いたボックスに倍率バーの値を入力し、適切な設定（ナノメートル）の長さの単位を設定します。 「OK」をクリックします。
  4. 線毛の長さや幅を上に描画するために直線ツールを使用して、CAG-T4SS線毛を測定し、各線毛を測定するためには、 "Ctrl-M」を押してください。測定された値を持つダイアログボックスを守ってください。これらの値を記録したりコピーし、表計算プログラムに貼り付けます。
  5. 長さを使用し、幅のパラメータは、以前にCAG-T4SSのプロファイルに適合しない24、無視機能を設立しました。その後、10〜13 nmの幅と60〜150 nmの長さのカットオフ内にある値に基づいて線毛の数を定量化する。
  6. を、GraphPad Prismソフトウェアを使用して両側スチューデントt検定によって統計的に線毛の定量分析を行う。

5.オプション：IL-8分泌の評価は、線毛の生産と相関する

  1. ステップ2.1から上清を用い、キットを製造業者の指示（材料および装置の表を参照）ごとに、IL-8のELISAを行う。
  2. IL-8は、宿主細胞によって分泌を分析し、培地単独中で成長WT PMSS1に対するパーセントのIL-8誘導を計算する。これを、GraphPad Prismを使用して、両側スチューデントt検定を用いて統計分析を実行するftware。

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Representative Results

本稿では、鉄利用能を変化させる条件はH.を調節する能力を有することが実証されているホスト病原体の界面でのピロリ菌 CAG-T4SS線毛生合成。 、H。単独の培地で培養した場合ピロリ菌は 3線毛/セルの平均を形成している。ときにH.ピロリ菌は、鉄で栽培されて枯渇細菌の増殖（ 図1）サブ阻害性である（合成キレート剤ジピリジルを使用）の条件は、細菌が作り出す数々のCAG-T4SS線毛（〜7線毛/セル）とき、人間の胃の細胞と共培養（ 図2）。栄養鉄の外因性源が存在する場合には逆に、CAG-T4SS線毛の形成が抑制される（FE試料中の1未満線毛/細胞、1未満線毛/ FE +ディップサンプル中の細胞）（ 図2）。宿主-病原体界面での線毛の定量化は、鉄制限、Hの状態であることを明らかにしピロリ菌は、CAG-T4SS線毛た（p <0.000の2倍の増加を示す 1）培地のみで増殖した細胞と比較して11％（p <0.05）にパーセントpiliated細胞が増加した（ 図3）。興味深いことに、CAG-T4SSの活性は、ホストIL-8分泌によって測定されるように、鉄制限条件下で107パーセントを強化し、培地のみ（p = 0.03、およびpと比較して過剰鉄利用能の条件下で49％抑制される< SEMデータをサポート0.001、それぞれ）の結果。しかし、線毛の寸法は鉄の可用性（ 図4）のすべての条件のうち一貫性を維持。また、鉄利用能がケージ変異体の表面上に線毛の生合成を変化させず、それは実際には、実証された構造であるという仮説を支持し、宿主細胞からのIL-8応答を誘導するこの同質遺伝子誘導体の能力を変更しない、 CAG-T4SSとされていない追加の無関係な表面特徴。

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図1：鉄の可用性の様々な条件で決定された細菌の生存能力H.。ピロリ菌だけでは修正されたブルセラブロス（培地のみ）で培養した、または、100μMのFeCl 3（FE）、200100μMのジピリジル（DIP）、または200100μMのジピリジルプラス、250μMのFeCl 3（FE +ディップ）を補充した。細菌は、5％CO 2の存在下、37℃で2日間インキュベーション前に連続希釈し、細菌学的培地上にプレーティングした。コロニーを計数し、コロニー形成単位/ mLの（CFU / ml）を算出した。バーは、3回の独立した実験の平均値+/- SEMを示す。 DIP、FE、またはFE +ディップを用いた治療は大幅に細菌の生存能力は変更されません。

図2
図2：高RH.のesolution走査型電子顕微鏡分析ピロリ CAG-T4SS線毛。細菌は200μMのジピリジル、またはDを補った、100μMのFeCl 3、C）培地を補っA）培地のみ、B）培地中で増殖させた）、200μMのジピリジルプラス250μMのFeCl 3を添加した培地AGS人間との共培養の前に胃の細胞。矢印は、宿主 - 病原体の界面に形成されたCAG-T4SS線毛を示している。サンプルは、CAG-T4SS生合成を評価するために、高分解能走査型電子顕微鏡により分析した。過剰利用可能な栄養鉄の条件は、CAG-T4SS線毛の形成を抑制しつつ、低鉄利用の条件は、CAG-T4SS線毛形成の有病率を増加させる。

図3
図3：様々な中で培養線毛/セルおよびパーセントpiliated細胞の定量化鉄利用の条件。細菌は、単独（培地のみ）修正されたブルセラブロス中で増殖させた、または媒体は、100μMのFeCl 3（FE）、200100μMのジピリジル（DIP）、または200100μMのジピリジルプラス、250μMのFeCl 3（FE +ディップ）コ·前に補充した人間の胃上皮細胞と培養する。サンプルは、ImageJソフトウェアを使用して列挙された高分解能走査電子顕微鏡および線毛によって分析した。 A）は、培地単独と比較して細胞あたりの線毛の散布た（* p <0.0001）、および独立した3から派生培養条件あたり60-112細胞由来の培地のみに比べpiliated細胞（* P <0.05）のB）のバーグラフ描いパーセント生物学的な実験。

図4
図4：鉄の可用性の様々な条件で培養した細胞から測定線毛寸法。 BACTERIAコ·前に修正されたブルセラ単独のブロス（培地のみ）、または中、100μMのFeCl 3（FE）を補充し、200100μMのジピリジル（DIP）、または200100μMのジピリジルプラス、250μMのFeCl 3（FE +ディップ）で増殖させた人間の胃上皮細胞と培養する。試料は、高分解能走査型電子顕微鏡で分析し、線毛寸法はImageJソフトウェアを用いて測定した。 A）線毛幅は、すべての条件のうち13.1 +/- 2.4程度の平均値である。 B）線毛の長さは、すべての条件のうち75.8 +/- 16.0ナノメートルの平均である。線毛寸法の有意差は鉄利用の様々な条件で見られない。

補足図1：高分解能走査型電子顕微鏡での分析H.鉄の可用性の様々な条件でのピロリ菌ケージ変異体。細菌はFeCl 3を 、100μMで補充A）培地で増殖させた、B）培地D、200μMのジピリジル（補充したIP）またはC）、200μMのジピリジル（DIP）を添加した培地を加え、250μMのFeCl 3 AGSヒト胃細胞と共培養する前に。サンプルは、CAG-T4SS生合成を評価するために、高分解能走査型電子顕微鏡により分析した。低または高鉄の条件は図2に可視化された構造は、CAG-T4SS線毛であるという仮説を支持し、あらゆるCAG-独立の線毛生合成を調節しない。

補足図2：鉄の可用性の条件を変化させることで成長させた細菌に応答したホストのIL-8分泌のELISA分析。野生型（白棒）またはケージ変異体（灰色のバー）細菌は、100μMのFeCl 3（FE）、200100μMのジピリジル（DIP）、または200μMのジピリジルを補った修正されたブルセラ単独のブロス（培地のみ）、または培地中で増殖させたプラス250 uMのFeCl 3を （FE +ディップ）は、ヒトの胃上皮細胞との共培養の前に。増加したILの鉄制限の結果-8、CAG-T4SS活動に依存しているホストの応答。バーは、3つの別個の生物学的な実験から得られ、平均+/- SEMを示す。 （* P <0.05、培地のみで増殖したPMSS1と比較して）。

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Discussion

鉄は、細菌性病原体を含む人生のほとんどの形態、必須の微量栄養素​​である。侵入微生物の生存を制限するための努力では、脊椎動物のホストは「栄養免疫」18として知られるプロセスで栄養鉄を隔離する。これに応答して、細菌性病原体は、その周囲を感知し、そのような鉄獲得システム、毒素および毒素分泌機構19,20などの病原性機能の精緻化を調節するためにグローバルなシグナル伝達分子として鉄を使用するように進化してきた。

ピロリ菌は、鉄、亜鉛、および22を成長させるようなヘム、ヘモグロビン、トランスフェリン、ラクトフェリン23として代替鉄源を使用することができるマグネシウムなどの微量栄養素を必要とする。H.ピロリ菌は 、最も成功した病原体のように、それは、ホスト21からの栄養素の鉄を除去を助けるために病原性因子の幅広いレパートリーを進化してきました。一つの毒性因子、CagAは、エフェクターmolecuルCAG-T4SSのは、それが容易に栄養鉄源として細菌細胞によって使用され、複製15を促進することができる頂端表面に偏光された細胞の基底外側からトランスフェリンを再ルーティングに関与している。これにより、低鉄利用の条件のCagAタンパク質の分泌を促進するための直感的な進化戦略と思われる。

H.ピロリ CAG-T4SSは誘発炎症促進性宿主細胞応答のために重要な細菌の細胞小器官である。 CAG-T4SSの効果が十分に共培養し、感染の動物モデルの両方において研究されている。しかし、この毒素分泌系の高分子構造および組成の研究は、高解像度イメージングプロトコルの欠如によって妨げられてきた。 CAG-T4SSを研究我々の以前に公表された報告は、高分解能電子顕微鏡による細菌細胞あたり4 CAG-T4SS線毛の平均が24を分析して報告している。私たちの改善された方法を提供堅牢なイメージング技術は、細菌細胞の表面上のこの特徴の産生を促進する培養技術を用いてCAG-T4SSを可視化した。高分解能電界放出銃の走査型電子顕微鏡と組み合わせて培養技術の利用は、この撮影プロトコルのために重要である。 CAG-T4SS表面特徴の二倍の濃縮は、免疫組織化学を行うことに興味の研究者のための有意な増加はさらにCAG-T4SSの細胞内位置または組成物を特徴づけるためにそのような免疫蛍光法または免疫沈降技術として分析される。 CAG-T4SSの高分解能電子顕微鏡像が習得された後は、CAG-T4SS線毛25に対する細菌タンパク質の位置を決定するために、そのような免疫金標識のような他のアプリケーションを開発することが可能である。

我々の技術の一つの制限は、研究者がまだUSIに制限されているという事実であるCAG-T4SSの可視化のために共培養系ngの。 Hの単一のフィールドでは、サブセットのみ通常の培養条件下でのピロリ菌は、これらの構造（約50〜70％が、図3のパネルBを参照）を形成する。だから、フィールド内の多数の細胞は、非piliatedになります。これらの亜集団は、同じ場所に存在理由は不明であるが、これらの細胞は常に表面上の線毛を持つ細胞の線毛/セルとパーセントの両方の定量内会計処理されている。 CAG-T4SSのみホスト細菌の界面で観察されるので、SEMの試料調製物内の一次及び二次固定の手順は、タンパク質の構造及び真核生物および原核生物細胞の膜の両方の保存のために重要である。しかし、固定ステップが概説さよりも長く行われている場合、または溶液を新たに調製していない場合、過固定起こり得る。過剰な固定が発生した場合は、SEM下で観察し、CAG-T4SSこのによってマスクされたときに、サンプルが石の外観を持つことになります。 troublへeshoot、固定剤の存在下でインキュベートした低濃度の固定剤および/またはより短い時間を使用して、SEMの試料調製を繰り返す。

共培養系はまた、宿主タンパク質の大量の汚染に面倒な（例えば、質量分析法分析など）の生化学的特徴をレンダリングする。しかし、この細菌の分泌系の産生を調節する分子メカニズムを理解することは、最終的には、宿主細胞の非存在下でCAG-T4SS線毛の形成をトリガーする新しい技術につながる可能性があります。これは大幅な生化学的アッセイのための単離および精製技術を改善するであろう。

結論として、我々はHの増産で制限された鉄の可用性結果の状況を報告高分解能走査電子顕微鏡法によって可視化することができるピロリ CAG-T4SS。我々はまた、宿主 - 病原体interfa時にこの表面特徴の鉄依存抑制を報告CE。このアッセイは、最適化され、鉄調節毒素分泌物を形成し、宿主 - 微生物相互作用の様々に広く適用可能である多数の細菌性病原体のために利用することができる。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L) Sigma 70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L) Sigma 70174
Yeast extract (2 g/L) Sigma 92144
Dextrose (1 g/L) Sigma D9434
Sodium chloride (5 g/L) Thermo Fisher S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L) Life Technologies 12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM) Sigma 157740-100G
Dipyridyl (200 uM) Sigma D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X) Life Technologies 22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L) Life Technologies 10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous) Electron Microscopy Sciences 15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous) Electron Microscopy Sciences 16220
Sodium cacodylate (0.05 M) Electron Microscopy Sciences 12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous) Electron Microscopy Sciences 19150
Ethanol (absolute) Sigma E7023
Colloidal silver paint Electron Microscopy Sciences 12630
SEM sample stubs Electron Microscopy Sciences 75220
Coverslips Thermo Fisher 08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit R&D Systems D8000C

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References

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の高分解能電子顕微鏡<em&gt;ヘリコバクター·ピロリ</em鉄の可用性の変化する条件で生産&gt; CAG IV型分泌系線毛
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Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy, J. A. High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability. J. Vis. Exp. (93), e52122, doi:10.3791/52122 (2014).… More

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy, J. A. High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability. J. Vis. Exp. (93), e52122, doi:10.3791/52122 (2014).

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