Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عالية الدقة المجهر الإلكتروني ل Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52122
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Protocol

1. ه. بيلوري النمو في مختلف الظروف من الحديد الشواغر والمشارك الثقافة مع خلايا الإنسان الظهارية المعدة

  1. حدد H. بيلوري سلالة PMSS1 لهذه الدراسات لأنه يحتوي على حالها جزيرة المساعدة النقدية المرضية ويعبر عن نوع عمل نظام إفراز الرابع. الاستفادة أيضا قفص متحولة إسوي (PMSSI Δ قفص) كوسيلة لمراقبة سلبية. تنمو البكتيريا على لوحات TSA تستكمل مع 5٪ الأغنام الدم (لوحات أجار الدم) لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2.
    ملاحظة: إعداد الكواشف وتجميع المواد على النحو المبين في الجدول المواد والمعدات. يتم سرد تركيزات النهائية لكل كاشف بين قوسين.
  2. تتخلص من البكتيريا لوحة باستخدام القطن ذات الرؤوس قضيب معقمة وتلقيح في تعديل مرق البروسيلا المحضرة من المكونات (انظر الجدول المواد والمعدات) وتستكمل مع الكولسترول. احتضان الثقافات بين عشية وضحاها في 37° C في هواء الغرفة تستكمل مع 5٪ CO 2 مع اهتزاز عند 200 التناوب في الدقيقة الواحدة (دورة في الدقيقة).
    يستخدم الكولسترول في مكان مصل بقري جنيني يرجع ذلك إلى حقيقة أن المصل معقد، ملاحظة: تحتوي على مصادر عديدة من المواد الغذائية مثل الحديد الهيم الذي يسبب تقلبات في النتائج.
  3. في يوم من زراعة البكتيرية، البذور AGS الخلايا الظهارية في المعدة البشرية (آي تي سي سي CRL-1739) على بولي D يسين coverslips المعالجة في لوحات 12-جيدا (حوالي 1 × 10 5 خلايا لكل بئر).
  4. في اليوم التالي، وتمييع الثقافات البكتيرية إلى OD600 من 0.3 في تعديل مرق البروسيلا وحدها أو تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3، 200 ميكرومتر dipyridyl (أ خالب الحديد الاصطناعية)، أو 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3. احتضان هذه الثقافات لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية في هواء الغرفة تستكمل مع 5٪ CO 2 مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
  5. البكتيريا الطرد المركزي في 1000 x ج لجمع الخلايا وإزالة supernatants قبل إعادة التعليق طن حجم مساو من جديد مرق البروسيلا تعديل تستكمل مع الكولسترول. قياس OD600 الثقافة (OD600 = 1.0 = 5.5 × 10 8 خلية / مل) وإضافة البكتيريا إلى الخلايا الظهارية في عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) من 20: 1. إجراء التخفيفات التسلسلية والخلايا البكتيرية على لوحة لوحات أجار الدم لتقييم بقاء الخلية البكتيرية.
  6. احتضان ه. بيلوري وAGS الخلايا الظهارية في المعدة البشرية شارك الثقافات لمدة 4 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2 في ظروف ثابتة قبل تنفيذ المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) إعداد العينة.

2. SEM إعداد نموذج لتصور H. بيلوري CAG-T4SS بيلي

  1. إزالة H. بيلوري وAGS شارك الثقافات من طاف صب الحاضنة والثقافة (انقاذ لIL-8 ELISA). غسل بلطف ثلاث مرات مع الصوديوم 0.05 M عازلة كاكوديلات (الرقم الهيدروجيني 7.4). إصلاح عينات لمدة 2-4 ساعات في درجة حرارة الغرفة في حل من 2.0٪ امتصاص العرق، 2.5gluteraldehyde٪، و 0.05 M الصوديوم عازلة كاكوديلات. بعد التثبيت الأولي، وغسل العينات ثلاث مرات مع الصوديوم 0.05 M عازلة كاكوديلات.
  2. إجراء تثبيت الثانوي باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم 0.1٪ بما يعادل 0.05 M الصوديوم عازلة كاكوديلات في اثنين خطوات متتابعة 10 دقيقة التثبيت. بعد تثبيت الثانوي، وغسل العينات ثلاث مرات مع الصوديوم 0.05 M عازلة كاكوديلات.
  3. بعد تثبيت الابتدائي والثانوي، يذوى العينات عن طريق الغسيل متسلسل مع زيادة تركيزات الإيثانول كما في الجدول 1.
  4. بعد الإيثانول الجفاف، نفذ ثلاثة يغسل متتابعة من ثاني أكسيد الكربون السائل. عينات الجافة ثم عند نقطة حرجة باستخدام آلة مجفف النقطة الحرجة عند درجة حرارة 31.1 درجة مئوية وضغط 1073 PSI.
  5. جبل coverslips على الألومنيوم SEM عينة بذرة والطلاء مع خط رفيع من الفضة الغروية على حافة عينة لتحقيق التأريض المناسب وتجنب فرض SEM أثناء التصوير.
  6. عينات معطف مع 5 نانومتر للالذهب والبلاديوم باستخدام آلة معطف تفل لزيادة عينة إشارة الإلكترون الثانوية وتأثير الحافة.

3. معلمات التصوير للتحليلات عالية الدقة SEM

  1. عرض العينات مع حقل الانبعاث الضوئي بندقية الإلكترون مجهر (FEG-SEM).
  2. صورة في وضع فراغ عالية على مسافة العمل من 5-10 ملم.
  3. تعيين الجهد المتسارع إلى 5 كيلو فولت.
  4. تحديد حجم البقعة إلى 2-2.5.
  5. إمالة العينة بين 15-25 درجة لتحقيق رؤية أفضل واجهة المضيف الممرض.
  6. أولويات التصوير البكتيريا الملتصقة إلى حواف الخلايا الظهارية للعرض عالية التكبير، كما يتم إثراء هذه المناطق من التفاعل المضيف الممرض للبكتيريا المكونة للالشعرة.

4. التحليلات الإحصائية في تقييم بيلي Quantifications

  1. تحليل H. بيلوري CAG-T4SS الشعرة باستخدام برنامج يماغيج لقياس عدد من الشعرة / خلية، وكذلك في المئة من خلايا اظهار مشعر PHEnotype في التعليمات أدناه.
  2. ملفات مفتوحة مجهرية في برنامج يماغيج. تحديد بيلي عن الهياكل التي تشكلت بين الخلية البكتيرية والخلية المضيفة، مع عرض موحد (10-13 نانومتر) وطول (60-150 نانومتر).
    ملاحظة: هيكل شعرة موجود على السلالات البكتيرية WT، ولكن غاب عن سلالات إسوي مثل Δ قفص سلالات متحولة، التي ترعى وتعطيل في جين ترميز أتباز كبير أن القوى نوع إفراز الرابع شعرة التجمع.
  3. معايرة أدوات القياس عن طريق رسم خط باستخدام أداة خط مستقيم ثم النقر على علامة التبويب "تحليل". تحديد "جدول تعيين" من القائمة المنسدلة وأدخل القيمة شريط التكبير في المربع المسمى "المسافة المعروفة" وتعيين وحدة طول إلى الإعداد المناسب (نانومتر). انقر على "موافق".
  4. قياس CAG-T4SS الشعرة باستخدام أداة رسم خط مستقيم على طول أو عرض شعرة ثم اضغط على "السيطرة-M" لقياس كل شعرة. مراقبة مربع الحوار مع القيم المقاسة. تسجل هذه القيم أو نسخ ولصق في برنامج جداول البيانات.
  5. استخدام الطول والعرض ضعت من قبل المعلمات 24، ملامح التجاهل التي لا تناسب مكانة CAG-T4SS. ثم تحديد عدد بيلي على أساس القيم التي هي ضمن انقطاع 10-13 نانومتر 60-150 نانومتر العرض والطول.
  6. تحليل الكمي لبيلي إحصائيا كتبها t الطالب اختبار ثنائي الطرف باستخدام برنامج GraphPad بريزم.

5. اختياري: تقييم IL-8 إفراز لربط مع شعرة الإنتاج

  1. باستخدام supernatants من الخطوة 2.1، إجراء IL-8 ELISA في تعليمات الشركة الصانعة مع عدة (انظر الجدول المواد والمعدات).
  2. تحليل IL-8 تفرزها الخلايا المضيفة وحساب المئة IL-8 الاستقراء فيما يتعلق WT PMSS1 نمت في المتوسط ​​وحده. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ثنائي الطرف اختبار ر الطالب باستخدام GraphPad بريزم ذلكftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في هذا التقرير، لقد أثبتنا أن ظروف متفاوتة توافر الحديد لديها القدرة على تعديل H. بيلوري CAG-T4SS شعرة نشوء حيوي في واجهة الممرض المضيف. عندما مثقف في المتوسط ​​وحده، H. بيلوري تشكل ما معدله 3 بيلي / الخلية. عندما H. ويزرع في بيلوري الحديد تستنزف الظروف (باستخدام خالب dipyridyl الاصطناعية) التي هي شبه المثبطة لنمو البكتيريا (الشكل 1)، وتنتج البكتيريا العديد من CAG-T4SS بيلي (بيلي ~ 7 / خلية) عندما شارك في تربيتها مع خلايا المعدة الإنسان (الشكل 2). على العكس، عندما يكون مصدر خارجي من الحديد المغذيات هو الحاضر، وقمع تشكيل CAG-T4SS بيلي (أقل من 1 شعرة / خلية في العينة FE، أقل من 1 شعرة / خلية في العينة DIP FE +) (الشكل 2). الكمي لبيلي في واجهة المضيف الممرض يكشف أنه في ظروف تقييد الحديد، H. بيلوري يسلك بزيادة 2 أضعاف في CAG-T4SS بيلي (P <0.000 1) وزيادة الخلايا في المئة مشعر بنسبة 11٪ (P <0.05) مقارنة مع الخلايا المزروعة في المتوسط ​​وحدها (الشكل 3). ومن المثير للاهتمام، ومما يعزز من نشاط CAG-T4SS، مقاسا المضيف IL-8 إفراز، و 107٪ في ظل ظروف تقييد وقمع الحديد 49٪ في ظل ظروف من توافر الحديد الزائد بالمقارنة مع المتوسط ​​وحده (ع = 0.03 و p < 0.001، نتيجة التوالي) والتي تدعم البيانات SEM. ومع ذلك، لا تزال هناك أبعاد بيلي متناسقة بين جميع شروط توافر الحديد (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، توفر الحديد لا يغير نشوء حيوي من الشعرة على سطح المسخ القفص، كما أنه لا يغير قدرة هذا مشتق إسوي للحث على IL-8 استجابة من الخلايا المضيفة، ودعم فرضية أن الهياكل أثبتت هي، في الواقع، CAG-T4SS وليس ميزة إضافية السطح غير ذات صلة.

ن "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 52122 / 52122fig1highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 1: تحدد صلاحية البكتيرية في ظروف مختلفة من توافر الحديد H. وكان بيلوري مثقف في تعديل مرق البروسيلا وحده (وحده المتوسطة)، أو تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3 (FE)، 200 ميكرومتر dipyridyl (DIP)، أو 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3 (FE + DIP). وقد تضعف البكتيريا متسلسل ومطلي على المتوسط ​​البكتريولوجي قبل الحضانة لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2. احصي المستعمرات ومستعمرة / مل (كفو / مل) تم حساب. الحانات تشير يعني من ثلاث تجارب مستقلة +/- SEM. العلاج مع مجمع دبي للاستثمار، FE، أو FE + DIP لا يغير كثيرا جدوى البكتيرية.

الرقم 2
الشكل 2: عالية Rيحلل المجهر الإلكتروني الماسح esolution من H. بيلوري CAG-T4SS بيلي. كانت تزرع البكتيريا في أ) متوسطة وحدها، B) متوسطة تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3، C) متوسطة تستكمل مع 200 ميكرومتر dipyridyl، أو D) متوسطة تستكمل مع 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3 قبل أن تشارك في الثقافة البشرية مع AGS خلايا المعدة. السهام تشير CAG-T4SS بيلي شكلت في واجهة المضيف الممرض. وقد تم تحليل عينات من قبل عالية الدقة المجهر الإلكتروني لتقييم المساعدة النقدية، T4SS نشوء حيوي. شروط توافر انخفاض الحديد تزيد من انتشار تشكيل شعرة CAG-T4SS، في حين شروط فائضة الحديد المغذيات تقمع تشكيل شعرة CAG-T4SS.

الرقم 3
الرقم 3: الكمي لبيلي / الخلية والخلايا المستزرعة في المئة مشعر في مختلفشروط توافر الحديد. كانت تزرع البكتيريا المعدلة في مرق البروسيلا وحده (وحده المتوسطة)، أو متوسطة تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3 (FE)، 200 ميكرومتر dipyridyl (DIP)، أو 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3 (FE + DIP) قبل المشارك الثقافة مع الخلايا الظهارية في المعدة البشرية. وقد تم تحليل عينات من قبل تم المذكورة عالية الدقة المجهر الإلكتروني وبيلي باستخدام برنامج يماغيج. أ) مخطط التشتت من بيلي في كل خلية (* P <0.0001 بالمقارنة مع المتوسط ​​وحده) و B) بار الرسم البياني تصور في المئة من خلايا مشعر (* P <0.05 مقارنة مع المتوسط ​​وحده) المستمدة 60-112 خلايا لكل حالة الثقافة المستمدة من 3 منفصلة تجارب بيولوجية.

الرقم 4
الشكل 4: أبعاد شعرة تقاس من الخلايا المستزرعة في مختلف الظروف من توافر الحديد. جرثومةeria كانت تزرع في تعديل مرق البروسيلا وحده (وحده المتوسطة)، أو متوسطة تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3 (FE)، 200 ميكرومتر dipyridyl (DIP)، أو 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3 (FE + DIP) قبل المشارك الثقافة مع الخلايا الظهارية في المعدة البشرية. وقد تم تحليل عينات من قبل عالية الدقة المجهر الإلكتروني وتم قياس أبعاد بيلي باستخدام برنامج يماغيج. أ) عرض شعرة في المتوسط ​​13.1 +/- 2.4 نانومتر بين جميع الظروف. ب) طول شعرة في المتوسط ​​75.8 +/- 16.0 نانومتر بين جميع الظروف. وينظر لا يوجد فرق كبير في أبعاد شعرة في مختلف الظروف من توافر الحديد.

التكميلي الشكل 1: يحلل عالية الدقة المجهر الإلكتروني من H. بيلوري قفص متحولة في مختلف الظروف من توافر الحديد. كانت تزرع البكتيريا في أ) متوسطة تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3، B) متوسطة تستكمل مع 200 ميكرومتر dipyridyl (DIP) أو C) متوسطة تستكمل مع 200 ميكرومتر dipyridyl (DIP)، بالإضافة إلى 250 ميكرومتر FeCl 3 مسبقة للمشاركة في الثقافة مع خلايا المعدة البشرية AGS. وقد تم تحليل عينات من قبل عالية الدقة المجهر الإلكتروني لتقييم المساعدة النقدية، T4SS نشوء حيوي. شروط الحديد منخفضة أو عالية لا تعدل أي شعرة CAG نشوء حيوي مستقل، ودعم فرضية أن الهياكل تصور في الشكل 2 هي CAG-T4SS بيلي.

التكميلي الشكل 2: تحليل ELISA من المضيف IL-8 إفراز ردا على البكتيريا التي تنمو في ظروف توافر الحديد متفاوتة. وقد نمت البرية من نوع (أشرطة بيضاء) أو متحولة قفص (القضبان الرمادية) في البكتيريا المعدلة ومرق البروسيلا وحده (وحده المتوسطة)، أو متوسطة تستكمل مع 100 ميكرومتر FeCl 3 (FE)، 200 ميكرومتر dipyridyl (DIP)، أو 200 ميكرومتر dipyridyl بالإضافة إلى 250 أوقية FeCl 3 (FE + DIP) مسبقة للمشاركة في الثقافة مع الخلايا الظهارية في المعدة البشرية. النتائج تقييد الحديد في زيادة IL-8، استجابة المضيف الذي يعتمد على النشاط CAG-T4SS. الحانات وتشير يعني +/- SEM، والمستمدة من 3 تجارب بيولوجية مستقلة. (* P <0.05 مقارنة PMSS1 نمت في المتوسط ​​وحده).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الحديد هو المغذيات الدقيقة الأساسية لمعظم أشكال الحياة، بما في ذلك مسببات الأمراض البكتيرية. في محاولة للحد من قابلية غزو الكائنات الحية الدقيقة، ويستضيف الفقاريات بتنحية الحديد المغذيات في عملية تعرف باسم "مناعة الغذائية" (18). ردا على ذلك، تطورت مسببات الأمراض البكتيرية استخدام الحديد كناقل عصبي العالمي لاستشعار البيئة المحيطة بهم وتنظيم وضع ملامح الفوعة مثل نظم جمع الحديد، والسموم، وإفراز السم الآلات 19،20.

بكتيريا يتطلب المغذيات الدقيقة مثل الحديد والزنك والمغنيسيوم لزراعة 22 و يمكن استخدام مصادر بديلة مثل حديد الهيم، الهيموغلوبين، ترانسفيرين، واللاكتوفيرين 23. ه. بيلوري، مثل معظم مسببات الأمراض ناجحة، تطورت ذخيرة واسعة من العوامل الفوعة لمساعدتها على كنس الحديد المغذيات من المضيف 21. عامل الفوعة واحد، CagA، وmolecu المستجيبلو من CAG-T4SS، والمتورطين في تحويل مسار ترانسفيرين من الجانب basolateral من الخلايا الاستقطاب إلى السطح القمي حيث يمكن استخدامه بسهولة من قبل الخلايا البكتيرية كمصدر الحديد والمغذيات تشجيع تكرار 15. وهكذا، يبدو استراتيجية تطورية بديهية لتعزيز إفراز CagA في ظروف من توافر الحديد منخفض.

حاء بيلوري CAG-T4SS هو عضية البكتيرية الهامة، نظرا لردود proinflammatory الخلية المضيفة يتسبب ذلك. آثار CAG-T4SS تم دراستها بشكل جيد في كل من شارك في الثقافات والنماذج الحيوانية للعدوى. ومع ذلك، فقد عرقل دراسات للبنية الجزيئات وتكوين هذا النظام إفراز السم بسبب عدم وجود بروتوكولات التصوير عالية الدقة. وذكرت تقاريرنا المنشورة سابقا دراسة CAG-T4SS بمعدل أربعة CAG-T4SS بيلي لكل خلية البكتيرية التي كتبها عالية الدقة المجهر الإلكتروني تحليلات 24. يوفر لنا تحسين طريقةتقنية التصوير قوية لتصور CAG-T4SS باستخدام تقنية الثقافة التي تشجع على إنتاج هذه الميزة على سطح الخلية البكتيرية. استخدام تقنيات الثقافة بالتزامن مع ارتفاع القرار الميدان الانبعاثات بندقية المجهر الإلكتروني الماسح هو أمر حاسم لهذا البروتوكول التصوير. تخصيب شقين ميزة سطح CAG-T4SS هو زيادة كبيرة للمحققين المهتمة في أداء تحليلات المناعى مثل تقنيات المناعي أو مناعي لمواصلة تميز الموقع التحت خلوية أو تكوين CAG-T4SS. بمجرد يتقن عالية الدقة المجهر الإلكتروني التصوير من CAG-T4SS، فمن الممكن أيضا تطوير تطبيقات أخرى، مثل immunogold وضع العلامات، لتحديد الموقع من البروتينات البكتيرية فيما يتعلق شعرة CAG-T4SS 25.

واحد الحد من أسلوبنا هو حقيقة أن المحقق لا يزال يقتصر على باليودنانوغرام نظام المشترك للثقافة التصور من CAG-T4SS. في حقل واحد، فقط مجموعة فرعية من H. بيلوري تحت ظروف التربية العادية تشكل هذه الهياكل (حوالي 50-70 في المئة، انظر الشكل (3) لوحة ب). لذلك العديد من الخلايا في حقل سيكون غير مشعر. ومن غير المعروف لماذا توجد هذه القطعان في نفس الموقع، ولكن يتم احتساب هذه الخلايا دائما في كل من quantifications من الشعرة / وخلية في المئة من الخلايا التي تحتوي الشعرة على السطح. لأن لاحظت CAG-T4SS فقط في واجهة المضيف البكتيري، والخطوات تثبيت الابتدائية والثانوية ضمن إعداد نموذج SEM حاسمة للحفاظ على كل من الهياكل البروتينية وأغشية الخلايا حقيقية النواة وبدائية النواة. ومع ذلك، يمكن أن يحدث الإفراط في التثبيت إذا نفذت خطوات التثبيت لفترة أطول من المحددة، أو إذا لم يتم إعدادها حلول حديثا. في حال حدوث الإفراط في التثبيت، وسوف يكون لها ظهور عينات صخرية عندما ينظر إليها تحت SEM وسيتم ملثمين على المساعدة النقدية، T4SS هذا. لtroubleshoot، كرر إعداد نموذج SEM باستخدام مثبتات أقل تركيزا و / أو وقت أقل المحتضنة في وجود مثبت.

نظام المشاركة في الثقافة أيضا يجعل توصيف الكيمياء الحيوية (مثل تحليل الطيف الكتلي) مرهقة بسبب تلوث كميات كبيرة من بروتينات المضيف. ومع ذلك، فهم الآليات الجزيئية التي تنظم إنتاج هذا النظام إفراز البكتيريا يمكن أن تؤدي في النهاية إلى تقنيات جديدة من شأنها أن تؤدي إلى تشكيل شعرة CAG-T4SS في غياب الخلايا المضيفة. وهذا من شأنه تحسين كبير في تقنيات عزل وتنقية لفحوصات البيوكيميائية.

في الختام، نفيد شروط مقيدة نتيجة توافر الحديد في زيادة إنتاج H. بيلوري CAG-T4SS التي يمكن تصور بواسطة تقنيات المجهر الإلكتروني عالية الدقة. نحن أيضا تقرير القمع التي تعتمد على الحديد من هذه الميزة السطح في interfa المضيف الممرضم. قد يكون الأمثل هذا الاختبار والاستفادة منها للعديد من مسببات الأمراض البكتيرية التي تشكل الإفرازات السامة التنظيم الحديد وغير قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعة متنوعة من التفاعلات المضيف ميكروب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L) Sigma 70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L) Sigma 70174
Yeast extract (2 g/L) Sigma 92144
Dextrose (1 g/L) Sigma D9434
Sodium chloride (5 g/L) Thermo Fisher S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L) Life Technologies 12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM) Sigma 157740-100G
Dipyridyl (200 uM) Sigma D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X) Life Technologies 22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L) Life Technologies 10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous) Electron Microscopy Sciences 15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous) Electron Microscopy Sciences 16220
Sodium cacodylate (0.05 M) Electron Microscopy Sciences 12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous) Electron Microscopy Sciences 19150
Ethanol (absolute) Sigma E7023
Colloidal silver paint Electron Microscopy Sciences 12630
SEM sample stubs Electron Microscopy Sciences 75220
Coverslips Thermo Fisher 08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit R&D Systems D8000C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
  3. Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
  4. Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
  5. Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
  6. Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
  7. Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
  8. Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
  9. Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17 (2012).
  10. Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
  11. Cover, T. L., Peek, R. M. Jr Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
  12. Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420 (2013).
  13. Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
  14. Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
  15. Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
  16. Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
  17. Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
  18. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  19. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
  20. Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
  21. Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
  22. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  23. Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
  24. Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
  25. Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).

Tags

العدوى، العدد 93،
عالية الدقة المجهر الإلكتروني ل<em&gt; هيليكوباكتر بيلوري</em&gt; CAG النوع الرابع إفراز نظام بيلي المنتجة في ظروف مختلفة من توافر الحديد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy,… More

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy, J. A. High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability. J. Vis. Exp. (93), e52122, doi:10.3791/52122 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter