Protocol
1. H. pylori Wachstum bei unterschiedlichen Bedingungen von Iron Verfügbarkeit und Co-Kultur mit Menschen Magenepithelzellen
- Wählen H. pylori-Stamm PMSS1 für diese Untersuchungen, weil es ein intaktes cag Pathogenität Insel und drückt eine IV-Sekretionssystem Funktionieren Typ. Auch verwenden einen isogenen Cage Mutante (PMSSI Δ Cage) als Negativkontrolle. Wachsen Bakterien auf TSA-Platten mit 5% Schafblut (Blut-Agar-Platten) für 24 h ergänzt war, bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2.
HINWEIS: Bereiten Reagenzien und montieren Materialien wie in der Materialien und Geräte Tabelle skizziert. Endkonzentrationen für jedes Reagenz ist in Klammern aufgeführt. - Kratzen Bakterien von der Platte mit einem sterilen Wattestäbchen und impfen in modifizierte Brucellabrühe aus den Komponenten (siehe Materialien und Geräte Tabelle) und mit Cholesterin ergänzt. Kulturen über Nacht bei 37 inkubieren° C in Raumluft mit 5% CO 2, ergänzt mit 200 Umdrehungen pro Minute (rpm) schüttelt.
HINWEIS: Cholesterin anstelle von fötalem Rinderserum auf die Tatsache zurückzuführen, dass Serum-Komplex verwendet; mit zahlreichen Quellen von Nährstoffen Eisen wie Häm, die Variabilität der Ergebnisse verursacht. - Am Tag der Kultivierung bakterieller, Samen AGS menschlichen Magen-Epithelzellen (ATCC CRL-1739) auf Poly-D-Lysin-behandelten Deckgläschen in 12-Well-Platten (ca. 1 x 10 5 Zellen pro Vertiefung).
- Am folgenden Tag, verdünnte Bakterienkulturen bis zu einer OD600 von 0,3 in modifizierten Brucellabrühe allein oder mit 100 & mgr; M FeCl 3, 200 & mgr; M Dipyridyl (ein synthetisches Eisen-Chelator) oder 200 uM Dipyridyl plus 250 & mgr; M FeCl 3 ergänzt. Diese Kulturen für 4 Stunden bei 37 ° C inkubieren in Raumluft mit 5% CO 2, ergänzt mit Schütteln bei 200 Upm.
- Zentrifuge Bakterien bei 1.000 xg, um Zellen zu sammeln und die Überstände zu entfernen, bevor Resuspendieren in ein gleiches Volumen frischer modifiziert Brucella-Brühe, ergänzt mit Cholesterin. Maßnahme OD600 der Kultur (OD 600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 Zellen / ml) und Bakterien in den Epithelzellen in einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 20: 1. Führen serielle Verdünnungen und Platte Bakterienzellen auf Blutagarplatten, um bakterielle Zelllebensfähigkeit zu beurteilen.
- Inkubieren H. pylori und AGS menschlichen Magen-Epithelzellen Co-Kulturen für 4 Stunden bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2 in statischen Bedingungen vor dem Durchführen der Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Probenvorbereitung.
2. SEM Probenvorbereitung zur H. Visualisieren pylori Cag-T4SS Pili
- Entfernen H. pylori und AGS Co-Kulturen aus dem Inkubator und dekantieren Kulturüberstand (außer für IL-8 ELISA). Vorsichtig mit 0,05 M Natriumcacodylat-Puffer (pH 7,4), drei Mal waschen. Fix Proben für 2-4 Stunden bei Raumtemperatur in einer Lösung von 2,0% Paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd und 0,05 M Natriumcacodylatpuffer. Nach der primären Fixierung, waschen Proben dreimal mit 0,05 M Natriumcacodylatpuffer.
- Zuführen Sekundärfixation mit 0,1% Osmiumtetroxid in 0,05 M Natriumcacodylatpuffer in zwei aufeinanderfolgenden 10 min Fixierungsschritte. Nach sekundäre Fixierung, waschen Proben dreimal mit 0,05 M Natriumcacodylatpuffer.
- Nach der primären und sekundären Fixierung, Dehydratisierung Proben durch aufeinanderfolgende Waschen mit steigenden Konzentrationen von Ethanol gemäß Tabelle 1.
- Nach Ethanol-Dehydratisierung, führen drei sequentielle Wasch von flüssigem Kohlendioxid. Dann trockenen Proben an einem kritischen Punkt mit einem kritischen Punkt Trockner bei einer Temperatur von 31,1 ° C und einem Druck von 1073 PSI.
- Berg Deckgläser auf Aluminium SEM Proben Stubs und malen Sie mit einer dünnen Linie von kolloidalem Silber an der Probenkante geeignete Erdung zu erreichen und zu vermeiden Lade während SEM-Bildgebung.
- Coat Proben mit 5 nmGold-Palladium mit einem Sputter-Mantel Maschine Probe Sekundärelektronensignal und Kanteneffekt zu erhöhen.
3. Imaging Parameter für die hochauflösende SEM Analysen
- Ansicht Proben mit einem Feldemissions-Gun Rasterelektronenmikroskop (FEG-SEM).
- Bild in einem Hochvakuumbetrieb bei einem Arbeitsabstand von 5-10 mm.
- Stellen Sie die Beschleunigungsspannung bis 5 kV.
- Stellen Punktgröße auf 2-2,5.
- Kippen Sie die Probe zwischen 15-25 Grad, um eine bessere Sicht auf die Wirt-Pathogen-Schnittstelle zu erreichen.
- Priorisieren Abbilden Bakterien haft zu den Kanten der Epithelzellen bei hoher Vergrößerung Betrachtung, da diese Bereiche der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen sind für die Pili-bildenden Bakterien angereichert.
4. Statistische Analysen zu Pili Quantifizierungen auswerten
- Analysieren H. pylori CAG T4SS Pili mit ImageJ Software Anzahl von Pili / Zelle sowie Prozent der Zellen zu quantifizieren zeigt die piliated pheNOTYPE pro Erklärung unten.
- Offene mikroskopische Aufnahme Dateien in ImageJ Software. Identifizierung Pili als Strukturen zwischen der Bakterienzelle und Wirtszelle mit einheitlicher Breite (10-13 nm) und Länge (60-150 nm) gebildet.
HINWEIS: Die Pilus Struktur auf WT Bakterienstämme vorhanden, aber abwesend isogenen Stämme wie Δ Cage Mutantenstämme, die eine Inaktivierung des Gens die Haupt ATPase, die Befugnisse Typ IV Sekretion Pilus-Zusammenbau kodiert Hafen ist. - Kalibrieren Sie das Messwerkzeug durch Ziehen einer Linie mit der Geraden Werkzeug und dann auf der Registerkarte "Analysieren". Wählen Sie "Scale" aus dem Dropdown-Menü und geben Sie den Vergrößerungs bar Wert in das Feld "bekannte Strecke" und stellen Sie die Einheit der Länge in der entsprechenden Einstellung (nm). Klicken Sie auf "OK".
- Messen Sie Cag-T4SS Pili mit der geraden Linie Werkzeug, um über die Länge oder Breite des Pilus ziehen und drücken Sie "Strg-M", um jeden Pilus messen. Beachten Sie eine Dialogbox mit den gemessenen Werten. Notieren Sie diese Werte oder Kopieren und Einfügen in ein Tabellenkalkulationsprogramm.
- Verwenden Sie die Länge und Breite Parameter vorher festgelegten 24, Missachtung Features, die passen nicht in das Profil der Cag-T4SS. Dann quantifizieren die Anzahl der Pili basierend auf Werten, die in den 10 bis 13 nm Breite und 60 bis 150 nm Länge Cutoffs sind.
- Analysieren Sie den Quantifizierung von Pili statistisch durch zweiseitigen Student t-Test mit GraphPad Prism Software.
5. Optional: Auswertung der IL-8-Sekretion mit Pilus Produktion Korrelieren
- Mit Überstände aus Schritt 2.1, führen Sie eine IL-8 ELISA gemäß den Herstellerangaben mit dem Kit (siehe Materialien und Ausstattungstabelle).
- Analysieren Sie den IL-8 durch Wirtszellen sezerniert und berechnen die prozentuale IL-8 Induktion nach WT PMSS1 allein im Medium gezüchtet. Statistische Analysen mit zweiseitigen Student t-Test mit GraphPad Prism software.
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Representative Results
In diesem Bericht haben wir gezeigt, dass die Bedingungen der unterschiedlichen Eisenverfügbarkeit die Fähigkeit, H. modulieren pylori Cag-T4SS Pilus-Biogenese im Wirt-Pathogen-Schnittstelle. Wenn in Medium allein, H. kultiviert pylori bildet einen Durchschnitt von 3 Pili / Zelle. Wenn H. pylori ist in Eisen gewachsen erschöpfen Bedingungen (unter Verwendung des synthetischen Chelator Dipyridyl), die Unter hemmend auf das Bakterienwachstum (Abbildung 1) sind, die Bakterien produzieren zahlreiche Cag-T4SS Pili (~ 7 Pili / Zelle), wenn co-kultiviert mit menschlichen Magenzellen (Abbildung 2). Umgekehrt, wenn eine exogene Quelle von Nährstoff Eisen vorhanden ist, die Bildung von Cag-T4SS Pili wird verdrängt (weniger als 1 Pilus / Zelle in FE Probe weniger als 1 Pilus / Zelle in FE + DIP Probe) (Abbildung 2). Die Quantifizierung der Pili an der Wirt-Pathogen-Schnittstelle zeigt, dass unter den Bedingungen der Eisen Einschränkung, H. pylori zeigt eine 2-fache Erhöhung der Cag-T4SS Pili (p <0,000 1) und die Prozent piliierter Zellen steigt um 11% (p <0,05) im Vergleich zu Zellen, die in Medium alleine gezüchtet (Abbildung 3). Interessanterweise ist die Aktivität des Cag-T4SS, wie Host-IL-8-Sekretion gemessen, 107% unter den Bedingungen der Eisen Einschränkung verbessert und unterdrückt 49% unter den Bedingungen der überschüssiges Eisen Verfügbarkeit im Vergleich zu Medium allein (p = 0,03 und p < 0,001) ein Ergebnis, das die SEM-Daten unterstützt. Allerdings bleiben Pili Abmessungen Einklang unter allen Bedingungen der Eisenverfügbarkeit (Abbildung 4). Weiterhin Eisenverfügbarkeit nicht die Biogenese von Pili auf der Oberfläche eines Käfigs Mutante zu ändern, auch nicht dies isogenen Derivats Fähigkeit, eine IL-8-Antwort von Wirtszellen induzieren ändern, unterstützt die Hypothese, dass die aufgezeigten Strukturen sind in der Tat, cag-T4SS und nicht eine zusätzliche unabhängige Oberflächenmerkmal.
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Abb. 1: Bakterielle Lebensfähigkeit unter verschiedenen Bedingungen von Eisen Verfügbarkeit bestimmt H. pylori war allein in modifizierten Brucella-Brühe gezüchtet (Medium alleine) oder mit 100 & mgr; M FeCl 3 (FE) 200 uM Dipyridyl (DIP) oder 200 uM Dipyridyl plus 250 & mgr; M FeCl 3 (FE + DIP) ergänzt. Bakterien wurden seriell auf bakteriologischen Medium vor der Inkubation für 2 Tage bei 37 ° C in Gegenwart von 5% CO 2 verdünnt und ausplattiert. Kolonien wurden gezählt und Kolonie-bildenden Einheiten / ml (CFU / ml) wurden berechnet. Balken zeigen von drei unabhängigen Experimenten bedeuten +/- SEM. Die Behandlung mit DIP, FE oder FE + DIP hat Lebensfähigkeit der Bakterien nicht wesentlich verändern.
Abbildung 2: High reSOLUTION Rasterelektronenmikroskopie-Analysen von H. pylori Cag-T4SS Pili. Bakterien wurden in A) Medium allein gezüchtet, B) Medium mit 100 & mgr; M FeCl 3 ergänzt, C) Medium mit 200 & mgr; M Dipyridyl oder D) Medium mit 200 & mgr; M ergänzt Dipyridyl ergänzt plus 250 & mgr; M FeCl 3 vor der Co-Kultur mit menschlichen AGS Magenzellen. Die Pfeile zeigen Cag-T4SS Pili an der Wirt-Pathogen-Schnittstelle gebildet. Proben wurden durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie analysiert CAG-T4SS Biogenese bewerten. AGB geringe Verfügbarkeit Eisen erhöhen die Prävalenz von Cag-T4SS Pilus Bildung, während Bedingungen überschüssige verfügbaren Nährstoff Eisen verdrängen Cag-T4SS Pilus Bildung.
Abbildung 3: Quantifizierung von Pili / Zelle und der Prozent piliierter Zellen in verschiedenen kultiviertenBedingungen Eisenverfügbarkeit. Bakterien wurden in modifizierten Brucellabrühe allein (Medium alleine) angebaut oder Medium mit 100 & mgr; M FeCl 3 (FE) 200 uM Dipyridyl (DIP) oder 200 uM Dipyridyl plus 250 & mgr; M FeCl 3 (FE + DIP) vor der Co- ergänzt Kultur mit menschlichen Magen Epithelzellen. Proben wurden durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie und Pili wurden mit ImageJ Software zählten analysiert. A) Streudiagramm von Pili pro Zelle (* p <0,0001 im Vergleich zum Medium allein) und B) Balkendiagramm Prozent piliierter Zellen (* p <0,05 im Vergleich zum Medium allein) 60-112 Zellen abgeleitet pro Kultur Bedingung aus 3 separaten abgeleitet biologische Experimente.
Abbildung 4: Pilus Abmessungen von Zellen in verschiedenen Bedingungen der Eisenverfügbarkeit kultiviert gemessen. Bacteria wurden in modifizierten Brucellabrühe allein (Medium alleine) angebaut oder Medium mit 100 & mgr; M FeCl 3 (FE) 200 uM Dipyridyl (DIP) oder 200 uM Dipyridyl plus 250 & mgr; M FeCl 3 (FE + DIP) vor der Co- ergänzt Kultur mit menschlichen Magen Epithelzellen. Die Proben wurden durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie analysiert und Pili Dimensionen wurden mit ImageJ Software gemessen. A) Pilus Breite ist ein Mittelwert von 13,1 +/- 2,4 nm unter allen Bedingungen. B) Pilus Länge ein Mittelwert von 75,8 +/- 16,0 nm unter allen Bedingungen. Kein signifikanter Unterschied in Pilus Abmessungen in den verschiedenen Bedingungen des Eisenverfügbarkeit gesehen.
STADT Abbildung 1: Hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie-Analysen von H. pylori Cage Mutante in verschiedenen Bedingungen der Eisenverfügbarkeit. Bakterien wurden in A) Medium, ergänzt mit 100 & mgr; M FeCl 3 gewachsen, B) Medium, ergänzt mit 200 & mgr; M Dipyridyl (DIP) oder C) Medium mit 200 & mgr; M Dipyridyl (DIP) plus 250 & mgr; M FeCl 3 vor der Co-Kultur mit menschlichen Magenzellen AGS ergänzt. Proben wurden durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie analysiert CAG-T4SS Biogenese bewerten. Bedingungen von niedriger oder hoher Eisen keine Cag unabhängige Pilus-Biogenese zu modulieren, die die Theorie, dass die in Abbildung 2 visualisiert Strukturen sind Cag-T4SS Pili.
STADT Abbildung 2: ELISA-Analyse der Host-IL-8-Sekretion in Reaktion auf Bakterien in unterschiedlichen Bedingungen der Eisenverfügbarkeit gewachsen. Wildtyp (weiße Balken) oder Käfig-Mutante (graue Balken) wurden die Bakterien in abgewandelter Brucellabrühe allein (Medium alleine) angebaut oder Medium mit 100 & mgr; M FeCl 3 (FE) 200 uM Dipyridyl (DIP) oder 200 & mgr; M ergänzt Dipyridyl plus 250 uM FeCl 3 (FE + DIP) vor der Co-Kultur mit menschlichen Magen Epithelzellen. Bügeleisen Einschränkung führt zu einer erhöhten IL-8, Reaktion ein Host, der abhängig von Cag-T4SS Aktivität ist. Balken zeigen Mittelwert +/- SEM aus 3 separaten biologischen Experimenten abgeleitet. (* P <0,05 im Vergleich zu PMSS1 allein im Medium).
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Discussion
Eisen ist ein wesentliches Spurenelement für die meisten Lebensformen, einschließlich bakterieller Pathogene. In dem Bemühen, die Lebensfähigkeit der eindringenden Mikroorganismen zu beschränken, Wirbeltierwirten maskieren Nährstoff Eisen in einem Prozess als "Ernährungs Immunität" 18 bekannt. In Reaktion darauf wurden bakterielle Pathogene entwickelt, um Eisen als globales Signal-Molekül zu verwenden, um die Umgebung zu erfassen und zu regeln für die Ausarbeitung von Virulenz-Eigenschaften, wie Eisenaufnahmesysteme, Toxine und Toxin-Sekretion Maschinen 19,20.
H. pylori erfordert Mikronährstoffe wie Eisen, Zink und Magnesium, zu wachsen und 22 können alternative Eisenquellen, wie Häm, Hämoglobin, Transferrin verwendet, und Lactoferrin. 23 H. pylori, wie die meisten erfolgreichen Krankheitserreger, hat ein breites Repertoire von Virulenzfaktoren entwickelt zu helfen, sie zu fangen Nähreisen vom Host 21. Ein Virulenzfaktor, CagA, der Effektor Molekule der CAG-T4SS wird in Umleitung Transferrin aus dem basolateralen Seite der polarisierten Zellen an der apikalen Oberfläche, wo sie leicht von den Zellen der Bakterien als Nährstoffeisenquelle verwendet werden, und zur Förderung der Replikations 15 gebracht. So scheint es eine intuitive evolutionäre Strategie, um die Sekretion von CagA in den Bedingungen der niedrigen Verfügbarkeit Eisen fördern.
Die H. pylori CAG T4SS ist eine wichtige bakterielle Organelle, aufgrund der proinflammatorischen Wirtszellantworten entlockt. Die Wirkungen von CAG-T4SS wurden gut in beiden Co-Kulturen und Tierinfektionsmodellen untersucht. Jedoch haben Studien der Makromolekülstruktur und Zusammensetzung dieses Toxins Sekretionssystem durch das Fehlen von hochauflösenden Abbildungsprotokolle behindert. Unsere bereits veröffentlichten Berichte Studium der Cag-T4SS haben durchschnittlich vier Cag-T4SS Pili pro Bakterienzelle durch hochauflösende Elektronenmikroskopie gemeldet Analysen 24. Unser verbessertes Verfahren bieteteine robuste Bildgebungstechnik zu CAG-T4SS durch Verwendung eines Kulturtechnik, die die Erzeugung dieser Funktion auf der Oberfläche der Bakterienzelle fördert visualisieren. Nutzung von Kulturtechniken in Verbindung mit hochauflösenden Feldemissions-gun Rasterelektronenmikroskop ist kritisch für diese Bildgebungsprotokoll. Zwei-fache Anreicherung des Cag-T4SS Oberflächenmerkmal ist eine deutliche Steigerung für die Ermittler daran interessiert sind immunhistochemischen Analysen wie Immunfluoreszenz oder Immunpräzipitation Techniken zur weiteren Charakterisierung der subzellulären Ort oder Zusammensetzung des Cag-T4SS. Sobald der hochauflösenden Elektronenmikroskopie Bildgebung des Cag-T4SS bewältigt wurde, ist es auch möglich, andere Anwendungen, wie zB Immun-Kennzeichnung zu entwickeln, um den Ort der bakteriellen Proteine bezüglich des Cag-T4SS Pilus 25 bestimmen.
Eine Einschränkung der Technik ist die Tatsache, dass die Forscher immer noch zu begrenzt using ein Co-Kultursystem zur Visualisierung von CAG-T4SS. In einem Feld, nur eine Teilmenge von H. pylori unter normalen Kulturbedingungen diese Strukturen bilden (etwa 50-70 Prozent, siehe Abbildung 3 Panel B). Also zahlreichen Zellen in einem Feld wird nicht piliierter sein. Es ist nicht bekannt, warum diese Subpopulationen an der gleichen Stelle vorhanden sind, aber diese Zellen immer in beide Quantifizierungen von Pili / Zelle und Prozent der Zellen mit Pili an der Oberfläche erfasst. Da CAG-T4SS nur an den Host-Schnittstellen bakteriellen beobachtet, sind die primären und sekundären Fixierungsschritte innerhalb des SEM Probenvorbereitung wichtig für den Erhalt der beiden proteinartigen Strukturen und die Membranen der eukaryotischen und prokaryotischen Zellen. Allerdings kann Über Fixierung auftreten, wenn Fixierung Schritte werden länger als geführt umrissen, oder wenn die Lösungen nicht frisch zubereitet. Wenn über Fixierung auftritt, wird Proben einen steinigen Aussehen haben, wenn sie unter SEM betrachtet, und der Cag-T4SS durch diese maskiert werden. Um troubleshoot, wiederholen Sie die SEM Probenvorbereitung mit weniger konzentrierte Fixiermittel und / oder weniger Zeit in der Gegenwart des Fixierungs inkubiert.
Die Co-Kultursystem macht auch biochemische Charakterisierung (wie Massenspektrometrie analysiert) mühsam aufgrund der Kontamination von großen Mengen von Wirtsproteinen. Doch das Verständnis der molekularen Mechanismen, die die Produktion dieses bakteriellen Sekretionssystem regulieren könnte letztlich zu neuen Techniken, die Cag-T4SS Pilus Bildung in Abwesenheit von Wirtszellen auslösen führen. Dies würde die Isolierung und Reinigungsverfahren für biochemische Assays stark verbessert.
Abschließend berichten wir, dass Bedingungen beschränkt Eisenverfügbarkeit aufgrund einer erhöhten Produktion von H. pylori Cag-T4SS, die durch hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie Techniken sichtbar gemacht werden kann. Wir berichten auch die eisenabhängige Verdrängung dieser Oberflächenmerkmal an der Wirt-Pathogen interface. Dieser Test kann optimiert und für zahlreiche bakterielle Krankheitserreger, die eisenregulierten toxin Sekrete zu bilden und ist im Großen und Ganzen auf eine Vielzahl von Wirt-Mikroben-Interaktionen eingesetzt werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified brucella broth | |||
| Peptone from casein (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptic digest of animal tissue (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Yeast extract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Sodium chloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 or 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Modified RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Fetal bovine serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Electron Microscopy Preparation | |||
| Paraformaldehyde (2.0% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2.5% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Sodium cacodylate (0.05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0.1% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absolute) | Sigma | E7023 | |
| Colloidal silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM sample stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 Secretion Evaluation | |||
| Quantikine IL-8 ELISA kit | R&D Systems | D8000C |
References
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