Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52122
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Protocol

1. ח פילורי צמיחה בתנאים שונים של זמינות ברזל ושיתוף תרבות עם תאים אנושי הקיבה אפיתל

  1. בחר ה ' PMSS1 פילורי מתח למחקרים אלה כי יש לו אי פתוגניות CAG שלם ומבטא את מערכת הפרשה מסוג IV תפקוד. גם לנצל מוטציה כלוב isogenic (PMSSI Δ קייג ') כביקורת שלילית. לגדול חיידקים על צלחות TSA בתוספת 5% דם כבשים (צלחות אגר דם) למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2.
    הערה: הכן חומרים כימיים ולהרכיב חומרים כפי שמתואר בטבלת חומרים וציוד. ריכוזים סופיים לכל מגיב רשום בסוגריים.
  2. לגרד חיידקים מהצלחת באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי ולחסן לתוך מרק ברוצלה שונה שהוכן ממרכיבים (ראה חומרים וציוד בלוח) והשלים עם כולסטרול. דגירה תרבויות הלילה בשעה 37° C באוויר חדר בתוספת 5% CO 2 עם רועד ב200 סיבובים לדקה (סל"ד).
    הערה: כולסטרול משמש במקום של סרום שור עוברי בשל העובדה שהסרום הוא מורכב; המכיל מספר רב של מקורות ברזל תזונתי כגון heme הגורם לשונות בתוצאות.
  3. ביום culturing חיידקים, זרע תאי האפיתל של הקיבה אנושי AGS (ATCC CRL-1739) על coverslips טופל poly-D- ליזין ב12 גם צלחות (כ 1 x 10 5 תאים לכל טוב).
  4. למחרת, לדלל תרבויות חיידקים לOD600 של 0.3 במרק ברוצלה שונה לבד או בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3, dipyridyl 200 מיקרומטר (chelator ברזל סינטטי), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3. דגירה תרבויות אלה במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס באוויר חדר בתוספת 5% CO 2 עם הרועד בסל"ד 200.
  5. חיידקי צנטריפוגה XG ב 1000 לאיסוף תאים ולהסיר supernatants לפני resuspending אניn נפח שווה של מרק ברוצלה שונה טרי בתוספת כולסטרול. מדד OD600 של התרבות (OD600 = 1.0 = 5.5 x 10 8 תאים / מיליליטר) ולהוסיף חיידקים לתאי האפיתל בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20: 1. לבצע דילולים סידוריים ותאי חיידקיים צלחת על גבי צלחות אגר דם כדי להעריך את כדאיות תא חיידק.
  6. דגירה H. שיתוף תרבויות תאי האפיתל של הקיבה אנושי פילורי וAGS במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2 בתנאים סטטיים לפני הביצוע במיקרוסקופ אלקטרונים סורק הכנת מדגם (SEM).

2. SEM לדוגמא הכנה לדמיין H. פילורי CAG-T4SS פילי

  1. הסר H. פילורי ושיתוף תרבויות AGS מsupernatant תרבות חממה ולמזוג (למעט IL-8 ELISA). לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 0.05 חיץ M נתרן cacodylate (pH 7.4). תקן את הדגימות ל2-4 שעות בטמפרטורת חדר בתמיסה של paraformaldehyde 2.0%, 2.5gluteraldehyde%, וחיץ cacodylate 0.05 M נתרן. לאחר קיבוע ראשוני, לשטוף דגימות שלוש פעמים עם חיץ cacodylate 0.05 M נתרן.
  2. בצע קיבעון המשני באמצעות 0.1% tetroxide אוסמיום ב0.05 חיץ cacodylate M נתרן בשני 10 ברצף צעדי קיבעון דקות. לאחר קיבוע המשני, לשטוף דגימות שלוש פעמים עם חיץ cacodylate 0.05 M נתרן.
  3. לאחר קיבוע ראשוני והמשני, ליבש דגימות על ידי שטיפה רציפה עם ריכוזים גוברים של אתנול לפי טבלת 1.
  4. לאחר התייבשות אתנול, לבצע שלושה שוטף רציף של נוזל פחמן דו חמצני. דגימות ואז יבשות בנקודה קריטית באמצעות מכונה מייבש נקודה קריטית בטמפרטורה של 31.1 ºC ולחץ של 1073 PSI.
  5. הר coverslips על ספחי מדגם האלומיניום SEM ולצייר עם קו דק של מי כסף בקצה המדגם כדי להשיג הארקה מתאימה ולהימנע מלחייב במהלך ההדמיה SEM.
  6. דגימות מעיל עם 5 ננומטר שלזהב-פלדיום באמצעות מכונה מעיל גמגום להגדיל מדגם אותות משני אלקטרונים ואפקט קצה.

3. פרמטרי הדמיה לניתוחים ברזולוציה הגבוה SEM

  1. צפה בדוגמאות עם אקדח מיקרוסקופ סורק אלקטרוני פליטת שדה (FEG-SEM).
  2. תמונה במצב ואקום גבוה במרחק עבודה של 5-10 מ"מ.
  3. הגדר את המתח המאיץ עד 5 קילו וולט.
  4. הגדר את גודל מקום ל2-2.5.
  5. הטה את המדגם בין 15-25 מעלות כדי להשיג ראייה טובה יותר של ממשק המאכסן לפתוגן.
  6. לתעדף הדמיה חיידקים חסיד לקצוות של תאי האפיתל לצפייה הגדלה גבוהה, כתחומים של אינטראקציה המאכסן לפתוגן אלה מועשרים לחיידקים יוצרי פילים.

4. ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את הפילים Quantifications

  1. לנתח H. פילי CAG-T4SS פילורי באמצעות תוכנת ImageJ לכמת מספר פילים / תא, כמו גם אחוז של תאים המציגים piliated Phenotype בהתאם להנחיות למטה.
  2. קבצי מיקרוסקופ פתוחים בתוכנת ImageJ. לזהות פילים כמבנים שנוצרו בין תא החיידק והתא מארח, עם רוחב אחיד (10-13 ננומטר) ואורך (60-150 ננומטר).
    הערה: מבנה pilus קיים בזני חיידקי WT, אבל נעדרו בזני isogenic כגון זנים מוטנטים כלוב Δ, שנמל איון בגן המקודד את ATPase המרכזי שהרכבת pilus הפרשת IV סוג סמכויות.
  3. כייל את כלי המדידה על ידי ציור קו עם כלי הקו הישר ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסייה "נתח". בחר "סולם הגדר" מהתפריט הנפתח והזן את הערך בר הגדלה לתוך התיבה "מרחק ידוע" שכותרתו ולהגדיר את יחידת האורך להגדרה המתאימה (ננומטר). לחץ על "אישור".
  4. למדוד פילי CAG-T4SS שימוש באפשרות הקו הישר לצייר על האורך או הרוחב של pilus ולאחר מכן לחץ על "Ctrl-M" למדוד כל pilus. שים לב תיבה דו-שיח עם הערכים שנמדדו. רשום את הערכים הללו או להעתיק ולהדביק לתוך תכנית גיליון אלקטרוני.
  5. השתמש באורך ורוחב פרמטרים שנקבעו בעבר 24 תכונות התעלמות, שאינו מתאימות לפרופיל של CAG-T4SS. ואז לכמת את מספר הפילים המבוססים על ערכים הנמצאים בהפסקות 10-13 ננומטר רוחב ו60-150 ננומטר אורך.
  6. נתח את הכימות של פילים סטטיסטיים על ידי מבחן t של סטודנט שני זנב באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה.

5. אופציונלית: הערכה של IL-8 ההפרשה במיתאם עם Pilus הפקה

  1. באמצעות supernatants משלב 2.1, לבצע ELISA IL-8 לפי הוראות יצרן עם הערכה (ראה חומרים וציוד בלוח).
  2. נתח את IL-8 מופרש על ידי תאי מארח ולחשב את האינדוקציה IL-8 אחוזים ביחס לWT PMSS1 גדלו במדיום לבד. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t של סטודנט שני זנב באמצעות GraphPad פריזמה כךftware.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בדוח זה, אנחנו הוכחנו כי יש להם תנאים משתנים זמינות ברזל היכולת לווסת את ה biogenesis pilus פילורי CAG-T4SS בממשק שהפתוגן המארח. כאשר בתרבית בינונית בלבד, ח ' פילורי מהווה ממוצע של 3 פילים / תא. כאשר ה ' פילורי הוא גדל בברזל לרוקן את תנאים (באמצעות dipyridyl chelator הסינתטי), כי הם תת-מעכבים להתפתחות חיידקים (איור 1), החיידקים לייצר CAG-T4SS רב פילים (~ 7 פילים / תא) כאשר שיתוף תרבותי עם תאי קיבה אנושיים (איור 2). לעומת זאת, כאשר מקור אקסוגני של ברזל תזונתי קיים, ההיווצרות של פילי CAG-T4SS מודחקת (pilus פחות מ 1 / תא במדגם FE, pilus פחות מ 1 / תא במדגם מח"ש FE +) (איור 2). כימות של הפילים בממשק שהמאכסן לפתוגן, עולה כי בתנאים של הגבלת ברזל, ח ' פילורי מציג גידול של פי 2 בCAG-T4SS פילים (p <0.000 1) ועליות תאי אחוזים piliated ב -11% (p <0.05) בהשוואה לתאים שגודלו במדיום בלבד (איור 3). מעניין לציין, הפעילות של CAG-T4SS, כפי שנמדדו על ידי מארח הפרשת IL-8, היא משופרת 107% בתנאים של הגבלת ברזל ומודחק 49% בתנאים של זמינות עודפת ברזל בהשוואה לבינוני בלבד (p = 0.03, וp < 0.001, בהתאמה) תוצאה שתומכת בנתוני SEM. עם זאת, ממדי פילים להישאר עקביים בין כל התנאים של זמינות ברזל (איור 4). יתר על כן, זמינות ברזל אינה משנה את biogenesis של פילים על פני השטח של מוטציה כלוב, וגם לא לשנות את היכולת של נגזר isogenic זה כדי לגרום לתגובת IL-8 מתאי מארח, התומך בהשערה כי המבנים הפגינו הם, למעשה, CAG-T4SS ולא תכונת פני השטח נוספת שאינה קשורה.

n "src =" / קבצים / ftp_upload / 52,122 / "width =" 52122fig1highres.jpg 500 "/>
איור 1:. כדאיות בקטריאלי שנקבעה בתנאים שונים של זמינות ברזל H. פילורי היה בתרבית במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בתוספת של 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח"ש), או dipyridyl 200 מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 (מח"ש FE +). חיידקים בדילול סדרתי ומצופים על מדיום בקטריולוגית לפני דגירה עבור 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2. מושבות נספרו והמושבה להרכיב יחידות / מ"ל ​​(CFU / ml) חושבה. ברים לציין ממוצעים של שלושה ניסויים בלתי תלויים +/- SEM. טיפול במח"ש, FE, או FE + מח"ש אינו משנה באופן משמעותי את הכדאיות בקטריאלי.

איור 2
איור 2: r הגבוהבמיקרוסקופ אלקטרונים סורק esolution ניתוחים של H. פילי פילורי CAG-T4SS. חיידקים גודלו ב) בינוני לבד, B) בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3, בינוני ג) בתוספת 200 dipyridyl מיקרומטר, או D) בינוני בתוספת 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 לפני התרבות המשותפת עם אדם AGS תאי קיבה. חצים מצביעים על פילי CAG-T4SS נוצרו בממשק המאכסן לפתוגן. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה כדי להעריך biogenesis CAG-T4SS. תנאים של זמינות ברזל נמוכה להגדיל את השכיחות של היווצרות pilus CAG-T4SS, בעוד תנאים של ברזל תזונתי זמין עודף לדכא היווצרות pilus CAG-T4SS.

איור 3
איור 3: כימות פילים / תא ואחוזים piliated תאים בתרבית בשונהתנאים של זמינות ברזל. חיידקים גדלו במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח"ש), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 (מח"ש FE +) לפני שיתוף תרבות עם תאי האפיתל בקיבה אנושיים. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה ופילים נפקדו באמצעות תוכנת ImageJ. ) Scatterplot של פילים לכל תא (* p <0.0001 בהשוואה למדיום לבד) ו- B) אחוזים מתארים גרף עמודות של תאי piliated (* p <0.05 בהשוואה לבינונית בלבד) נגזרים 60-112 תאים לכל תרבות מצב נגזר מ3 נפרד ניסויים ביולוגיים.

איור 4
איור 4: ממדי Pilus נמדדו מהתאים בתרבית בתנאים שונים של זמינות ברזל. Bacteria גדלו במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח"ש), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 (מח"ש FE +) לפני שיתוף תרבות עם תאי האפיתל בקיבה אנושיים. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה וממדים פילים נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ. ) רוחב Pilus הוא ממוצע של 13.1 +/- 2.4 ננומטר בין כל התנאים. B) אורך Pilus הוא ממוצע של 75.8 +/- 16.0 ננומטר בין כל התנאים. לא נמצא הבדל משמעותי בממדי pilus נראה בתנאים השונים של זמינות ברזל.

איור נוסף 1: מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה ניתוחים של H. המוטציה פילורי כלוב בתנאים שונים של זמינות ברזל. חיידקים גודלו במדיום) בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3, B) בינוני בתוספת dipyridyl מיקרומטר 200 (Dבינוני IP) או C) בתוספת dipyridyl 200 מיקרומטר (מח"ש) בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 לתרבות משותפת קודמת עם תאי קיבה אנושיים AGS. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה כדי להעריך biogenesis CAG-T4SS. תנאים של ברזל נמוך או גבוה לא לווסת כל biogenesis pilus CAG-עצמאי, התומך בהשערה כי המבנים דמיינו באיור 2 הם פילי CAG-T4SS.

איור נוסף 2: ניתוח ELISA של מארח הפרשת IL-8 בתגובה לחיידקים גדלו במשתנים תנאים של זמינות ברזל. Wild-type (פסים לבנים) או מוטציה כלוב (פסים אפורים) חיידקים גדלו במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח"ש), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 אום FeCl 3 (מח"ש FE +) לתרבות המשותפת קודמת עם תאי האפיתל בקיבה אנושיים. תוצאות הגבלת ברזל בIL המוגבר-8, תגובת מארח שהוא תלוי בפעילות של החטיבה-T4SS. ברים לציין ממוצע +/- SEM, נגזר מ3 ניסויים ביולוגיים נפרדים. (* P <0.05 בהשוואה לPMSS1 גדל במדיום לבד).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ברזל הוא יסודות קורט חיוני עבור רוב צורות חיים, כוללים חיידקים פתוגנים. במאמץ להגביל את יכולת הקיום של פלישת מיקרואורגניזמים, מארחי חוליות לעקל ברזל מזין בתהליך המכונה "חסינות תזונתית" 18. בתגובה לכך, חיידקים פתוגנים התפתחו להשתמש בברזל כמולקולת איתות גלובלית לחוש את סביבתם ולהסדיר את הפיתוח של תכונות ארסיות כגון מערכות רכישת ברזל, רעלים, ומכונות הפרשת רעלן 19,20.

הליקובקטר פילורי דורש חומרים מזינים כגון ברזל, אבץ, מגנזיום ולגדול 22 ויכול להשתמש במקורות ברזל חלופיים כגון heme, המוגלובין, transferrin, ולקטופרין 23. ח פילורי, כמו רוב פתוגנים מוצלחים, התפתח רפרטואר רחב של גורמים ארסי כדי לסייע לה לחטט ברזל חומרי הזנה מהמארח 21. גורם אחד ארסי, cagA, molecu מפעילle של CAG-T4SS, מעורב בלנתב מחדש את transferrin מהצד basolateral של תאים מקוטבים למשטח הפסגה שבו ניתן להשתמש בו בקלות על ידי תאי החיידקים כמקור ברזל תזונתי ולקדם שכפול 15. כך, נראה אסטרטגיה אבולוציונית אינטואיטיבי כדי לקדם את הפרשת cagA בתנאים של זמינות הנמוכה של ברזל.

ח פילורי CAG-T4SS הוא אברון חיידקים חשוב, בשל תגובות תא מארח מעודדי דלקת זה מעורר. ההשפעות של CAG-T4SS נחקרו היטב בשני שיתוף תרבויות ומודלים של בעלי חיים לזיהום. עם זאת, מחקרים של המבנה והרכב macromolecular של מערכת הפרשת רעלן זה כבר התעכבו בשל חוסר פרוטוקולי הדמיה ברזולוציה גבוהה. הדיווחים לומדים CAG-T4SS שפורסמו בעבר שלנו דיווחו על ממוצע של ארבעה פילי CAG-T4SS לתא חיידק על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים ברזולוציה גבוהה ניתוחי 24. השיטה המשופרת שלנו מספקתטכניקת הדמיה חזקה כדי להמחיש את CAG-T4SS באמצעות טכניקת תרבות שמקדמת את הייצור של תכונה זו על פני השטח של תא החיידק. יישום של שיטות לתרבות בשיתוף עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה פליטת שדה אקדח הוא קריטי לפרוטוקול הדמיה זו. העשרה כפולה של תכונת משטח CAG-T4SS היא עלייה משמעותית עבור חוקרים מעוניינים בביצוע immunohistochemical ניתוחים כגון טכניקות immunofluorescence או immunoprecipitation לאפיין את המיקום או הרכב subcellular של CAG-T4SS נוספת. ברגע שההדמיה מיקרוסקופי אלקטרונים ברזולוציה הגבוהה של CAG-T4SS כבר שולטת, אפשר גם לפתח יישומים אחרים, כגון immunogold תיוג, כדי לקבוע את המיקום של חלבונים חיידקיים ביחס לpilus CAG-T4SS 25.

מגבלה אחת של הטכניקה שלנו היא העובדה שהחוקר עדיין מוגבל לusing מערכת שיתוף תרבות להדמיה של CAG-T4SS. בשדה אחד, רק קבוצת משנה של ה ' פילורי בתנאי תרבות נורמלים ליצור מבנים אלה (כ 50-70 אחוז, ראה איור 3 לוח ב '). רבים כל כך תאים בשדה יהיו-piliated שאינם. לא ידוע מדוע אוכלוסיות אלה קיימים באותו המקום, אבל תאים אלה תמיד היוו בתוך שני quantifications של פילים / תא ואחוז התאים עם פילים על פני השטח. בגלל CAG-T4SS נצפה רק בממשק המארח בקטריאלי, צעדי הקיבעון הראשוניים ומשניים בתוך הכנת מדגם SEM הם קריטיים לשמירה על שני מבנים חלבוניים והקרומים של התאים אוקריוטים ופרוקריוטים. עם זאת, קיבעון על יכול להתרחש אם צעדי קיבעון מתבצעים יותר ממתואר, או אם הפתרונות לא מוכנים טרי. אם קיבעון היתר מתרחש, דגימות תהיה הופעה סלעית כאשר צפו תחת SEM וCAG-T4SS יהיה רעול פנים על ידי זה. לtroubleshoot, לחזור על הכנת מדגם SEM באמצעות fixatives פחות מרוכז ו / או פחות זמן טופח על ידי הנוכחות של המקבע.

מערכת שיתוף התרבות גם הופכת אפיון ביוכימי (כמו ספקטרומטר מסה מנתח) מסורבל בגלל הזיהום של כמויות גדולות של חלבוני מארח. עם זאת, הבנת המנגנונים המולקולריים המסדירים את הייצור של מערכת הפרשת חיידקים זה יכול להביא בסופו הטכניקות חדשות שתפעיל היווצרות pilus CAG-T4SS בהעדר תאי מארח. זה ישפר מאוד את טכניקות בידוד וטיהור למבחני ביוכימיים.

לסיכום, אנו מדווחים כי תנאים של תוצאת זמינות ברזל מוגבלת בייצור מוגבר של ח פילורי CAG-T4SS שניתן דמיין ידי טכניקות במיקרוסקופ אלקטרונים סורקים ברזולוציה גבוהה. גם אנו מדווחים על דיכוי הברזל תלוי של תכונת פני השטח זה בinterfa המאכסן לפתוגןce. assay זה עשוי להיות מותאם ומנוצל לחיידקים פתוגנים רב היוצרות רעלן-הפרשות-מוסדר ברזל, והוא החלים רחב למגוון של אינטראקציות מארח חיידק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L) Sigma 70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L) Sigma 70174
Yeast extract (2 g/L) Sigma 92144
Dextrose (1 g/L) Sigma D9434
Sodium chloride (5 g/L) Thermo Fisher S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L) Life Technologies 12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM) Sigma 157740-100G
Dipyridyl (200 uM) Sigma D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X) Life Technologies 22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L) Life Technologies 10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous) Electron Microscopy Sciences 15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous) Electron Microscopy Sciences 16220
Sodium cacodylate (0.05 M) Electron Microscopy Sciences 12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous) Electron Microscopy Sciences 19150
Ethanol (absolute) Sigma E7023
Colloidal silver paint Electron Microscopy Sciences 12630
SEM sample stubs Electron Microscopy Sciences 75220
Coverslips Thermo Fisher 08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit R&D Systems D8000C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
  2. Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
  3. Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
  4. Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
  5. Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
  6. Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
  7. Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
  8. Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
  9. Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17 (2012).
  10. Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
  11. Cover, T. L., Peek, R. M. Jr Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
  12. Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420 (2013).
  13. Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
  14. Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
  15. Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
  16. Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
  17. Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
  18. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  19. Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
  20. Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
  21. Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
  22. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  23. Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
  24. Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
  25. Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).

Tags

זיהום גיליון 93, רכישת ברזל, הפרשה מהסוג IV פילים
רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy,… More

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy, J. A. High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability. J. Vis. Exp. (93), e52122, doi:10.3791/52122 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter