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Immunology and Infection

고해상도 전자 현미경 Published: November 21, 2014 doi: 10.3791/52122
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

Protocol

1. H. 인간의 위 상피 세포와 철 가용성 및 공동 문화의 다양한 조건에서 균 성장

  1. H.를 선택 이러한 연구에 대한 파이로리 스트레인 PMSS1 그것이 그대로 CAG 병원성 아일랜드를 가지며 작동 타입 IV 분비 시스템을 표현하기 때문이다. 또한 음성 대조군으로 동질 케이지 돌연변이 (PMSSI Δ 케이지)를 사용합니다. 5 % CO 2 존재하에 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % 양 혈액 (아가 플레이트)로 보충 TSA 플레이트상에서 세균 성장.
    참고 : 시약을 준비하고 재료 및 장비 표에 요약 된 자료를 조립한다. 각 시약에 대한 최종 농도는 괄호 안에 표시됩니다.
  2. 멸균 면봉을 사용하여 판에서 박테리아를 긁고 구성 요소에서 준비 수정 브루셀라 배지에 접종 (재료 및 장비 표 참조) 콜레스테롤 보충. 37에서 하룻밤 문화를 품다분 수 (rpm)에 200 회전에서 진탕 5 % CO 2로 보충 된 실내 공기를 ° C.
    NOTE : 콜레스테롤 인해 혈청이 복잡하다는 사실에 소 태아 혈청 대신에 사용된다; 이러한 결과에 변화가 발생 헴 (heme) 등의 영양소 철의 다양한 소스를 포함.
  3. 세균 배양의 날, AGS 인간 위 상피 세포를 시드 (ATCC CRL-1739) 12 웰 플레이트 (웰 당 약 1 × 105 세포)의 폴리 D 라이신 처리 된 커버 슬립 상.
  4. 다음 날, 수정 브루셀라 국물 혼자 또는 100 μM 50ml을, 200 μM의 피리 딜 (합성 철 킬레이트), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM 50ml을 보충 0.3의 OD600에 박테리아 문화를 희석. 200 rpm으로 진탕하면서 5 % CO 2로 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 4 시간 동안 배양이 부화.
  5. 1,000 XG에 원심 분리기 박테리아는 세포를 수집하고 난을 재 부유하기 전에 상층 액을 제거n은 신선한 수정 된 브루셀라 브로스 동량 콜레스테롤 보충. 문화 (OD600 = 1.0 = 5.5 × 10 8 세포 / ml)의 측정 OD600 감염 20 (MOI)의 다수의 상피 세포에 박테리아를 추가 : 1. 박테리아 세포 생존력을 평가하기 위해 혈액 아가 플레이트 상에 연속 희석 접시 균체를 수행한다.
  6. H.을 품어 주사 전자 현미경 (SEM) 시료 전처리를 수행하기 전에 정적 인 상태에서 5 % CO 2 존재 하 37 ° C에서 4 시간 동안 파이로리 AGS 인간 위 상피 세포 공동 배양.

2. SEM H.을 시각화하는 샘플 준비 pylori의 CAG-T4SS 필리

  1. H. 제거 균 및 인큐베이터와 캔트 배양 상층 액에서 AGS 공동 문화 (IL-8 ELISA에 대한 저장). 0.05 M 나트륨 cacodylate 완충액 (pH 7.4)으로 가볍게 세 번 씻으십시오. , 2.0 % 파라 포름 알데히드 용액에 2.5을 실온에서 2~4시간에 대한 샘플을 수정% 글루 테르 알데히드, 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼입니다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다.
  2. 두 연속 10 분 정착 단계에서 0.05 M 소듐 cacodylate 버퍼에 0.1 % 사 산화 오스뮴을 이용하여 차 고정을 수행한다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다.
  3. 기본 및 보조 고정 후, 표 1에 따라 에탄올의 농도가 증가함에 따라 순차적으로 세척하여 샘플을 탈수.
  4. 에탄올 탈수 후 액체 이산화탄소 세 순차 세척을​​ 수행한다. 1073 PSI의 31.1 ºC의 온도 및 압력에서 임계점 건조 기계를 사용 임계점이어서 건조한 샘플.
  5. 마운트는 알루미늄 SEM 샘플 스텁에 된 커버하고 적절한 접지를 달성하고 SEM 이미징 동안 충전을 방지하기 위해 샘플 가장자리에 콜로이드 실버의 얇은 선으로 페인트.
  6. 코트 샘플과는 5nm샘플 2 차 전자 신호 및 에지 효과를 증가시키기 위해 스퍼터 코팅 기계를 사용하여 금 - 팔라듐.

고해상도 현미경 분석 3. 이미징 매개 변수

  1. 이 필드 방출 총 스캐닝 전자 현미경 (FEG-SEM)으로보기 샘플.
  2. 5~10mm의 작동 거리에서 고진공 모드에서 이미지.
  3. 5 kV의에 가속 전압을 설정합니다.
  4. 2-2.5에 자리 크기를 설정합니다.
  5. 호스트 인터페이스 병원체의 더 나은 관점을 달성하기 위해 15 내지 25도 사이의 샘플을 기울인다.
  6. 호스트 병원체 상호 작용의 이들 영역은 필리 - 형성 박테리아 농후 한, 고배율 관찰 용 상피 세포의 가장자리에 부착 된 세균을 이미징 우선 순위.

4. 통계 분석은 필리 정량화를 평가하기

  1. H. 분석 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 파이로리 CAG-T4SS의 필리는 piliated 프 전시 세포의 필리 / 세포의 수뿐만 아니라 퍼센트를 정량화하기아래의 지침에 따라 표현형.
  2. ImageJ에 소프트웨어의 열기 현미경 사진 파일. 균일 한 폭 (10 ~ 13 ㎚)과 길이 (60-150 나노 미터)와 박테리아 세포와 숙주 세포 사이에 형성되는 구조로 필리을 확인합니다.
    NOTE : pilus 구조 주요 ATP 아제 힘 타입 IV 분비 pilus 조립체를 코딩하는 유전자에 불활 항구 이러한 Δ 케이지 변이주로서 동질 균주에 WT 균주에 존재하지만, 존재하지 않는다.
  3. "분석"탭을 클릭 한 다음 직선 도구를 사용하여 선 그리기에 의해 측정 도구를 보정합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "설정 규모"를 선택하고 상자 표시 "알려진 거리"로 확대 바 값을 입력하고 적절한 설정 (㎚)로 길이의 단위를 설정합니다. "확인"을 클릭합니다.
  4. pilus의 길이나 폭에 걸쳐 그려 직선 도구를 사용하여 CAG-T4SS의 필리를​​ 측정하고 각 pilus를 측정하기 위해 "Ctrl 키를-M"을 눌러. 측정 값과의 대화 상자를 관찰합니다. 이 값을 기록하거나 복사하여 스프레드 시트 프로그램에 붙여 넣습니다.
  5. 길이를 사용하여 폭 매개 변수는 이전에 CAG-T4SS의 프로필에 맞지 않는 24 무시 기능을 설립했다. 그런 다음 10 ~ 13 nm의 폭 및 60-150 nm의 길이 컷오프 내에있는 값에 기초 필리의 수를 정량화.
  6. 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 두 개의 꼬리 학생의 T 시험에 의해 통계적으로 필리의 정량을 분석 할 수 있습니다.

5. 선택 사항 : IL-8 분비의 평가 Pilus 생산과의 상관 관계를 분석하기

  1. 2.1 단계에서 상층 액을 사용하여, 키트 제조 업체의 지침 (재료 및 장비 표 참조) 당 IL-8 ELISA를 수행합니다.
  2. IL-8 숙주 세포에 의해 분비를 분석 단독 배지에서 성장 WT PMSS1에 대해 퍼센트 IL-8 유도를 계산한다. 그래서 그래프 패드 프리즘을 사용하여 두 꼬리 학생의 T 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행ftware.

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Representative Results

이 보고서에서 우리는 철의 가용성을 변화의 조건이 H.을 조절하는 능력을 가지고 있음을 증명하고있다 호스트 병원체 인터페이스에서 파이로리 CAG-T4SS의 pilus의 생합성. , H. 단독 배지에서 배양하면 파일로리 3 필리 / 셀의 평균을 형성한다. 때 H. 파일로리 철에서 성장 고갈 세균 성장 (도 1)은 하위 억제이다 (합성 킬레이트 피리 딜 사용) 조건, 박테리아 생성 수많은 CAG-T4SS 필리 (~ 7 필리 / 셀) 때 인간 위암 세포와 공 배양 (그림 2). 영양소 철 외인성 소스가 존재하면 반대로, CAG-T4SS의 필리의 형성이 억제된다 (FE 샘플 1 개 미만 pilus / 셀, 1 미만 pilus / FE +의 DIP 시료 중의 세포) (도 2). 호스트 병원체 인터페이스에서 필리의 정량화 밝혀 그 철 제한, H.의 조건 파이로리는 CAG-T4SS의 필리 (P에서 2 배 증가 <0.000 전시 1) 혼자 배지에서 성장 세포에 비해 11 % (P <0.05)에 의한 비율 piliated 세포 증가 (그림 3). 흥미롭게도, 호스트 IL-8 분비에 의해 측정 CAG-T4SS의 활성은, 철 제한 조건 하에서 107% 향상 및 배지 단독 (p = 0.03, 및 P에 비해 과량의 철 가용성의 조건 하에서 49 %를 억압 < SEM 데이터를 지원 0.001) 결과. 그러나 필리 치수 (그림 4) 철 가용성의 모든 조건 사이에서 일관성을 유지. 또한, 철 가용성 케이지 돌연변이의 표면에 필리의 생합성을 변경하지 않으며, 사실 증명 구조임을 가설을지지하는, 숙주 세포에서 IL-8 반응을 유도하기 위해이 동질 유도체의 능력을 변경 않는다 CAG-T4SS 아닌 추가 관련이없는 표면 기능입니다.

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그림 1 :. 철 가용성의 다양한 조건에서 결정 세균 생존 H. 파이로리는 (중간 형) 만 수정 브루셀라 배지에서 배양, 또는 100 μM 50ml을 (FE), 200 μM의 피리 딜 (DIP), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM 50ml을 (FE + 딥)로 보충했다. 박테리아는 5 % CO 2 존재하에 37 ° C에서 2 일 동안 배양하기 전에 세균 매체 상에 순차적으로 희석하고, 플레이 팅 하였다. 콜로니를 카운트 함과 콜로니 형성 단위는 / ㎖ (CFU / ml)을 계산 하였다. 바는 3 개의 독립적 인 실험의 의미 나타냅니다 +/- SEM을. DIP, FE, 또는 FE + 딥 치료는 크게 박테리아의 생존 능력을 변경하지 않습니다.

그림 2
그림 2 : 높은 Resolution 주사 전자 현미경 분석 H. pylori의 CAG-T4SS의 필리. 박테리아가 혼자 매체)에서 성장했다, B) 매체 100 μM 50ml을 보충, C) 매체는 200 μM의 피리 딜 보충 200 μM의 피리 딜, 또는 D) 매체로 보충 플러스 250 μM 50ml을 이전 AGS 인체와 공동으로 문화 위 세포. 화살표는 호스트 병원체 인터페이스에 형성 CAG-T4SS의 필리을 나타냅니다. 샘플 CAG-T4SS의 생합성을 평가 고해상도 주사 전자 현미경으로 분석 하였다. 초과 가능한 영양소 철의 조건이 CAG-T4SS의 pilus 형성을 억제하면서 낮은 철 가용성의 조건, CAG-T4SS의 pilus 형성의 유병률을 증가시킨다.

그림 3
그림 3 : 다양한 배양 필리 / 셀 및 퍼센트의 정량화 piliated 세포철 가용성의 조건. 박테리아는 혼자 (중간 형) 수정 브루셀라 배지에서 성장했다, 또는 매체는 100 μM 50ml을 (FE), 200 μM의 피리 딜 (DIP), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM 50ml을 (FE +의 DIP) 공동 - 이전에 보충 인간의 위 상피 세포와 문화. 시료는 고해상도 주 사형 전자 현미경 및 필리은 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다 열거 하였다. 세포 (* P <0.0001 혼자 매체에 비해 당 필리의) 산점도) 및 조건 (3) 별도의에서 파생 된 문화 당 60-112 세포에서 파생 된 piliated 세포 (* P <0.05 형 매체에 비해)의 B) 막대 그래프 묘사 퍼센트 생물학적 실험.

그림 4
그림 4 : 철 가용성의 다양한 조건에서 배양 된 세포에서 측정 Pilus 치수. BACTeria 형 (보통 형) 수정 브루셀라 배지에서 재배, 또는 매체는 100 μM 50ml을 (FE), 200 μM의 피리 딜 (DIP), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM 50ml을 (FE +의 DIP) 공동 - 이전에 보충되었다 인간의 위 상피 세포와 문화. 샘플은 고해상도 주사 전자 현미경으로 분석하고, 필리 치수 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다. A) Pilus 폭은 모든 조건 중 13.1 +/- 2.4 nm의 평균입니다. B) Pilus 길이는 모든 조건 중 75.8 +/- 16.0 nm의 평균입니다. pilus 크기에 유의 한 차이는 철 가용성의 다양한 조건에서 볼 수 없습니다.

보충 그림 1 : 고해상도 주사 전자 현미경은 H. 분석 철 가용성의 다양한 조건에서 균 케이지 돌연변이. 박테리아 50ml을 100 μM 보충) 배지에서 성장하고, B) 매체 D 200 μM의 피리 딜 (보충IP) 또는 C) 매체는 200 μM의 피리 딜 (DIP) 플러스 AGS 인체 위암 세포를 250 μM 50ml을 이전하는 공동 문화 보충. 샘플 CAG-T4SS의 생합성을 평가 고해상도 주사 전자 현미경으로 분석 하였다. 낮거나 높은 철의 조건은 그림 2에서 시각화 구조 CAG-T4SS의 필리 있다는 가설을 지원, 어떤 CAG 독립적 pilus의 생합성을 조절하지 않습니다.

보충 그림 2 : 철 가용성의 조건을 변화에서 자란 박테리아에 대응 호스트 IL-8 분비의 ELISA 분석. 야생형 (흰색 막대) 또는 케이지 돌연변이 (회색 막대) 박테리아는 혼자 (중간 형) 수정 브루셀라 배지에서 성장했다, 또는 매체는 100 μM 50ml을 (FE), 200 μM의 피리 딜 (DIP), 또는 200 μM의 피리 딜 보충 플러스 250 μM의 50ml을 (FE +의 DIP) 인간의 위 상피 세포와 이전하는 공동 문화. 증가 IL 철 제한 결과-8, CAG-T4SS 활동에 의존 호스트 응답. 바 3 별도의 생물학적 실험에서 파생 된, 평균 +/- SEM을 나타냅니다. (* p <0.05 단독 배지에서 성장 PMSS1 비교).

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Discussion

철 박테리아 병원균을 포함한 삶의 대부분의 형태에 필수적인 미량 영양소이다. 미생물 침입의 가능성을 제한하기위한 노력으로, 척추 호스트는 "영양 면역"(18)로 알려진 과정에서 영양소 철을 격리시키는. 이에 응답하여, 박테리아 병원균은 주변 환경을 감지하고 철 수집 시스템, 독소 및 독소 분비 기계 (19, 20)으로 병원성 기능 정교화 조절하는 전역 신호 분자로서 철을 사용하도록 진화했다.

H. 파이로리는 철, 아연, 및 마그네슘 (22)을 성장 및 헴 (heme), 헤모글로빈, 트랜스페린 등의 대체 철 공급원을 사용할 수 있으며, 락토페린 (23) 등의 미량 영양소를 필요로한다. H.을 파이로리는 가장 성공적인 병원균처럼, 호스트 (21)로부터 영양 철을 청소할 수 있도록 독성 요인의 넓은 레퍼토리를 진화했다. 한 독성 인자와 cagA, 이펙터 molecuCAG-T4SS의 제작은, 그것이 용이 영양소 철 공급원으로서 균체가 사용하는 15 및 복제를 촉진 할 수있는 선 단면에 편광 셀 측저 측으로부터 트랜스페린 경로 전환에 관여한다. 따라서, 낮은 철 가용성의 조건에서와 cagA의 분비를 촉진 할 수있는 직관적 인 진화 전략을 보인다.

H. 파일로리 CAG-T4SS 인해 그것이 유도하는 염증 숙주 세포 반응에 중요한 세균성 소기관이다. CAG-T4SS의 효과는 잘 공동 배양 감염의 동물 모델 모두에서 연구되어왔다. 그러나,이 독소 분비 시스템의 고분자 구조와 구성의 연구는 고해상도 이미징 프로토콜의 부족에 의해 방해되어왔다. CAG-T4SS을 공부하고 우리의 이전에 게시 된 보고서는 고해상도 전자 현미경으로 박테리아 세포에 네 CAG-T4SS의 필리 평균 (24)를 분석보고했다. 우리의 개선 된 방법을 제공강력한 이미징 기술은 박테리아 세포의 표면에서이 기능의 생성을 촉진하는 배양 기술을 이용하여 CAG-T4SS를 시각화한다. 고분해능 전계 방출 총 주사 전자 현미경과 함께 배양 기술의 이용이 촬상 프로토콜이 중요하다. CAG-T4SS 표면 기능의 두 배 농축은 면역 또는 면역 기술이 더 CAG-T4SS의 세포 내 위치 나 구성을 특징으로 면역 조직 화학 염색을 수행에 관심이있는 연구자에 대한 상당한 증가는 분석이다. CAG-T4SS의 고분해능 전자 현미경 촬상가 마스터되면, 그것은 CAG-T4SS의 pilus (25)에 대해 박테리아 단백질의 위치를 결정하기 위해, 예컨대 immunogold 표지와 같은 다른 응용 프로그램을 개발하는 것도 가능하다.

우리의 기술의 한 가지 제한은 조사자가 여전히 USI로 제한된다는 사실이다CAG-T4SS의 시각화를위한 공동 문화 시스템 겨. H.의 단일 필드에서 하위 집합 만 파이로리 정상 배양 조건은 이러한 구조를 형성 하에서 (50-70 퍼센트도 3 패널 B 참조). 그래서 필드에있는 수많은 세포가 아닌 piliated 될 것입니다. 이러한 하위 집단이 동일한 위치에 존재하는 이유는 불명하지만, 이들 세포는 항상 표면에 필리와 필리 / 셀 및 셀들의 퍼센트 정량화 모두 내 차지된다. CAG-T4SS 할수있는 숙주 박테리아 계면에서 관측되기 때문에, SEM 샘플 제제 내의 일차 및 이차 정착 단계는 단백질 구조와 진핵 및 원핵 세포의 막 모두의 보존에 중요하다. 고정 단계 이상 수행 설명, 또는 솔루션은 갓 준비하지 않으면하는 경우에는 오버 고정가 발생할 수 있습니다. 오버 고정이 발생하면 SEM에서 볼 수 있고 CAG-T4SS이에 의해 마스크 될 때, 샘플은 돌의 모양을해야합니다. troubl하려면e 촬영 덜 농축 고정 제 및 / 또는 고정 제의 존재 하에서 배양 시간이 적게 사용 SEM 샘플 제제를 반복한다.

공동 배양 시스템은 또한 호스트 인한 단백질의 대량의 오염 생화학 (질량 분광 분석 등) 특성화 성가신를 렌더링한다. 그러나,이 박테리아 분비 시스템의 생산을 조절하는 분자 적 메커니즘을 이해하는 것은 궁극적으로 숙주 세포의 부재하에 CAG-T4SS pilus의 형성을 트리거 새로운 기술로 이어질 수있다. 이것은 크게 생화학 적 분석에 대한 분리 및 정제 기술을 개선하는 것이다.

결론적으로, 우리는보고 그 H.의 생산 증가에 제한 철 가용성 결과의 조건 고해상도 주사 전자 현미경 기법에 의해 시각화 될 수 파이로리 CAG-T4SS. 또한 호스트 병원체 interfa에서이 표면 특징의 철 - 의존성 억제를보고CE. 이 분석은 최적화 된 철 - 조절 독소 분비물을 형성 호스트 미생물 상호 작용의 다양한 광범위하게 적용 가능하다 수많은 세균 병원균에 이용 될 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Modified brucella broth
Peptone from casein (10 g/L) Sigma 70172
Peptic digest of animal tissue (10 g/L) Sigma 70174
Yeast extract (2 g/L) Sigma 92144
Dextrose (1 g/L) Sigma D9434
Sodium chloride (5 g/L) Thermo Fisher S271-10
Cholesterol (250X) (4 ml/L) Life Technologies 12531018
Ferric chloride (100 or 250 uM) Sigma 157740-100G
Dipyridyl (200 uM) Sigma D216305-100G
Modified RPMI
RPMI+HEPES (1X) Life Technologies 22400-121
Fetal bovine serum (100 ml/L) Life Technologies 10438-026
Electron Microscopy Preparation
Paraformaldehyde (2.0% aqueous) Electron Microscopy Sciences 15713
Gluteraldehyde (2.5% aqueous) Electron Microscopy Sciences 16220
Sodium cacodylate (0.05 M) Electron Microscopy Sciences 12300
Osmium tetroxide (0.1% aqueous) Electron Microscopy Sciences 19150
Ethanol (absolute) Sigma E7023
Colloidal silver paint Electron Microscopy Sciences 12630
SEM sample stubs Electron Microscopy Sciences 75220
Coverslips Thermo Fisher 08-774-383
IL-8 Secretion Evaluation
Quantikine IL-8 ELISA kit R&D Systems D8000C

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References

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고해상도 전자 현미경<em&gt; 헬리코박터 파이로리</em철 가용성의 다양한 조건에서 생산&gt; CAG 유형 IV 분비 시스템 필리
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Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy,… More

Haley, K. P., Blanz, E. J., Gaddy, J. A. High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability. J. Vis. Exp. (93), e52122, doi:10.3791/52122 (2014).

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