Protocol
1. H. pylori Tillväxten under olika förhållanden från Iron Tillgänglighet och Co-kultur med Human Gastric epitelceller
- Välj H. pylori-stam PMSS1 för dessa studier eftersom det har en intakt cag patogenicitet ö och uttrycker ett fungerande typ IV sekretionssystemet. Även utnyttja en isogen bur mutanten (PMSSI Δ bur) som en negativ kontroll. Odla bakterier på TSA-plattor kompletterade med 5% fårblod (blodagarplattor) under 24 h vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2.
OBS: Förbered reagenser och montera material som beskrivs i Material och utrustning Table. Slutliga koncentrationer för varje reagens anges i parentes. - Skrapa bakterier från plattan med hjälp av en steril bomullspinne och ympa in modifierad brucellabuljong framställts från komponenter (se Material och utrustning tabell) och kompletteras med kolesterol. Inkubera kulturer över natten vid 37° C i rumsluft kompletterat med 5% CO2 med skakning vid 200 varv per minut (rpm).
OBSERVERA: Kolesterol användes i stället för fetalt bovint serum på grund av det faktum att serum är komplex; som innehåller ett stort antal källor för näringsämnen järn såsom heme som orsakar variation i resultaten. - På dagen för bakteriell odling, utsäde AGS humana gastriska epitel-celler (ATCC CRL-1739) på poly-D-lysin-behandlade täckglas i 12-brunnsplattor (cirka 1 x 10 5 celler per brunn).
- Följande dag, utspädd bakteriekulturer till en OD600 på 0,3 i enbart eller kompletterad med 100 ^ M FeCl 3, 200 ^ iM dipyridyl (en syntetisk järnkelator), eller 200 pM dipyridyl plus 250 pM FeCl 3 modifierad brucella-buljong. Inkubera dessa kulturer för 4 timmar vid 37 ° C i rumsluft kompletterat med 5% CO2 under skakning vid 200 rpm.
- Centrifugera bakterier vid 1000 xg för att samla in celler och ta bort supernatanter innan det blandas in en lika stor volym färskt modifierat brucella-buljong kompletterad med kolesterol. Mät OD600 av odlingen (OD600 = 1,0 = 5,5 x 10 8 celler / ml) och tillsätt bakterier till epitelcellerna i en infektionsmultiplicitet (MOI) av 20: 1. Utför seriespäd och plattbakterieceller på blodagarplattor att bedöma bakterie cellernas livskraft.
- Inkubera H. pylori och AGS mänskliga gastric epitelceller samkulturer för 4 timmar vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2 under statiska förhållanden innan du utför svepelektronmikroskop (SEM) provberedning.
2. SEM Provberedning för att visualisera H. pylori Cag-T4SS Pili
- Ta bort H. pylori och AGS samkulturer från inkubatorn och dekantera kultursupernatant (med undantag för IL-8-ELISA). Tvätta försiktigt tre gånger med 0,05 M natrium-kakodylat-buffert (pH 7,4). Fix prover för 2-4 timmar vid rumstemperatur i en lösning av 2,0% paraformaldehyd, 2,5% Glutaraldehyd och 0,05 M natrium-kakodylatbuffert. Efter primär fixering, tvätta prover tre gånger med 0,05 M natriumkakodylatbuffert.
- Utföra sekundär fixering med användning av 0,1% osmiumtetroxid i 0,05 M natrium-kakodylatbuffert i två sekventiella 10 min fixeringsstegen. Efter sekundär fixering, tvätta prover tre gånger med 0,05 M natriumkakodylatbuffert.
- Efter primär och sekundär fixering, torkar prover av sekventiell tvättning med ökande koncentrationer av etanol enligt tabell 1.
- Efter etanol uttorkning, utför tre sekventiella tvättar av flytande koldioxid. Sedan torra prover vid en kritisk punkt med hjälp av en kritisk punkt torkmaskin vid en temperatur av 31,1 ° C och tryck av 1073 PSI.
- Mount täckglas på aluminium SEM prov stubbar och måla med en tunn linje av kolloidalt silver i provkanten för att uppnå lämplig jordning och inte belasta under SEM avbildning.
- Coat prover med 5 nmguld-palladium med hjälp av en förstoftnings coat maskin för att öka urvalet sekundär elektron signal och kanteffekt.
3. Imaging Parametrar för högupplöst SEM Analyser
- Se prover med en Field-Emission Gun Scanning Electron Microscope (FEG-SEM).
- Bild i en högvakuum-läge på ett arbetsavstånd av 5-10 mm.
- Ställ in accelerationsspänning till 5 kV.
- Ställ strålpunkt till 2-2,5.
- Luta provet mellan 15-25 grader för att få en bättre bild av värdpatogen gränssnitt.
- Prioritera avbildning bakterier vidhäftande till kanterna av epitelcellerna för hög förstoring visning, eftersom dessa områden av värd-patogen interaktion anrikas för pili-bildande bakterier.
4. Statistiska analyser för att utvärdera Pili kvantifieringar
- Analysera H. pylori Cag-T4SS pili med ImageJ programvara för att kvantifiera antalet pili / cell samt procent av celler uppvisar piliförsedda phenotype per instruktionerna nedan.
- Öppna micrograph filer i ImageJ programvara. Identifiera pili som strukturer som bildas mellan bakteriecellen och värdcell, med enhetlig bredd (10-13 nm) och längd (60-150 nm).
OBS: pilus struktur är närvarande på WT bakteriestammar, men frånvarande på isogena stammar såsom Δ bur mutanta stammar, vilka härbärgerar en inaktivering i den gen som kodar för den större ATPas som driver typ IV sekre pilus sammansättning. - Kalibrera mätverktyg genom att dra en linje med den raka linjen verktyget och sedan klicka på fliken "Analyze". Välj "Set Scale" i rullgardinsmenyn och ange förstoringsfältet värdet i boxen märkt "kända Distans" och ställ in längdenhet till lämplig inställning (nm). Klicka på "OK".
- Mät Cag-T4SS pili med den raka linjen för att rita över längden eller bredden på pilus och tryck "Ctrl-M" för att mäta varje pilus. Observera en dialogruta med de uppmätta värdena. Anteckna dessa värden eller kopiera och klistra in i ett kalkylprogram.
- Använd längd och bredd parametrar som tidigare fastställts 24, bortse funktioner som inte passar profilen för Cag-T4SS. Sedan kvantifiera antalet pili bygger på värden som ligger inom de 10-13 nm bredd och 60-150 nm längd cutoffs.
- Analysera kvantifieringen av pili statist genom två-tailed Students t-test med användning av GraphPad Prism mjukvara.
5. Valfritt: Utvärdering av IL-8 Sekre att korrelera med Pilus Production
- Genom att använda överstående från steg 2.1, utföra en IL-8-ELISA enligt tillverkarens instruktioner med kitet (se Material och utrustning tabell).
- Analysera IL-8 som utsöndras av värdceller och beräkna procent av IL-8-induktion med avseende på WT PMSS1 odlade i enbart medium. Utför statistisk analys med hjälp av två-tailed Students t-test med hjälp av GraphPad Prism såftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna rapport har vi visat att villkoren för varierande järn tillgänglighet har kapacitet att modulera H. pylori Cag-T4SS pilus biogenes vid värd patogen gränssnittet. När de odlas i enbart medium, H. pylori bildar ett genomsnitt av tre pili / cell. När H. pylori odlas i järn bryter förhållanden (med hjälp av syntetiska chelator dipyridyl) som är sub-hämmande för bakterietillväxt (Figur 1), bakterierna producerar många Cag-T4SS pili (~ 7 pili / cell) vid samtidig odlas med humana gastric celler (Figur 2). Men om en exogen källa till näringsämnen järn är närvarande, är bildandet av Cag-T4SS pili tryckt (mindre än 1 pilus / cell i FE prov, mindre än 1 pilus / cell i FE + DIP prov) (Figur 2). Kvantifiering av pili vid värd-patogen gränssnitt visar att under förhållanden av järn restriktion, H. pylori uppvisar en 2-faldig ökning av Cag-T4SS pili (p <0,000 1) och den procentuella piliförsedda celler ökar med 11% (p <0,05) jämfört med celler odlade i enbart medium (figur 3). Intressant nog är aktiviteten av Cag-T4SS, uppmätt genom värd IL-8-utsöndring, förbättrad 107% under betingelser av järn restriktion och undertryckt 49% under betingelser med överskott av järn tillgänglighet jämfört med enbart medium (p = 0,03 och p < 0,001, respektive) ett resultat som stödjer SEM uppgifter. Men pili dimensioner förblir konsekvent bland alla villkor för järn tillgänglighet (Figur 4). Vidare har järn tillgänglighet inte ändra biogenes av pili på ytan av en bur mutant, inte heller ändra denna isogen derivat förmåga att inducera en IL-8 svar från värdceller, stöder hypotesen att de strukturer som demonstreras är, faktiskt, Cag-T4SS och inte ytterligare en orelaterad ytsärdrag.
n "src =" / files / ftp_upload / 52122 / 52122fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1:. Bakteriell lönsamheten bestäms i olika förhållanden av järn tillgänglighet H. pylori odlades i modifierad brucellabuljong enbart (enbart medium), eller kompletteras med 100 pM FeCl3 (FE), 200 ^ M dipyridyl (DIP), eller 200 iM dipyridyl plus 250 iM FeCl3 (FE + DIP). Bakterier späddes ut seriellt och ströks ut på bakteriologiska medium före inkubering under 2 dagar vid 37 ° C i närvaro av 5% CO2. Kolonier räknades och kolonibildande enheter / ml (CFU / ml) beräknades. Staplarna anger medelvärdet av tre oberoende experiment +/- SEM. Behandling med DIP, FE, eller FE + DIP förändrar inte signifikant bakteriell livskraft.
Figur 2: Hög resolution svepelektronmikroskopi analyser av H. pylori Cag-T4SS pili. Bakterier odlades i A) enbart medium, B) medium kompletterat med 100 ^ M FeCl 3, C) medium kompletterat med 200 | iM dipyridyl, eller D) medium kompletterat med 200 | iM dipyridyl plus 250 pM FeCl 3 före samodling med AGS human gastriska celler. Pilar indikerar Cag-T4SS pili som bildas vid värd-patogen gränssnitt. Prover analyserades genom högupplösande svepelektronmikroskop för att utvärdera Cag-T4SS biogenes. Villkor för låg järn tillgänglighet öka förekomsten av Cag-T4SS pilus bildning, medan villkoren för överskott tillgängliga näringsämnen järn trycka Cag-T4SS pilus bildning.
Figur 3: Kvantifiering av pili / cell och procent piliförsedda celler odlade i olikaförhållanden av järn tillgänglighet. Bakterier odlades i modifierat brucellabuljong enbart (enbart medium), eller medium kompletterat med 100 ^ M FeCl3 (FE), 200 | iM dipyridyl (DIP), eller 200 pM dipyridyl plus 250 pM FeCl 3 (FE + DIP) före co- kultur med mänskliga gastric epitelceller. Prover analyserades genom högupplösande svepelektronmikroskopi och pili räknades med ImageJ programvara. A) Scatterplot av pili per cell (* p <0,0001 jämfört med enbart medium) och B) Stapeldiagram som visar procent av piliförsedda celler (* p <0,05 jämfört med enbart medium) härledda 60-112 celler per odlingsbetingelse som härrör från tre separata biologiska experiment.
Figur 4: Pilus mått mätt från celler som odlats under olika förhållanden av järn tillgänglighet. BactEria odlades i modifierat brucellabuljong enbart (enbart medium), eller medium kompletterat med 100 ^ M FeCl3 (FE), 200 | iM dipyridyl (DIP), eller 200 pM dipyridyl plus 250 pM FeCl 3 (FE + DIP) före co- kultur med mänskliga gastric epitelceller. Prover analyserades genom högupplösande svepelektronmikroskopi och pili dimensioner mättes med ImageJ programvara. A) Pilus bredd är ett genomsnitt på 13,1 +/- 2,4 nm bland alla förhållanden. B) Pilus längd är ett genomsnitt av 75,8 +/- 16,0 nm bland alla förhållanden. Ingen signifikant skillnad i pilus dimensioner ses i de olika tillstånd av järn tillgänglighet.
Kompletterande Figur 1: Högupplöst svepelektronmikroskop analyser av H. pylori CAGE mutant i olika tillstånd av järn tillgänglighet. Bakterier odlades i A) medium kompletterat med 100 ^ M FeCl 3, B) medium kompletterat med 200 | iM dipyridyl (DIP) eller C) medium kompletterat med 200 | iM dipyridyl (DIP) plus 250 pM FeCl 3 före samodling med AGS humana gastriska celler. Prover analyserades genom högupplösande svepelektronmikroskop för att utvärdera Cag-T4SS biogenes. Villkor för låg eller hög järn inte modulera någon Cag oberoende pilus biogenesis, stöder hypotesen att de strukturer som visualiseras i figur 2 är Cag-T4SS pili.
Kompletterande Figur 2: ELISA-analys av värd IL-8-utsöndring som svar på bakterier som odlas i varierande förhållanden av järn tillgänglighet. Vildtyp (vita staplar) eller bur-mutant (grå staplar) Bakterierna odlades i modifierat brucellabuljong enbart (enbart medium), eller medium kompletterat med 100 ^ M FeCl3 (FE), 200 | iM dipyridyl (DIP), eller 200 pM dipyridyl plus 250 pM FeCl 3 (FE + DIP) före samodling med humana gastriska epitelceller. Järnrestriktioner leder ökad IL-8, Ett värdsvar som är beroende av Cag-T4SS aktivitet. Staplarna anger medelvärdet +/- SEM, härlett från 3 separata biologiska experiment. (* P <0,05 jämfört med PMSS1 odlades i enbart medium).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Järn är ett viktigt mikronäringsämne för de flesta former av liv, även bakteriella patogener. I ett försök att begränsa lönsamheten för invaderande mikroorganismer, vertebratvärdar avskilja näringsämnen järn i en process som kallas "närings immunitet" 18. Som svar på detta har bakteriella patogener utvecklats för att använda järn som en global signalmolekyl för att känna sin omgivning och reglerar utarbetandet av virulens funktioner såsom järn anskaffningssystem, toxiner och toxinsekre maskiner 19,20.
H. pylori kräver mikronäringsämnen, såsom järn, zink och magnesium för att växa 22 och kan använda alternativa järnkällor, såsom heme, hemoglobin, transferrin och laktoferrin 23. H. pylori, som de flesta framgångsrika patogener, har utvecklats en bred repertoar av virulensfaktorer att hjälpa den rensar näringsämnen järn från värden 21. En virulensfaktor, CagA, effektorn molecule på CAG-T4SS, är inblandad i omdirigering transferrin från den basolaterala sidan av polariserade celler till den apikala ytan där den lätt kan användas av bakteriecellerna som ett näringsämne järnkälla och främja replikation 15. Det verkar således ett intuitivt evolutionär strategi för att främja utsöndring av CagA i förhållanden med låg järn tillgänglighet.
H. pylori Cag-T4SS är en viktig bakterieorganell, på grund av de proinflammatoriska värdcellssvar det framkallar. Effekterna av CAG-T4SS har väl studerat i både co-kulturer och djurmodeller av infektion. Dock har studier av makromolekylära strukturen och sammansättningen av detta toxin sekretionssystemet hindrats av bristen på högupplösta avbildningsprotokoll. Våra tidigare publicerade rapporter studerar Cag-T4SS har rapporterat ett genomsnitt av fyra Cag-T4SS pili per bakteriecell med högupplösande elektronmikroskopi analyser 24. Vår förbättrade metod tillhandahålleren robust bildteknik för att visualisera Cag-T4SS genom att använda en odlingsteknik som främjar produktionen av denna funktion på ytan av bakteriecellen. Utnyttjande av odlingstekniker i kombination med hög upplösning fältemissions pistol svepelektronmikroskop är avgörande för denna bildprotokoll. Två-faldig anrikning av CAG-T4SS ytan funktionen är en betydande ökning för utredarna är intresserade av att utföra immunhistokemiska analyser såsom immunofluorescens eller immunfällningstekniker för att ytterligare karakterisera subcellulära plats eller sammansättning Cag-T4SS. När högupplösande elektronmikroskopi avbildning av Cag-T4SS har bemästrat, är det också möjligt att utveckla andra applikationer, såsom immunogold-märkning, för att fastställa platsen för bakteriella proteiner med avseende på Cag-T4SS pilus 25.
En begränsning med vår teknik är det faktum att utredaren fortfarande är begränsad till USIng en samodlingssystem för visualisering av CAG-T4SS. I ett enda fält, endast en delmängd av H. pylori under normala odlingsbetingelser bildar dessa strukturer (cirka 50-70 procent, se figur 3 panel B). Så många celler i ett område kommer att vara icke-piliförsedda. Det är okänt varför dessa delpopulationer finns på samma plats, men dessa celler alltid redovisas inom både kvantifieringar av pili / cell och procentandelen celler med pili på ytan. Eftersom CAG-T4SS endast observeras vid värd-bakteriell gränssnitt, de primära och sekundära fixeringssteg inom SEM provberedning är avgörande för bevarandet av både proteinstrukturer och membranen i eukaryota och prokaryota celler. Emellertid kan över fixering uppstå om fixeringssteg utförs längre än beskrivs, eller om lösningarna inte är nyberedda. Om över fixering inträffar, kommer proven att ha en stenig utseende när den visas med SEM och Cag-T4SS kommer att maskeras av detta. Att troubleshoot, upprepa SEM provberedning med hjälp av mindre koncentrerade fixeringsmedel och / eller kortare tid odlades i närvaro av fixativ.
Den samodlingssystemet gör även biokemisk karakterisering (t.ex. masspektrometri analyser) besvärligt på grund av kontaminering av stora mängder värdproteiner. Men att förstå de molekylära mekanismer som reglerar produktionen av denna bakteriesekretionssystemet skulle kunna leda till nya tekniker som kommer att utlösa Cag-T4SS pilus bildning i frånvaro av värdceller. Detta skulle i hög grad förbättra de isolerings- och reningstekniker för biokemiska analyser.
Sammanfattningsvis, vi rapporterar att villkoren för begränsad järn tillgänglighet leder till ökad produktion av H. pylori Cag-T4SS som kan visualiseras genom högupplösande svepelektronmikroskopiska tekniker. Vi rapporterar också järnberoende förtrycket av denna yta funktionen på värdpatogen interface. Denna analys kan optimeras och utnyttjas för många bakteriella patogener som bildar järnreglerade toxin-sekret och är brett tillämpbar på en mängd olika värd mikrobinteraktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified brucella broth | |||
| Peptone from casein (10 g/L) | Sigma | 70172 | |
| Peptic digest of animal tissue (10 g/L) | Sigma | 70174 | |
| Yeast extract (2 g/L) | Sigma | 92144 | |
| Dextrose (1 g/L) | Sigma | D9434 | |
| Sodium chloride (5 g/L) | Thermo Fisher | S271-10 | |
| Cholesterol (250X) (4 ml/L) | Life Technologies | 12531018 | |
| Ferric chloride (100 or 250 uM) | Sigma | 157740-100G | |
| Dipyridyl (200 uM) | Sigma | D216305-100G | |
| Modified RPMI | |||
| RPMI+HEPES (1X) | Life Technologies | 22400-121 | |
| Fetal bovine serum (100 ml/L) | Life Technologies | 10438-026 | |
| Electron Microscopy Preparation | |||
| Paraformaldehyde (2.0% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Gluteraldehyde (2.5% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 16220 | |
| Sodium cacodylate (0.05 M) | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Osmium tetroxide (0.1% aqueous) | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| Ethanol (absolute) | Sigma | E7023 | |
| Colloidal silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12630 | |
| SEM sample stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Coverslips | Thermo Fisher | 08-774-383 | |
| IL-8 Secretion Evaluation | |||
| Quantikine IL-8 ELISA kit | R&D Systems | D8000C |
References
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).
- Sycuro, L. K., et al. Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization. Cell. 141 (5), 822-833 (2010).
- Kodaman, N., et al. Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).
- Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis. FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).
- Fischer, W. Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus. FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).
- Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion. Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).
- Bourzac, K., Guillemin, K. Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion. Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).
- Bronte-Tinkew, D. M., et al. Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo. Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).
- Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells. Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17 (2012).
- Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system. Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).
- Cover, T. L., Peek, R. M. Jr Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer. Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).
- Queiroz, D. M., et al. Increased gastric IL-1β concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children. PLoS One. 8 (2), 57420 (2013).
- Harris, P. R., et al. Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency. J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).
- Noto, J. M., et al. Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans. J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).
- Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M. Jr, Amieva, M. R. Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface. PLoS Pathog. 7 (5), (2011).
- Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis. J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).
- Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes. Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).
- Cassat, J. E., Skaar, E. P.
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).
- Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression. J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).
- Mobley, H. L. Helicobacter pylori factors associated with disease development. Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined. J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media. Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).
- Shaffer, C. L., et al. Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface. PLoS Pathog. 7 (9), (2011).
- Barrozo, R. M., et al. Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori. PLoS Pathog. 9 (2), (2013).
