Protocol
Merk: Alle forsyninger er oppført i tabell 1.
1. Lagring av kylling embryo
- Ruge kylling egg av belastningen Gallus gallus horisontalt ved 37 o C med ca 40% fuktighet og slå egg en gang eller to ganger daglig. Turning egg er viktig for å hindre at embryo fester seg eggeskallet.
- Ikke for å slå egget i 24 timer før du sette opp kulturen som ellers embryoet vil bli plassert ventral til plommemasse og vil bli skadet på åpne egg i trinn 3. I tillegg holde eggene ved 4 o C grader for ikke mer enn én uke før inkubasjon å "stoppe opp" utvikling, men dette er ikke ideelt.
2. Staging kyllingembryoer
- Iscenesette kylling embryoer ved hjelp av Hamburger og Hamilton 12 rekkefølgetabellen. Den ideelle scenen for å sette opp ex-ovo dyrking er HH scenen 19-20 (rundt 3 dagers inkubasjon) because dette er kort tid etter at hodet svinger på 53 HPF.
Merk: HH scenen 19-20 er preget av følgende morfologiske trekk: somites er utvidet til flertallet av halen, men helt på slutten av halen forblir unsegmented, halen knopp er bøyd, er det allantois små og har begrenset blodkar, leg-knopper er større enn vinge knopper og øynene er upigmentert eller har en gråaktig fargetone.
3. Ta av Embryo fra Shell
- Før du fjerner embryo fra skallet, spray skallet med 70% etanol og la den tørke. Ikke slå egget raskt da dette vil skade fosteret.
- Være forsiktig med å endre retningen på egg, nøye knekke egget på nedsiden (dvs. den siden som var ventral under inkubasjon) og slipp embryoet inn i en steril veie båt (88 x 88 x 23 mm). Tørk veie båter med 70% etanol. Inspisere embryo for å sikre at plommesekken ikke er skadet. Hvis eggeplomme hsom brutt, forkaste embryo, som det ikke vil overleve.
- Observere embryo for å sikre at det er levedyktig; hjertet slår, vises blodkar normal, og ingen åpenbare abnormiteter er til stede. Pass på at kantene på veie båten er tørr.
- Ved hjelp av en pipette, slippe 40 ul penicillin / streptomycin (5000 enheter penicillin, 5 mg streptomycin per ml) på toppen av albumin for å unngå smitte.
4. Klar Fuktighet Chamber
- Plassere en liten stabel av kim-kluter og / eller en absorberende pute laget av bomull i bunnen av en steril plastbeholder (12 x 12 x 6 cm) tørkes med 70% etanol.
- Legg sterilt, destillert vann for å fukte Kim-våtservietter og / eller bomull (ca. 150 ml vann).
5. Montering av Ex Ovo Culture
- Plasser veie båten som inneholder embryoet på toppen av den fuktige polstring. Deretter sted halvparten av en firkantet steril petriskål (9,5 x 9,5 cm) på toppen av tHan veie båten for å danne et løst lokk.
- Dekk plastbeholder med lokk. Trykke ned to hjørner av lokket, noe som sikrer en delvis forsegling som likevel gir god luftsirkulasjon inne i kammeret.
- Plassere oppsettet forsiktig inn i 37 o C inkubator til ønsket scene.
- Plasser beholdere med vann i kuvøse for å kontrollere luftfuktigheten, hvis en kontrollert luftfuktighet inkubator er utilgjengelig. Sterilisere alt vann i fuktighet kamre og i inkubatoren og fylle etter behov i løpet av inkubasjonsperioden. 40% fuktighet er ideelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne ex ovo metoden gjør for observasjon av embryoer fra tidlige stadier av utviklingen (HH 19/20) til sene stadier av utvikling (HH 40-41) (figur 1A og 1B). Sette opp kulturen ved HH 19-20 øker overlevelses av embryoene i kulturen. Før hodet dreie (før 53 HPF) overlevelsesevne er svært lav i kultur, og etter trinn 21, har en tendens til å holde seg mer embryo til skallet ved fjerning, så færre intakte embryoer blir oppnådd. Generelt er overlevelses av embryoet i ex ovo kultur høyt opp til HH 35-36 (90-100%), men den gjør det fall i de mer avanserte stadier av utvikling (ca. 40% overlever til HH 40-41). I tillegg, selv om det har vist seg at utviklingen virker normalt på disse sene stadier og fordelingen av skjelettet er upåvirket 4,15, har vi observert at bena er bøyd i disse sene stadier tyder på at graden eller tidspunktet for ossifikasjon kan påvirkes. Dette erikke overraskende med tanke på behovet for kalsium fra skallet for ossification. En detaljert sammenligning av utviklingen av embryoet sammenlignet med kontroller er i gang, og er utenfor rammen av denne metoder papir.
Å skaffe seg tilgang til fosteret gjennom utvikling er viktig av to hovedgrunner. Først, forskere er i stand til å se utvikling på daglig basis uten å måtte bryte seglet og forsegle et vindu. For eksempel, enkeltpersoner er i stand til å observere lem og øye utvikling på flere stadier (figur 1C og 1D). Dernest ex ovo dyrking muliggjør større (ubegrenset) tilgang til embryo, og dermed muliggjør enklere manipulasjoner eller operasjoner.
Embryonale manipulasjoner oftest må utføres ved hjelp av et stereomikroskop. Bruke ex ovo dyrking metoden beskrevet her i motsetning til styrofoam / plastfolie metode 6,7,8 embryoet set-up er lett plasseres under mikroskopet, er mindre dyp og vil ikke velte. Dette gjør det mulig for forskere å posisjonere fuktighetskammeret nøyaktig etter behov, og for å rotere den for å optimalisere tilgang til embryoet, siden det ikke er noen hindringer (egg Shell) gir dekning embryoet og da kammeret er meget stabil. Samlet støtte embryoet mottar fra veie båten kan lett trykk for å bli brukt til fosteret under manipulasjon uten set-up velter.
Flere utviklingsbiologiske metoder kan bli gjennomført på embryoene i denne kulturen system. Disse inkluderer detaljerte observasjoner av organ (f.eks, øye, hjerne etc) eller vev utvikling (f.eks blodkar vekst) eller anvendelsen av teratogene agenter. Manipulasjoner omfatter poding av vev inn på chorioallantoic membraner for å studere effekten av å kombinere forskjellige vevslag eller studere tumorvekst og metastase 14. En annen populær manipulasjon utført under utvikling er bead eller barriere implantasjon. Perle implantasjon tillater en forsker å suge en hemmer eller faktor på perle og deretter implantere perle lokalt for å hemme eller indusere gener lokalt i området av interesse. Dette gjøres ofte ved hjelp Affigel eller heparin perler (Figur 2A). For eksempel kan benmorfogene proteiner (BMPs) være lokalt inhiberes under induksjon av neural crest avledet ben 4, 15, eller i den tredje lem 13 knopp. Etter en perle er implantert, kan fosteret bli returnert til inkubatoren, og det vil fortsette å utvikle. Dette gjør det mulig for forskere å vise de nedstrøms virkningene av hemming av et bestemt gen (i dette tilfellet BMP), slik som inhiberingen av skleral ossicle dannelse i stivnet ringen (figur 2B og 2C) 15. På samme måte kan barrierer lett settes inn mellom vev lag for å studere vev til vev signalering og mikroinjeksjon av fargestoffer kan også lett bli utført. 
Figur 1. Vise embryo ex ovo. (A) HH stadium 20 chick embryo etter fjerning fra skallet, pilen peker på fosteret med vaskulariserte embryonale membraner. (B) En HH stadium 40 embryo i en åpen fuktighet kammer. (C) HH stadium 35 embryo som viser tidlige lem knopper (pil). (D) Stage HH 41 embryo som viser senere utvikling av strukturer som øyet (pil). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Eksempel på Noggin gjennomvåt perle Implantasjon Experiment 4. (A) Embryo HH trinn 35 eksponert gjennom et lite hull revet i den overliggende membraner for å få tilgang til den underliggende øye for vulsten implantasjon. Høy forstørrelse av Affigel perle ved siden av en konjunktival papilla er vist i innfelt. Skala bar i C er 75 mikrometer. (B) alkalisk fosfatase farget høyre øye etter Noggin perle implantasjon (pil) som viser gapet i ringen av ossicles, HH 38 (C) AP farget venstre øye som viser ingen avbrudd i ringen av ossicles (kontroll ), HH 38. Detaljer om dette eksperimentet er gitt i Duench og Franz-Odendaal fire. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ex ovo dyrking og vindu både har fordeler og utfordringer. Her sammenligner vi fordeler og utfordringer Styrofoam cup ex ovo metoden og vindus metode til vår optimalisert ex ovo metode vist her. Vår metode gjør det mulig manipulasjon og enkel observasjon av kylling embryo ved sene stadier av utviklingen og våre forbedringer til den tradisjonelle ex ovo metode 1, 2, 3 gjør det i tillegg svært enkel å bruke i undergraduate undervisning laboratorium klasser.
Selv om mange forskere fore den vindus metode for å studere kylling utvikling fordi det er enkelt å utføre og har utmerket overlevelsesevne til sene stadier av utvikling (HH 41-42), har det begrensninger. Den største av dem er det begrenset evne til å se hele embryo etter HH scenen 30. Når trinn HH 30, må vinduet i eggeskallet til å være svært stor for å se den voksende, flytting embryo. Denne store vinduet er difficult å forsegle helt (som fører til problemer med sterilitet og overlevelsesevne), og få god belysning inne i egget kan være utfordrende. I tillegg avansert stadium embryoer er store og vanskelig tilgjengelig (eller manipulere) gjennom vinduet.
Ex ovo metoden beskrevet her gir full uhemmet tilgang til embryoet. Når veie båten er plassert i fuktighetskammer, er hele oppsettet meget stabil. Hele fuktighetskammer kan plasseres under et disseksjonsmikroskop og høy forstørrelse kan anvendes til å observere hele embryoet. Til sammenligning har den Styrofoam cup metoden en fuktighet kammer som er høy (cup høyde), og dette gjør det svært vanskelig å plassere under mikroskopet mål. Koppen design er også langt mindre stabile enn den flate veier båt og disse koppene kan lett bli slått over ende. Våre forbedringer til ex ovo metode gjør denne metoden grei å bruke i et klasserom eller lab innstilling og gjør det mulig for student å ha full tilgang til embryoer fra scenen HH 19 gjennom til HH 40; iscenesetter når store organogenesis skjer. Den største ulempen med vår ex ovo metode er sterilitet. For å hindre infeksjon, omfatter vår metode tilsetning av antibiotika. En annen dose av antibiotikum kan gis til embryoet på senere stadier. Antibiotika administreres under kultur oppsett heller ikke ut til å påvirke utviklingen av embryoet. Sterilisering beholdere med 70% etanol før bruk kan dramatisk øke overlevelsesevne.
Totalt sett er ex ovo metode for visning og manipulering av embryoer uten begrensninger på tilgang eller utviklingstrinn. Tidligere forskning har vist at dyrking embryoene ex ovo ikke negativt påvirke mønstring 4,15. For eksempel har vi ikke se noen endringer i mønsteret eller induksjon av skjelettet til tross for fraværet av eggeskallet. Vår forbedret metode løser flere challenges som finnes med dagens tradisjonelle ex ovo metode 1,2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser i forhold til informasjonen som presenteres i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Paul Poirier, Media Producer, ved Mount Saint Vincent Universitetet for sitt arbeid i filming og redigering av videodelen av dette manuskriptet. Vi erkjenner Natural Science and Engineering Research Council of Canada for finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4458 | Make small aliquots to avoid freeze/thaw events |
| Square Petri Dish | 9.5 cm x 9.5 cm | ||
| Weigh Boat | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23 mm |
| Ziplock container | Ziplock | N/A | 12 cm x 12 cm x 6 cm |
References
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Gennaro, L. D., Packard, D. S., Stach, R. W., Wagner, B. J. Growth and differentiation of chicken embryos in simplified shell-less cultures under ordinary conditions of incubation. Growth. 44, 343-354 (1980).
- Tufan, C. A., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology. Neuroanat. 3, 8-11 (2004).
- Duench, K., Franz-Odendaal, T. A. BMP and Hedgehog signaling during the development of scleral ossicles. Dev. Biol. 365 (1), 251-258 (2012).
- Datar, S., Bhonde, R. R. Shell-less Chick Embryo Culture as an Alternative in vitro Model to Investigate Glucose-Induced Malformation in Mammalian Embryos. Rev Diabet Stud. 2 (4), 221-227 (2005).
- Chick embryos in shell-less culture. Tested studies for laboratory teaching. Fisher, C. J. 5th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE), , (1983).
- Dunn, B. E. Technique for shell-less culture of the 72-hour avian embryo). Poultry Science. 53, 409-412 (1974).
- Yalcin, H., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
- Silver, P. H. S. Special problems of experimenting in ovo on the early chick embryo, and a solution. J Embryol Exp Morph. 8 (4), 369-375 (1960).
- Spurlin, J., Lwigale, P. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Dev. Dyn. 242 (2), 148-154 (2012).
- Dorrell, M. I., et al. Ex ovo model for directly visualizing chicken embryo development. American Biology Teacher. 74 (9), (2012).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88, 49-92 (1951).
- Drossopoulou, G., et al. A model for anteroposterior patterning of the vertebrate limb based on sequential long-and short-range Shh signaling and Bmp signaling. Development. , 127-1337 (2000).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Franz-Odendaal, T. Towards understanding the development of scleral ossicles in chicken, Gallus gallus. Dev. Dyn. 237, 3240-3251 (2008).
